徐俊，王艷玲，趙金良*

（1農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室（上海海洋大學(xué)），上海 201306；2水產(chǎn)動物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心（上海海洋大學(xué)），上海 201306；3水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心（上海海洋大學(xué)），上海 201306）

0 引言

【研究意義】鱖（Siniperca chuatsi）是我國傳統(tǒng)的名優(yōu)特種水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟魚類（國家特色淡水魚產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系，2021）。隨著集約化養(yǎng)殖密度不斷提高，水域環(huán)境日益惡化，導(dǎo)致鱖疾病呈現(xiàn)暴發(fā)和流行之勢（He et al.，2000）。病毒病是制約鱖養(yǎng)殖的重要因素，流行病學(xué)調(diào)查顯示廣東、浙江、江蘇、安徽等地廣泛存在由鱖傳染性脾腎壞死病毒（Infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV）引發(fā)的鱖感染傳染性脾腎壞死病，且致死率極高（曾慷等，1999）。近年來，鱖養(yǎng)殖面臨養(yǎng)殖密度集中、疫病多發(fā)等問題，已對其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展造成較大影響。因此，利用聚肌胞苷酸（Poly I：C）模擬病毒刺激了解感染后的免疫反應(yīng)和干擾素基因表達，可為評估病原感染及其免疫應(yīng)答提供參考。【前人研究進展】魚類外周血中的白細胞是機體細胞免疫和體液免疫的重要成分，可反映外界刺激對自身生理狀態(tài)的改變（蘇時萍和李延璐，2007）。血細胞的形態(tài)、數(shù)量等指標被廣泛用來評價魚類的健康、營養(yǎng)及對環(huán)境的適應(yīng)等狀況（林浩然，1999）。已有研究發(fā)現(xiàn)，鱖經(jīng)假單胞菌（Pseudomonas adaceae）感染引發(fā)機體炎癥，單核細胞和嗜中性粒細胞由健康狀態(tài)下的4%和6%分別上升至24%和29%（蘇時萍和李延璐，2007）；草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）感染12 h以上時，白細胞的抗病毒基因IFN1、IL-1β、Mx等規(guī)律性上升并發(fā)揮重要抗病毒反應(yīng)，但紅細胞、血栓細胞無明顯變化（楊玲，2021）。補體是魚類抵抗外界不良生存環(huán)境的重要體液免疫因子，具有趨化、調(diào)理和消滅病原體的作用（Masaru and Sylvia，2000）。補體C3和C4主要參與替代途徑，共價識別特異性受體細胞參與病毒吞噬過程，硬骨魚中補體C3、C4共價聯(lián)結(jié)具有持續(xù)抗感染功能，且其調(diào)理作用能增強體液和細胞介導(dǎo)的特異性免疫（Xu et al.，2001，張靜等，2008）。有研究指出，病毒會引起Ⅰ型干擾素（Interferons，IFNs）產(chǎn)生（白思宇等，2018，肖攀，2018）。誘導(dǎo)干擾素調(diào)節(jié)因子7（Interferon regulatory factor 7，IRF7）是魚類TLR3受體信號通路中對Ⅰ型干擾素依賴免疫反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子，也是病毒激活髓樣分化因子（MyD88）誘導(dǎo)IFN-α/β最主要的干擾素。免疫器官作為魚類免疫系統(tǒng)的基礎(chǔ)，主要包括胸腺、腎臟、脾臟等。ISKNV感染試驗表明，鱖脾臟、頭腎中IRF7轉(zhuǎn)錄水平在24和36 h顯著上調(diào)；經(jīng)腹腔注射聚肌胞苷酸后，其肝臟、脾中IRF7轉(zhuǎn)錄水平在12 h升高、48 h下降（Sun et al.，2007），胸腺、肝臟、脾臟、頭腎中IFN-α3轉(zhuǎn)錄水平在6 h均有明顯上調(diào)（肖攀，2018）。鱖基因組現(xiàn)已鑒定出3種不同的I型IFNs：IFNc、IFNd和IFNh，通過細胞因子受體家族信號誘導(dǎo)IFN自身表達的同時能誘導(dǎo)IRF3、IRF7表達導(dǎo)致干擾素聯(lián)級擴增，其表達受干擾素調(diào)節(jié)基因（IRFs）通路調(diào)控（Laghari et al.，2018a）。【本研究切入點】隨著鱖疾病研究的不斷深入，病毒病是目前科研工作者一直關(guān)注的研究重點（He et al.，2000，Laghari et al.，2018b），但目前關(guān)于鱖感染病毒后對不同時序免疫因子關(guān)系、不同組織器官干擾素基因影響的研究報道較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】比較注射Poly I：C后不同時序鱖白細胞百分比、血清補體蛋白水平和主要免疫器官中干擾素系統(tǒng)相關(guān)基因的表達變化，為判斷和指導(dǎo)鱖養(yǎng)殖過程中病原刺激后免疫應(yīng)答和病毒監(jiān)測提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試鱖購自廣東省佛山市某養(yǎng)殖場。挑選平均體重為20.0±2.8 g的健康鱖120尾，暫養(yǎng)于上海海洋大學(xué)濱海試驗基地循環(huán)水系統(tǒng)中，飼養(yǎng)水溫控制在20~22℃，分6缸，每缸20尾，暫養(yǎng)5 d，每日2次定時定點投喂。

1.2 試驗材料處理和組織制備

設(shè)Poly I：C處理組［濃度25 μg/mL，磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋］和PBS組（陰性對照），每組設(shè)3個平行。處理組腹腔注射0.2 mL Poly I：C溶液，對照組腹腔注射0.2 mL PBS溶液。注射完成后，于0、3、6、12、24、36、48和72 h分別采集樣本。于不同時間點隨機撈取處理組與對照組鱖各6尾，尾靜脈采血，一部分用于血涂片制作；一部分室溫靜置，4℃下2000 r/min離心20 min，取血清，用于補體含量測定。取肝臟、脾臟、腎臟、胸腺用于熒光定量分析。

1.3 血涂片觀察

取血液標本推片、風(fēng)干，甲醛4℃預(yù)冷固定15 min，Giemsa染液按1∶9稀釋（PBS水配置，0.01 mol/L，pH 6.8），避光染色15 min，倒掉染液，自來水沖洗，中性樹脂封片，使用Olympus顯微鏡油鏡觀察。根據(jù)不同時序每尾/組片子3張平行，每張涂片隨機選擇10個視野，計數(shù)統(tǒng)計淋巴細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞和血栓細胞數(shù)目（任培麗，2007）。

1.4 補體蛋白含量測定

取凍存血清樣10 μL以雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法測定補體C3和C4含量。按照上海酶聯(lián)生物科技有限公司的魚補體C3、C4試劑盒方法執(zhí)行，于酶標儀（Synergy H1，美國BioTek公司）450 nm下測定各樣本吸光值，通過標準曲線計算。

1.5 實時熒光定量PCR

用TRIzol法提取各組織總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，分光光度計（Onedrop）測定其濃度和純度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser，TaKaRa）說明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存。鱖干擾素（IFNc、IFNh）、干擾素調(diào)節(jié)因子（IRF7）、β-actin基因引物參照Laghari等（2018a），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。參照TB Green?Premix ExTaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒說明進行熒光定量PCR，反應(yīng)體系20.0 μL：2×SYBR Green qPCR Mix 10.0 μL，引物0.8 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 8.2 μL。擴增程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃8 s，60℃30 s，進行40個循環(huán)，擴增結(jié)束，加熱熔解95℃15 s，65℃退火1 min?；蛳鄬Ρ磉_量采用2-△△Ct法進行計算。

1.6 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0進行單因素方差分析（One-way ANOVA）、獨立樣本T檢驗比較指標差異，采用GraphPad Prism 8.01繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 聚肌胞苷酸刺激對不同時序外周白細胞百分比的影響

由圖1可出，與對照組比較，處理組0～72 h淋巴細胞百分比均低于對照組，且6和48 h與對照組差異顯著（P＜0.05，下同）；處理組6~72 h單核細胞百分比極顯著提高（P＜0.01，下同），且于48 h達峰值后逐漸恢復(fù)至初始水平；處理組3 h嗜中性粒細胞百分比較對照組極顯著提高；處理組24、36和48 h血栓細胞百分比較對照組極顯著降低。

圖1 Poly I：C注射后各時序鱖白細胞分類百分比Fig.1 Leukocyte percentage in S.chuatsi after Poly I：C injection

2.2 聚肌胞苷酸刺激對不同時序血清補體含量的影響

由圖2可看出，處理組C3含量隨時間延長呈逐漸上升趨勢；對照組C3含量在3 h高于初始，6 h低于初始，與處理組差異顯著。處理組C4含量整體變化不大，Poly I：C刺激后，處理組C4含量3 h顯著高于對照組，6、24、48 h顯著低于對照組。

圖2 Poly I：C注射后各時序鱖血清補體含量Fig.2 Serum complement content in S.chuatsi at different time sequences after Poly I：C injection

2.3 聚肌胞苷酸刺激對不同時序各組織干擾素基因表達的影響

由圖3可看出，與初始0 h相比，處理組腎臟、胸腺、脾臟和肝臟IRF7基因表達量分別從3和6 h開始極顯著上調(diào)。其中腎臟、胸腺、肝臟在6 h達峰值，12 h逐漸恢復(fù)；脾臟在12 h達峰值，24 h后開始極顯著降低，36 h表達下調(diào)至最低水平。由圖4可看出，與初始0 h相比，處理組腎臟和肝臟IFNh基因表達量3~12 h極顯著上調(diào)，腎臟于3 h達峰值，后逐漸恢復(fù)，肝臟于12 h達峰值后開始下降；胸腺IFNh基因表達量于6 h達峰值，極顯著高于初始IFNh基因表達量，12 h恢復(fù)下降，48 h達最低值；脾臟IFNh基因表達量在Poly I：C刺激后均低于初始，36 h時達最低值。由圖5可看出，與初始0 h相比，處理組腎臟、胸腺、肝臟、脾臟IFNc基因表達量均于12 h極顯著上調(diào)，后逐漸下降，分別于72、72、48和72 h達最低水平。

圖3 Poly I：C注射對鱖各免疫組織不同時序IRF7基因表達的影響Fig.3 Effects of Poly I：C injection on IRF7 gene expression in immune tissues of S.chuatsi at different time sequences

圖4 Poly I：C注射對鱖各免疫組織不同時序IFNh基因表達的影響Fig.4 Effects of Poly I：C injection on IFNh gene expression in immune tissues of S.chuatsi at different time sequences

圖5 Poly I：C注射對鱖各免疫組織不同時序IFNc基因表達的影響Fig.5 Effects of Poly I：C injection on IFNc gene expression in immune tissues of S.chuatsi at different time sequences

3 討論

單核細胞具液泡和吞噬物，可吞噬病原而達到免疫防御功能。多種魚類的研究結(jié)果已證實，外周血單核細胞占比增幅越大，吞噬活性越強（周炳升和李連詳，1992）。鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida）攻毒大西洋鮭（Salmo salarL.）白細胞、粒細胞分別降低，淋巴細胞、單核細胞分別升高且時效呈顯著線性變化（衣萌萌等，2015）。在淋巴細胞為主的規(guī)律下劃分3種類型：第一種健康狀態(tài)下嗜中性粒細胞高，單核細胞低；第二種單核細胞高，嗜中性粒細胞低；第三種嗜中性粒細胞和單核細胞均高而淋巴細胞偏低（林光華等，1998）。本研究中，腹腔注射Poly I：C最早通過腹腔膜到達血液，嗜中性粒細胞百分比顯著上升，大量增殖發(fā)揮抗病毒作用，此時單核細胞處于最低水平，處理組中單核細胞百分比在24、36和48 h較初始水平顯著提高，推測在抗病毒反應(yīng)中嗜中性粒細胞最先應(yīng)答起到非特異性應(yīng)激，間接證明作為鱖魚II型粒細胞具有活躍的吞噬功能，也是外周血中最常見的粒細胞（袁仕取等，1998），可參與機體的炎癥反應(yīng)（Rombout et al.，2005；趙鳳岐和曹謹玲，2007）。對照組中白細胞百分比在各時序均未出現(xiàn)明顯變化。處理組淋巴細胞百分比在不同時序中均低于對照組，說明因為魚體絕大多數(shù)的淋巴細胞處于休眠狀態(tài)，受到抗原刺激后迅速分裂并分化成T細胞和B細胞（李亞南等，1995）。這與第三種情況相似，血栓細胞僅與魚類血液凝固有關(guān)（尾崎久雄等，1982），所以Poly I：C刺激并不能引起比例增加，另外血栓細胞易聚集成塊，可能存在一定的計數(shù)誤差，因此可根據(jù)魚類白細胞比例變化來判斷受檢魚是否有病、病情輕重及疾病性質(zhì)等。

C3作為補體系統(tǒng)中固有成分，在機體防御過程中可通過免疫復(fù)合物、調(diào)理吞噬細胞等機制對病原微生物進行清除及活化炎性細胞對靶細胞的殺傷作用（牛春玲等，2003），Sahu和Lambris（2001）證明補體C3參與補體系統(tǒng)激活，C3本身不具備活性，只有轉(zhuǎn)化為補體C3a或C3b才能發(fā)揮作用，虹鱒魚C3a對吞噬細胞活動具有促進作用（Rotllant et al.，2004）。本研究通過腹腔注射PolyI：C刺激鱖，發(fā)現(xiàn)血清C3在6 h顯著提高，說明在血清中的補體對PolyI：C刺激敏感并大量激發(fā)。C3和C4機體防御中通過協(xié)同免疫復(fù)合物、調(diào)節(jié)吞噬細胞等清除病原微生物，活化炎癥細胞（張穎等，2005），這種先天性免疫系統(tǒng)就成為了魚類防御病原入侵的最重要屏障（Magnadóttir，2006），且產(chǎn)生補體的主要細胞是淋巴細胞，同時證明淋巴細胞的休眠狀態(tài)與補體C3變化趨勢有相似性，補體C4主要協(xié)同補體C3共價識別作用，因此初步推斷補體的提升和白細胞的增幅具有同步抗感染調(diào)節(jié)機體，并對外界刺激做出應(yīng)答功能有一定影響，說明在抵抗病毒與細菌入侵的免疫過程均有其作用，且在不同組織不同刺激后的免疫應(yīng)答模式可能存在差異。

各類病毒刺激能引起魚體各組織的干擾素表達發(fā)生變化。Laghari等（2018a）指出鱖魚IFNh基因啟動子中含IRF3的對接位點，對Poly I：C刺激具一定的時間依賴性；IFNc僅包含IRF7的對接位點。此外，腹腔注射Poly I：C 24 h后，IFNh和IFNc表達在脾臟、肝臟、腎臟中均上調(diào)，在胸腺中顯著上調(diào)，與本研究結(jié)果一致，說明IRF7、IFNh和IFNc在鱖抗病毒過程中起到免疫保護作用。IRF7作為上游的調(diào)控基因，需要達到一定水平才能保證迅速激活下游通路。本研究中，IRF7和IFNh基因的相對表達量峰值在腎臟、胸腺中更高，間接說明腎臟和胸腺是鱖抗病毒免疫應(yīng)答的主要器官；此外，肝臟作為鱖重要的解毒器官，Poly I：C刺激前期IRF7基因表達上調(diào)、后期顯著下降，可能是因為肝臟在應(yīng)答抗原的早期發(fā)揮作用；腎臟IFNc呈現(xiàn)先上升后下降的表達趨勢，且于12 h達峰值，可能是病毒刺激IRF7大量表達從而提升IFNc轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)揮抗病毒作用，與李文龍（2016）的研究結(jié)果相似。以上結(jié)果均表明，Poly I：C刺激鱖魚的2個IFN基因均有明顯上調(diào)，但這2種IFN在不同組織中的表達存在一定程度的差異，Poly I：C刺激前期，魚體主要免疫器官通過刺激干擾素表達發(fā)揮免疫防御作用。

4 結(jié)論

鱖受Poly I：C模擬病毒刺激后，血細胞中各類白細胞、血清酶補體C3和C4含量有不同變化，干擾素在不同時序顯著影響各組織中的表達變化。因此，通過了解病毒入侵后機體的免疫因子變化，可為其免疫應(yīng)答與病害監(jiān)測提供參考。