謝秋玲 譚楚敏 王亞玉 陳子鑫 熊盛

（1.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510632；2.基因工程藥物國(guó)家工程研究中心，廣東 廣州 510632）

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（Chinese Hamster Ovary，CHO）是用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的最主要的細(xì)胞系，也是目前大多數(shù)抗體藥物生產(chǎn)的理想宿主［1-2］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，市場(chǎng)上約70%的重組蛋白藥物由CHO細(xì)胞表達(dá)。CHO細(xì)胞包含多種譜系，包括CHO-DXB11、CHO-K1、CHO-DG44和CHO-S等［3-4］。其中，CHODG44是雙等位基因二氫葉酸還原酶（DHFR）敲除的一種CHO細(xì)胞類型，是用于治療性抗體生產(chǎn)的穩(wěn)定細(xì)胞系。

作為宿主細(xì)胞，CHO細(xì)胞是影響重組蛋白表達(dá)量高低的關(guān)鍵因素之一，然而CHO細(xì)胞在遺傳和蛋白質(zhì)組學(xué)方面的研究數(shù)據(jù)都較少。2011年，Xu等［5］對(duì)CHO-K1細(xì)胞進(jìn)行了全基因組測(cè)序，采用從頭基因測(cè)序和基于同源性分析的方法，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)到的24383個(gè)預(yù)測(cè)基因中有許多在人類、小鼠、大鼠中具有同源性，且99%參與糖基化的人類基因的同源物都存在于CHO-K1中。此外，Becker等［6］使用焦磷酸測(cè)序技術(shù)從不同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的多個(gè)CHO細(xì)胞系中鑒定了29000多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，結(jié)果顯示，超過(guò)70%的CHO轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與小鼠相似，也與大鼠轉(zhuǎn)錄組密切相關(guān)。迄今為止進(jìn)行的CHO蛋白質(zhì)組學(xué)研究通常集中在CHO細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組相對(duì)于重組蛋白表達(dá)水平的變化［7］。Zhu等［8］使用iTRAQ聯(lián)合UPLC-MS/MS技術(shù)對(duì)宿主和轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的上清液進(jìn)行定量分析。但也有研究比較了重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（rCHO）之間的蛋白變化，如Pascoe等［9］通過(guò)比較在相同的補(bǔ)料分批培養(yǎng)條件下具有不同乳酸表達(dá)譜的兩種rCHO細(xì)胞來(lái)分析蛋白質(zhì)的變化。蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于rCHO工程將有助于理解和改進(jìn)重組蛋白生產(chǎn)過(guò)程，以幫助加強(qiáng)治療性蛋白質(zhì)的生產(chǎn)和開(kāi)發(fā)。

筆者所在實(shí)驗(yàn)室有兩株來(lái)源不同的DHFR缺陷性CHO-DG44細(xì)胞，CHO-DG44（A）和CHO-DG44（B）細(xì)胞株，我們發(fā)現(xiàn)這兩株細(xì)胞在生長(zhǎng)方面有很大差異，同時(shí)我們?cè)谶@兩株細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)了融合蛋白TNFR-Fc，發(fā)現(xiàn)兩株細(xì)胞在重組表達(dá)蛋白方面也有很大差異。重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-Fc融合蛋白（TNFR-Fc）是通過(guò)重組DNA技術(shù)將TNF-α受體的胞外區(qū)和人免疫球蛋白Fc片段融合表達(dá)而得到的二聚體重組蛋白，是一類抗體結(jié)構(gòu)的蛋白，適合在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。美國(guó)輝瑞公司研發(fā)并已獲得FDA批準(zhǔn)上市的Etanercept（EnbrelTM）即為在CHO細(xì)胞中表達(dá)的TNFR-Fc融合蛋白藥物［10］，可以作為很好的模式蛋白對(duì)宿主細(xì)胞的性能進(jìn)行研究。

本研究中，分別比較了兩株細(xì)胞在生長(zhǎng)、代謝產(chǎn)物生成以及TNFR-Fc蛋白表達(dá)等方面的情況，并采用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（iTRAQ）技術(shù)結(jié)合2D LC-MS/MS［11-12］對(duì)CHO-DG44（A）/TNFR-Fc和CHO-DG44（B）/TNFR-Fc細(xì)胞的蛋白進(jìn)行篩選和分析，鑒定兩株細(xì)胞不同時(shí)期蛋白的差異，探索影響生長(zhǎng)、代謝和外源蛋白表達(dá)的因素，以期為CHO細(xì)胞的基因工程改造提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

兩株來(lái)源不同的CHO-DG44細(xì)胞，CHO-DG44（A）和CHO-DG44（B）細(xì)胞株為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存；ProCHO5無(wú)血清培養(yǎng)基購(gòu)自LONZA公司；乳酸、葡萄糖和血氨測(cè)定盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；M-PER Mammalian Protein Extraction reagent購(gòu)自Thermo公司；iTRAQ試劑盒購(gòu)自Applied Biosystem公司。

1.2 方法

1.2.1 兩株單克隆細(xì)胞株生長(zhǎng)及代謝情況的檢測(cè)

采用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定細(xì)胞密度，臺(tái)盼蘭染色法測(cè)定細(xì)胞活力。利用葡萄糖測(cè)定試劑盒、乳酸測(cè)定試劑盒、血氨檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)培養(yǎng)液中的葡萄糖、乳酸、氨的含量。

1.2.2 重組蛋白株的構(gòu)建與篩選

重組構(gòu)建pIREsneo3-TNFR-Fc載體，并通過(guò)雙限制性內(nèi)切酶驗(yàn)證以及基因測(cè)序確認(rèn)pIREsneo3-TNFR-Fc載體構(gòu)建成功。而后分別轉(zhuǎn)染至CHODG44（A）和CHO-DG44（B）細(xì)胞中，通過(guò)單克隆細(xì)胞篩選，分別選取不同宿主細(xì)胞中外源蛋白表達(dá)量最高的一株進(jìn)行后續(xù)研究，依次命名為CHO-DG44（A）/TNFR-Fc、CHO-DG44（B）/TNFR-Fc細(xì)胞。

1.2.3 兩株單克隆細(xì)胞株蛋白表達(dá)的比較

采用夾心ELISA的方法測(cè)定兩株單克隆細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNFR-Fc融合蛋白的含量。用稀釋的羊抗人IgG-Fc（1∶1 000）包被96孔酶標(biāo)板。分別加入稀釋后的待測(cè)樣品及TNFR-Fc標(biāo)準(zhǔn)品，37℃孵育1 h。加入稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人IgG（1∶1000）。加入顯色液，加入終止液，用酶標(biāo)儀在405 nm的波長(zhǎng)下測(cè)量OD值。通過(guò)TNFR-Fc標(biāo)準(zhǔn)品做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算樣品中TNFR-Fc融合蛋白的含量。單細(xì)胞蛋白表達(dá)量（Pe）按下式計(jì)算：

式中，a為每毫升外源蛋白表達(dá)量，b為每毫升細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 蛋白樣品制備

單克隆細(xì)胞CHO-DG44（A）/TNFR-Fc、CHODG44（B）/TNFR-Fc在TubeSpin管中培養(yǎng)，在穩(wěn)定期（CHO-DG44（B）/TNFR-Fc細(xì)胞培養(yǎng)96 h，CHODG44（A）/TNFR-Fc培養(yǎng)120 h）時(shí)，收取細(xì)胞培養(yǎng)液，1 000 r/min離心5 min，棄上清液收集細(xì)胞，用PBS清洗重懸，重復(fù)離心3次。加入M-PER Mammalian Protein Extraction reagent裂解液，冰上裂解細(xì)胞30 min。混合液10 000 r/min離心10 min，取細(xì)胞裂解液的上清液。

1.2.5 iTRAQ標(biāo)記定量

每份樣品各取150 μg，用胰蛋白酶對(duì)2種蛋白質(zhì)樣品分別進(jìn)行消化處理，得到不同的肽段，用iTRAQ試劑中的115、117分別標(biāo)記CHO-DG44（A）/TNFR-Fc細(xì)胞蛋白、CHO-DG44（B）/TNFR-Fc細(xì)胞蛋白。將所有標(biāo)記的樣品混合，使用強(qiáng)陽(yáng)離子交換液相色譜（SCX）將肽段分為多個(gè)組分，采用納升流速HPLC液相系統(tǒng)Easy nLC進(jìn)行再次分離，每份樣品經(jīng)毛細(xì)高效液相色譜分離后用QstarXL串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.2.6 差異蛋白篩選

報(bào)告置信度在95%以上的蛋白質(zhì)，同時(shí)通過(guò)對(duì)115、117試劑報(bào)告離子的峰面積積分來(lái)進(jìn)行相對(duì)定量分析，將每個(gè)蛋白在比較樣品對(duì)（115∶117）中的比值作為差異倍數(shù)（Fold Change，F(xiàn)C），以FC≥1.2為條件篩選上調(diào)蛋白，以FC＜1.2篩選下調(diào)蛋白，并對(duì)差異蛋白進(jìn)行蛋白類型分析。

1.2.7 生物信息學(xué)分析

將篩選出的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，使用生物信息學(xué)功能注釋和富集工具R包Clusterprofile（v3.14.3）以及小鼠基因數(shù)據(jù)庫(kù)（org.Mm.eg.db，版本：2.1）對(duì)得到的差異蛋白進(jìn)行功能富集，其中包括基因本體論（GO）和京都基因和基因組百科全書(shū)（KEGG）的功能富集。將從蛋白質(zhì)的生物過(guò)程（Biological process，BP）、細(xì)胞組成（Cell Composition，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）進(jìn)行基因本體分析。所有富集統(tǒng)計(jì)顯著性通過(guò)P值調(diào)整法benjaminihochberg計(jì)算。用R軟件包ggplot2將富集結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 兩株單克隆細(xì)胞生長(zhǎng)和重組TNFR-Fc表達(dá)的比較

在相同的培養(yǎng)條件下，兩株細(xì)胞的活力及活細(xì)胞密度隨時(shí)間的變化情況如圖1（a）所示。CHODG44（B）/TNFR-Fc細(xì)胞雖然在第5天細(xì)胞活力仍在80%左右，但活細(xì)胞密度在第3天達(dá)到最高，最高密度為2.3×106個(gè)/mL，之后細(xì)胞結(jié)團(tuán)，細(xì)胞密度下降。而CHO-DG44（A）/TNFR-Fc細(xì)胞株細(xì)胞密度則在第5天達(dá)到最高，為6.8×106個(gè)/mL，是CHODG44（B）/TNFR-Fc的3倍，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程結(jié)團(tuán)現(xiàn)象不明顯。

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定的方法檢測(cè)CHODG44（A）/TNFR-Fc和CHO-DG44（B）/TNFR-Fc兩株細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNFR-Fc的蛋白表達(dá)量，結(jié)果如圖1（b）所示，圖中“****”表示與CHO-DG44（B）/TNFR-Fc細(xì)胞株相比差異極為顯著（P＜0.000 1）。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，CHO-DG44（A）/TNFR-Fc細(xì)胞株外源蛋白表達(dá)量遠(yuǎn)高于CHO-DG44（B）/TNFR-Fc。CHO-DG44（A）/TNFR-Fc細(xì)胞蛋白表達(dá)量最高可達(dá)264 μg/mL左右，而CHO-DG44（B）/TNFR-Fc細(xì)胞外源蛋白表達(dá)量較低，最高僅為10μg/mL左右。外源蛋白的表達(dá)產(chǎn)量隨著培養(yǎng)時(shí)間的變化而發(fā)生改變，在培養(yǎng)第4天時(shí)，CHO-DG44（A）/TNFR-Fc細(xì)胞株的單細(xì)胞蛋白含量為9.12pg，而CHO-DG44（B）/TNFR-Fc細(xì)胞株的單細(xì)胞蛋白含量為0.98pg。

圖1 兩株CHO細(xì)胞生長(zhǎng)和重組TNFR-Fc表達(dá)量的比較Fig.1 Comparison of the growth of two CHO cell lines and the expression of recombinant TNFR-Fc

2.2 兩株單克隆細(xì)胞代謝的比較

通過(guò)檢測(cè)CHO-DG44（A）/TNFR-FCc和CHODG44（B）/TNFR-Fc兩株細(xì)胞在葡萄糖代謝和主要代謝產(chǎn)物乳酸和氨生成方面的情況，發(fā)現(xiàn)CHO-DG44（A）/TNFR-Fc細(xì)胞株葡萄糖消耗量一直高于CHO-DG44（B）/TNFR-Fc細(xì)胞株（圖2（a）），CHO-DG44（A）/TNFR-Fc細(xì)胞株在發(fā)酵結(jié)束時(shí)葡萄糖的質(zhì)量濃度為1.6 g/L，而CHO-DG44（B）/TNFR-Fc細(xì)胞株在發(fā)酵結(jié)束時(shí)葡萄糖的質(zhì)量濃度為4 g/L，這可能是由于CHO-DG44（A）/TNFR-Fc細(xì)胞密度較高所引起的。但代謝副產(chǎn)物乳酸和氨 則 是CHO-DG44（B）/TNFR-Fc細(xì) 胞 高 于CHODG44（A）/TNFR-Fc細(xì)胞。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，CHO-DG44（A）/TNFR-Fc細(xì)胞株所產(chǎn)生的乳酸則明顯少于CHO-DG44（B）/TNFR-Fc細(xì)胞，尤其是發(fā)酵中期差異更為顯著（圖2（b））。在氨的累積方面，兩株細(xì)胞差異更為顯著，在生長(zhǎng)后期CHODG44（A）/TNFR-Fc、CHO-DG44（B）/TNFR-Fc所產(chǎn)生的氨的濃度分別約為4 mmol/L、2.7 mmol/L（圖2（c））。其中，*表示P＜0.05，***表示P＜0.001，****表示P＜0.000 1。

圖2 兩株CHO細(xì)胞代謝的比較Fig.2 Comparison of metabolism of two CHO cells

2.3 差異表達(dá)蛋白的蛋白類型分析

以CHO-DG44（B）/TNFR-Fc細(xì)胞為對(duì)照組，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)比較分析，在CHO-DG44（A）/TNFR-Fc細(xì)胞的穩(wěn)定期共篩選出192個(gè)差異蛋白，其中上調(diào)蛋白104個(gè)，下調(diào)蛋白88個(gè)。通過(guò)比較它們的蛋白類型發(fā)現(xiàn)，酶類所占的比例最多，達(dá)到38.02%，包括與代謝相關(guān)的果糖二磷酸醛縮酶A（Aldoa）、磷酸丙糖異構(gòu)酶（TPI）、L-乳酸脫氫酶（Ldha）、蘋(píng)果酸脫氫酶（Mdh1）、烏頭酸水合酶（Aco2）等；3.65%的蛋白參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（Tcerg1）、核酸酶-敏感元件結(jié)合蛋白1（Ybx1）；與翻譯調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白占1.56%，如核糖體蛋白（Rps27）。0.52%蛋白為生長(zhǎng)因子，如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（Nenf）。此外，還包含G蛋白偶聯(lián)受體、激酶、肽酶及運(yùn)輸相關(guān)蛋白等（見(jiàn)圖3）。

圖3 差異表達(dá)蛋白的蛋白類型分析Fig.3 Protein type analysis of differentially expressed proteins

2.4 差異基因GO富集分析

以CHO-DG44（B）/TNFR-Fc為對(duì)照組，運(yùn)用基因本體論（GO）對(duì)CHO-DG44（A）/TNFR-Fc細(xì)胞的差異蛋白進(jìn)行生物過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能分析，以探討差異蛋白參與行使的功能，結(jié)果如圖4。圖中，縱坐標(biāo)為具體的GO條目，橫坐標(biāo)代表富集程度；圖形越大，富集到該通路的基因越多，顏色越紅，差異越顯著。兩株細(xì)胞的差異蛋白中，參與的生物學(xué)過(guò)程主要包括碳水化合物代謝過(guò)程、谷胱甘肽代謝、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)折疊、蛋白質(zhì)穩(wěn)定化、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)等過(guò)程；在碳水化合物代謝過(guò)程、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)折疊等方面的差異可能是兩株細(xì)胞在乳酸累積和蛋白表達(dá)方面差異的原因。細(xì)胞組成方面，主要作用于胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞質(zhì)、線粒體、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)核、大分子復(fù)合物等等。在分子功能分類中，主要行使催化活性、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合、異構(gòu)酶活性、S100蛋白結(jié)合、ATP酶活性、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合等。

圖4 GO功能注釋及富集分析Fig.4 GO function annotation and enrichment analysis

2.5 差異基因KEGG富集分析

對(duì)篩選到的差異蛋白進(jìn)行KEGG分析，探討這些蛋白參與的生物學(xué)代謝通路及其潛在的作用，結(jié)果如圖5所示。圖中，縱坐標(biāo)為具體的KEGG條目，橫坐標(biāo)代表富集程度；圖形越大，富集到該通路的基因越多，顏色越紅，差異越顯著。從圖中可以看出，差異表達(dá)蛋白涉及的信號(hào)通路主要集中在氨基酸的生物合成、代謝途徑、碳代謝、糖酵解/糖異生、檸檬酸循環(huán)和丙酮酸代謝等。其中，氨基酸合成涉及到細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)的合成，而其他幾條途徑則涉及到能量代謝。

圖5 KEGG富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis

3 討論

CHO細(xì)胞由于其獨(dú)特的特性，已成為重組蛋白治療劑工業(yè)生產(chǎn)中最常用的宿主細(xì)胞［13］，但不同的CHO細(xì)胞株性能相差很大。2011年，包括中國(guó)在內(nèi)的多國(guó)科學(xué)家共同合作收集世界各地的CHO-K1的細(xì)胞株進(jìn)行全基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的傳代培養(yǎng)，細(xì)胞有大量的基因重排，從而細(xì)胞株之間也有差異［5］。筆者所在課題組保存有兩株不同來(lái)源的CHO-DG44細(xì)胞，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，兩株細(xì)胞不僅生長(zhǎng)、代謝存在差異，而且重組表達(dá)外源蛋白也有顯著差異。

在相同培養(yǎng)條件下，CHO-DG44（B）/TNFR-Fc細(xì)胞株最高細(xì)胞密度只有CHO-DG44（A）/TNFR-Fc細(xì)胞株最高細(xì)胞密度的30%左右，而且活力下降迅速，細(xì)胞培養(yǎng)周期短，并伴有嚴(yán)重的細(xì)胞結(jié)團(tuán)現(xiàn)象。這表明兩株細(xì)胞除了在自身生長(zhǎng)活力方面存在差異外，可能在細(xì)胞凋亡方面也有所不同［14-15］。CHO-DG44（A）/TNFR-Fc對(duì)葡萄糖的利用率顯著高于CHO-DG44（B）/TNFR-Fc細(xì)胞，而CHO-DG44（A）/TNFR-Fc產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物乳酸和氨的量卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于CHO-DG44（B）/TNFR-Fc。目前代謝副產(chǎn)物，尤其是乳酸的累積會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用已是共識(shí)［16］，其在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的不斷積累能夠?qū)е聺B透壓的增高及培養(yǎng)基酸化［17］，這也從某種角度解釋了CHO-DG44（B）/TNFR-Fc的細(xì)胞密度為什么低于CHO-DG44（A）/TNFR-Fc的細(xì)胞密度。

細(xì)胞在生長(zhǎng)、代謝等方面的差異也反映出兩株細(xì)胞在磷酸戊糖途徑、糖酵解和三羧酸循環(huán)等能量代謝方面可能存在顯著差異［18］，對(duì)兩株CHO-DG44細(xì)胞蛋白的蛋白質(zhì)組學(xué)分析也印證了這一點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)兩株CHO-DG44細(xì)胞中參與碳代謝、糖酵解/糖異生、三羧酸循環(huán)、丙酮酸代謝等代謝通路的蛋白質(zhì)差異顯著，這些代謝過(guò)程在氨基酸的生物合成及乳酸代謝中起重要的調(diào)節(jié)作用。本研究中，參與糖代謝途徑的果糖二磷酸醛縮酶A（Aldoa）、丙糖磷酸異構(gòu)酶（Tpi1）、丙酮酸激酶（PKM）等多個(gè)蛋白在CHO-DG44（A）/TNFR-Fc中表達(dá)上調(diào)。這些都是碳代謝途徑、氨基酸的生物合成通路中重要的酶，其中PKM是EMP途徑中一個(gè)重要的變構(gòu)酶，可催化磷酸烯醇丙酮酸不可逆地轉(zhuǎn)化成丙酮酸。這些蛋白的表達(dá)上調(diào)，可能通過(guò)影響糖酵解/糖異生、TCA循環(huán)等代謝途徑，從而影響相關(guān)的生物合成、糖的代謝以及能量的產(chǎn)生［19］。蛋白質(zhì)的形成及功能與氨基酸的縮合和肽的自組裝有關(guān)，組成蛋白質(zhì)的大部分氨基酸是以糖酵解途徑與檸檬酸循環(huán)的中間產(chǎn)物為碳鏈骨架生物合成的［20］，因而代謝的差異也會(huì)影響到蛋白質(zhì)的合成。

在CHO細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，乳酸的累積量與外源蛋白質(zhì)表達(dá)量成負(fù)相關(guān)的關(guān)系。當(dāng)葡萄糖過(guò)量時(shí)，代謝途徑會(huì)從丙酮酸經(jīng)乳酸脫氫酶（LDH）還原產(chǎn)生乳酸［21-22］，但當(dāng)葡萄糖消耗后，乳酸會(huì)作為碳源被細(xì)胞所消耗。乳酸脫氫酶（LDH）在CHODG44（A）/TNFR-Fc細(xì)胞具有高表達(dá)，該酶可以催化丙酮酸和乳酸的轉(zhuǎn)變，而且這一過(guò)程是可逆的。通過(guò)檢測(cè)兩株細(xì)胞在培養(yǎng)的12 d中重組外源蛋白TNFR-Fc的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)乳酸的累積量與外源蛋白質(zhì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)的關(guān)系，CHO-DG44（A）/TNFRFc細(xì)胞的蛋白表達(dá)量均高于CHO-DG44（B）/TNFRFc細(xì)胞株。雖然產(chǎn)生這一現(xiàn)象的具體機(jī)制尚不清楚，也從一定程度說(shuō)明了細(xì)胞的代謝與蛋白質(zhì)的合成有一定的關(guān)系。

外源蛋白的表達(dá)產(chǎn)量隨著培養(yǎng)時(shí)間的變化而發(fā)生改變，兩株細(xì)胞在外源蛋白表達(dá)量上的差異，可能是由于蛋白合成、蛋白折疊及蛋白分泌等相關(guān)功能的不同而引起的。在CHO-DG44（A）/TNFR-Fc細(xì)胞中，我們發(fā)現(xiàn)某些與蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定相關(guān)的蛋白，如熱休克蛋白90a（Hsp90aa1）、肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶-3的異構(gòu)體1（Ppil3）表達(dá)上調(diào)，這將有助于蛋白質(zhì)從無(wú)規(guī)則卷曲折疊成特定的功能性三維結(jié)構(gòu)。但與此同時(shí)，微管蛋白特異性伴侶A（Tbca）、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A4（Pdia4）、GrpE蛋白同源物1（Grpel1）存在不同程度的下調(diào)，這會(huì)不會(huì)影響大量合成的重組蛋白的正確組裝，從而影響到重組蛋白質(zhì)的活性是需要進(jìn)一步研究的課題。

4 結(jié)論

在兩株CHO-DG44細(xì)胞中存在192種差異表達(dá)基因，這些差異表達(dá)基因主要富集在包括蛋白質(zhì)折疊、谷胱甘肽代謝過(guò)程、碳水化合物代謝過(guò)程、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等生物過(guò)程，主要涉及氨基酸的生物合成、碳代謝、糖酵解/糖異生、三羧酸循環(huán)等信號(hào)通路。不同CHO細(xì)胞株在氨基酸的生物合成、碳代謝、糖酵解/糖異生等方面的蛋白差異，可能是引起兩株細(xì)胞生長(zhǎng)代謝以及外源蛋白TNFR-Fc表達(dá)方面的差異的原因。