李婭婭，蘇換換，馬冬梅，樊佳佳，朱華平*

（1上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510380；3廣東省水產(chǎn)動(dòng)物免疫與綠色養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510380）

0 引言

【研究意義】羅非魚原產(chǎn)于非洲，是鱸形目（Perciformes）麗魚科（Cichlidae）的一種廣鹽性溫帶魚類，已在100多個(gè)國(guó)家和地區(qū)廣泛推廣及養(yǎng)殖，同時(shí)被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）列為六大主食品之一（陳藍(lán)蓀，2006；王瑋等，2012）。我國(guó)1956年首次引入羅非魚，經(jīng)多次的引種和種質(zhì)改良，羅非魚已成為我國(guó)淡水養(yǎng)殖中具有一定養(yǎng)殖優(yōu)勢(shì)的重要經(jīng)濟(jì)性魚類（高風(fēng)英等，2016；蘇換換，2019）。因羅非魚具有肉質(zhì)鮮嫩、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、生長(zhǎng)快、對(duì)養(yǎng)殖條件要求低等特點(diǎn)（劉春榮，2010），深受廣大消費(fèi)者和養(yǎng)殖戶青睞，近年來產(chǎn)量持續(xù)增加，2019年我國(guó)產(chǎn)量達(dá)164萬t（代云云等，2021）。羅非魚產(chǎn)量增加的同時(shí)，養(yǎng)殖面積在不斷擴(kuò)大，但目前以淡水養(yǎng)殖為主。我國(guó)鹽堿水資源十分豐富，低洼鹽堿水域面積達(dá)4.5萬ha，約占全國(guó)湖泊總面積的55%，但鹽堿水具有高碳酸鹽堿度（HCO3-和CO32-）、高pH、離子組成復(fù)雜等特點(diǎn)（梁利群等，2013；常玉梅和梁利群，2021），不利于常規(guī)魚類的生長(zhǎng)及繁殖，開發(fā)和利用存在較大的局限性。因此，鹽堿水資源的開發(fā)是水產(chǎn)養(yǎng)殖繼淡水、海水養(yǎng)殖后的又一次水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)的革新與挑戰(zhàn)；而培育耐鹽堿羅非魚并揭示其滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)有效開發(fā)利用鹽堿水資源具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來對(duì)于羅非魚耐鹽堿及滲透壓分子調(diào)控機(jī)制的探索已成為研究熱點(diǎn)之一。有研究表明，在急性鹽度耐受性實(shí)驗(yàn)中，莫桑比克羅非魚（Oreochromis mossambicus）比尼羅羅非魚（O.niloticus）表現(xiàn)出更強(qiáng)的鹽度耐受性（Yamaguchi et al.，2018）。莫桑比克羅非魚因有較強(qiáng)的耐鹽堿能力，所以被作為親本生產(chǎn)更具有鹽堿耐受能力的雜交羅非魚，在水溫28℃、pH 9.3~9.5的環(huán)境條件下，莫桑比克羅非魚、莫荷羅非魚（O.mossambicus♀×O.hornorum♂）和荷那龍羅非魚（Oreochromis hornorum）96 h半致死堿度分別為3.99、4.96和6.67 g/L（李茜茜等，2016；蘇換換等，2020）。目前對(duì)莫桑比克羅非魚滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制的研究已有一些報(bào)道，在較低濃度鹽脅迫（22 g/L）和高鹽脅迫（35 g/L）條件下，莫桑比克羅非魚AQP1基因mRNA在鰓和腎中的表達(dá)均在6 h時(shí)達(dá)峰值，以快速應(yīng)答鹽脅迫來維持體內(nèi)滲透壓平衡（李茜茜等，2016）。長(zhǎng)期鹽度脅迫會(huì)導(dǎo)致莫桑比克羅非魚生長(zhǎng)緩慢、飼料利用率低、免疫反應(yīng)受損、腸道微生物群組成和營(yíng)養(yǎng)代謝紊亂（Bu et al.，2021）。因此，以莫桑比克羅非魚為親本，培育更加耐鹽堿的雜交羅非魚新品種對(duì)于鹽堿條件下羅非魚的養(yǎng)殖具有現(xiàn)實(shí)意義。同時(shí)莫桑比克羅非魚具有較強(qiáng)的鹽堿水環(huán)境適應(yīng)能力，且在鹽堿水中能正常繁殖（李茜茜，2016），是魚類滲透壓分子調(diào)節(jié)機(jī)制研究中重要的實(shí)驗(yàn)材料。牛磺酸（Taurine，Tau）又稱為2-氨基乙磺酸，是動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)含量最豐富的游離β-氨基酸（劉虹等，2007），具有維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)、抗氧化、解毒和穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)等生物學(xué)效應(yīng)，同時(shí)是一種滲透劑，可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓。由于Tau分子中有磺酸基，不能合成蛋白質(zhì)，在體內(nèi)呈游離態(tài)，且胞外的含量遠(yuǎn)高于胞內(nèi)，所以Tau以2種方式聚集在細(xì)胞內(nèi)：一是在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行生物合成，二是通過細(xì)胞膜上的?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)蛋白將細(xì)胞外的Tau轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，后者占主要地位（楊群輝等，2012）。滲透壓環(huán)境是影響其轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)的重要因素（劉虹等，2007），當(dāng)處于高滲環(huán)境時(shí)，?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)蛋白會(huì)將細(xì)胞外的Tau轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，降低胞外的滲透壓；當(dāng)處于低滲環(huán)境時(shí)，同樣利用?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)蛋白使細(xì)胞內(nèi)的Tau外流轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外，提高胞外的滲透壓（Liu et al.，1992；Warskulat et al.，1997）。牛磺酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（Transporter Taurine，TauT），也稱為溶質(zhì)載體家族6基因（Solutecarrier family 6，member 6，Slc6a6），其編碼的TAUT蛋白是一種對(duì)Na+、Cl-具有依賴性且由Na+-K+-ATPase供能的跨膜蛋白（Gether et al.，2006；張小龍等，2013）。有研究利用TauT缺陷（taut-/-）小鼠（Mus muscculus）模型驗(yàn)證TAUT蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)Tau的重要功能，TAUT蛋白缺失會(huì)使小鼠大多數(shù)組織中Tau含量減少90%，證明TAUT蛋白是Tau的主要非冗余轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，且PAT1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SLC36A1）不能彌補(bǔ)TAUT蛋白缺失帶來的損失（Baliou et al.，2020）。敲除小鼠的TauT基因（TauTKO小鼠）會(huì)引起Tau缺乏性心肌病，改變TauTKO小鼠體內(nèi)有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，由此會(huì)引起細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)的紊亂，上調(diào)Slc6a12和Slc38a2等基因mRNA的表達(dá)水平，以提高對(duì)底物的攝取來維持細(xì)胞滲透壓平衡的調(diào)節(jié)（Ito et al.，2018）。將文蛤（Meretrix lusoria）從高鹽（20 g/L）轉(zhuǎn)移到低鹽（10 g/L）的棲息環(huán)境后，面對(duì)低鹽脅迫，文蛤的鰓組織中TauT基因mRNA的表達(dá)量在轉(zhuǎn)移后240和360 h顯著上調(diào)，TAUT蛋白的相對(duì)豐度在3 h顯著上調(diào)，而外套膜中TauT基因mRNA的表達(dá)量在轉(zhuǎn)移后3 h顯著下調(diào)，TAUT蛋白的相對(duì)豐度在24和72 h顯著上調(diào)（Lin et al.，2021）。在研究滲透脅迫下鯰魚（Clarias magur）紅細(xì)胞的體積調(diào)節(jié)時(shí)發(fā)現(xiàn)，高鹽環(huán)境會(huì)刺激TAUT蛋白攝取更多的Tau，而且也在H4IIE細(xì)胞中證實(shí)了高滲條件上調(diào)了TauT基因mRNA的表達(dá)水平，增強(qiáng)了TAUT蛋白的活性以攝取更多的Tau（Banerjee et al.，2019）。TauT基因在莫桑比克羅非魚中已有研究報(bào)道，用Northern blot的方法檢測(cè)到高鹽度脅迫下莫桑比克羅非魚肝、腎、鰓、腦等9個(gè)組織中的一種編碼Tau轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（tTauT1）的mRNA水平在12 h以內(nèi)達(dá)峰值，到24 h表達(dá)量又均呈下降趨勢(shì)（Takeuchi et al.，2000）。但莫桑比克羅非魚TauT基因不止有一種類型，還需要進(jìn)一步研究其功能。【本研究切入點(diǎn)】我國(guó)鹽堿水資源十分豐富有待開發(fā)，而羅非魚具有一定的耐鹽堿性，有望應(yīng)用于鹽堿水域養(yǎng)殖。但對(duì)于鹽堿混合脅迫條件下，羅非魚體內(nèi)滲透壓的調(diào)節(jié)機(jī)制的研究才剛起步。Tau轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（TauT）是一種對(duì)機(jī)體的滲透壓調(diào)控有重要作用的蛋白，但耐鹽堿性強(qiáng)的莫桑比克羅非魚體內(nèi)TauT功能的分析還有待深入?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究分離到莫桑比克羅非魚體內(nèi)的另一種牛磺酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因TauT2，采用生物信息學(xué)分析方法預(yù)測(cè)其編碼蛋白的氨基酸序列及其高級(jí)結(jié)構(gòu)，并利用熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)其表達(dá)特征及在鹽堿脅迫下的表達(dá)規(guī)律，以期為深入闡明魚類?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能提供更全面可靠的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

莫桑比克羅非魚由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所高要水產(chǎn)種質(zhì)中心提供。試驗(yàn)用水為曝氣至少24 h的自來水，鹽為海水晶（江西鹽通科技有限公司），堿為分析純碳酸氫鈉（廣州化學(xué)試劑廠）。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)前，挑選體質(zhì)健壯、無傷病、規(guī)格為28.76±6.38 g的莫桑比克羅非魚，在養(yǎng)殖箱（67 cm×45 cm×35.5 cm）中暫養(yǎng)1周。將試驗(yàn)魚隨機(jī)分為2組，即處理組與對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)平行組（3個(gè)養(yǎng)殖箱），每箱100尾。試驗(yàn)期間不進(jìn)行投喂?；诒菊n題組前期對(duì)莫桑比克羅非魚耐鹽堿性能的研究顯示，在急性脅迫下，莫桑比克羅非魚96 h半數(shù)致死鹽濃度和堿濃度分別為24和3.99 g/L（劉玉嬌，2014；李茜茜，2016），因此本研究選擇25 g/L的鹽濃度和4 g/L的堿濃度作為處理終濃度。開始鹽堿共同脅迫處理第1 d，慢慢向養(yǎng)殖用水中加入海水晶和碳酸氫鈉，使水體中鹽堿濃度分別升高至10和1 g/L，之后鹽濃度和堿濃度每天分別增加5和1 g/L，最終鹽、堿濃度各保持在25和4 g/L不變。對(duì)照組（0 h）的養(yǎng)殖用水為不添加鹽堿溶液并充分曝氣的自來水。試驗(yàn)期間水溫為27~30℃，溶解氧為8.80~9.65 mg/L。

1.3 樣品采集

處理組在鹽堿脅迫處理到達(dá)終濃度后，分別在鹽堿共同處理6、12、24、48、72及96 h等6個(gè)時(shí)間點(diǎn)依次進(jìn)行取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)、每個(gè)平行組隨機(jī)取3尾魚的腸、鰓、腎和肝組織各50 mg，分別放入1 mL Magzol Reagent試劑（HiPure Universa RNA Kit，Magen，廣州）中，充分勻漿，于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?duì)照組在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)每個(gè)平行組隨機(jī)選取3尾進(jìn)行快速解剖，分別取腸、鰓、腎、肝、肌、腦、皮、脾、胃、眼、血、心和卵巢組織各50 mg，放入1 mL的Magzol Reagent試劑中，勻漿后于-80℃保存。

1.4 總RNA提取及cDNA合成

用HiPure Universa RNA Kit試劑 盒（Magen R4130-02）提取魚體各組織的總RNA。RNA樣品的完整性與純度分別用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和多功能酶標(biāo)儀（BioTeK，美國(guó)）檢測(cè)。第一鏈cDNA的合成采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa RR420A）反轉(zhuǎn)錄試劑盒，用β-actin基因作內(nèi)參對(duì)cDNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量。將質(zhì)量合格的cDNA樣品用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)。

1.5 莫桑比克羅非魚TAUT2蛋白序列比對(duì)和進(jìn)化分析

根據(jù)已測(cè)得的莫荷羅非魚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA558948，PRJNA558948）中?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的序列信息，設(shè)計(jì)引物TauT1-F、TauT1-R，TauT2-F、TauT2-R，TauT3-F、TauT3-R，TauT4-F、TauT4-R（表1），用于PCR擴(kuò)增莫桑比克羅非魚的TauT2基因。PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，將得到的序列用NCBI網(wǎng)站（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）上的BLAST程序進(jìn)行一致性比對(duì)，再用DNAMAN進(jìn)行拼接，將該TauT2基因所編碼的氨基酸序列與其他8個(gè)物種已知的TAUT2序列進(jìn)行比對(duì)，并用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。使用ExPASy ProtParam Tool（https：//web.expasy.org/protparam/）在線軟件進(jìn)行氨基酸殘基分析、蛋白質(zhì)等電點(diǎn)、分子量等的預(yù)測(cè)；用SOPMA（http：//npsapbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）、SWISS-MODEL（https：//swiss model.expasy.org/）在線分析軟件預(yù)測(cè)莫桑比克羅非魚TAUT2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。用蛋白跨膜預(yù)測(cè)軟件TMHMM Serverv.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線分析TAUT2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)。

1.6 莫桑比克羅非魚TauT2基因表達(dá)分析

根據(jù)所獲的莫桑比克羅非魚TauT2基因CDS設(shè)計(jì)qRT-PCR反應(yīng)所需的引物TauT5-F和TauT5-R（表1）。實(shí)時(shí)熒光定量試驗(yàn)采用TB Green?premix ExTaqTM（TaKaRa RR420A）試劑盒，在LightCycler96?qRT-PCR儀（Roch，瑞士）上進(jìn)行，β-actin為內(nèi)參基因。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性30 s；94℃5 s，60℃30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；溶解曲線為95℃5 s，60℃1 min，95℃1 s；50℃降溫30 s。每個(gè)qRT-PCR設(shè)3個(gè)技術(shù)重復(fù)，檢測(cè)結(jié)果用2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)結(jié)果用SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析，檢測(cè)其顯著性。

表1 TauT2基因擴(kuò)增和表達(dá)分析所用的引物序列Table 1 Primer sequence for TauT2 gene amplification and expression analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 莫桑比克羅非魚TauT2基因cDNA序列分析

獲得的莫桑比克羅非魚TauT2基因序列長(zhǎng)度為2187 bp，其中編碼區(qū)（CDS）長(zhǎng)度為1881 bp，共編碼626個(gè)氨基酸（圖1）。預(yù)測(cè)其蛋白分子量為69938.23 Da，等電點(diǎn)為7.01，負(fù)電荷的氨基酸殘基總數(shù)（Asp+Glu）為48，正電荷的氨基酸殘基總數(shù)（Arg+Lys）為48，不穩(wěn)定系數(shù)為（II）31.71，預(yù)測(cè)該蛋白為穩(wěn)定蛋白。疏水指數(shù)為0.40，預(yù)測(cè)該蛋白為疏水蛋白。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，α-螺旋占30.83%，無規(guī)則卷曲占38.34%，延伸鏈占23.48%，β轉(zhuǎn)角占7.35%。比較莫桑比克羅非魚TAUT2蛋白和已知的tTauT1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖，可知TAUT2蛋白具有典型的?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)蛋白跨膜蛋白結(jié)構(gòu)域（圖2），該結(jié)構(gòu)域包括12個(gè)跨膜區(qū)（圖3）。

圖1 莫桑比克羅非魚TauT2基因CDS序列及其編碼的氨基酸Fig.1 CDS sequence and the coded amino acid sequence of TauT2 gene in O.mossambicus

圖2 莫桑比克羅非魚TAUT2和tTAUT1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 Tertiary structure prediction of TAUT2 and tTAUT1 proteins in O.mossambicus

圖3 莫桑比克羅非魚TAUT2蛋白的膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Membrane structure prediction of TAUT2 protein in O.mossambicus

2.2 莫桑比克羅非魚TAUT2蛋白序列的一致性比較與進(jìn)化樹分析

使用DNAMAN和MEGA 7.0分別對(duì)莫桑比克羅非魚TauT2基因編碼的氨基酸序列與莫桑比克羅非魚tTAUT1蛋白及其他8個(gè)物種的牛磺酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。結(jié)果表明，莫桑比克羅非魚的TAUT2蛋白氨基酸序列較保守，與斑馬擬麗魚（Maylandia zebra）的一致性最高，為98.72%；與尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚（O.aueus）的一致性為98.40%和97.76%，與已報(bào)道的莫桑比克羅非魚的tTAUT1蛋白（Takeuchi et al，2000）一致性為88.52%；而與人（Homo sapiens）的一致性最低，為77.64%（圖4）。

圖4 莫桑比克羅非魚與其他物種的?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)蛋白氨基酸序列比對(duì)Fig.4 Amino acid sequence alignments of taurine transporter in O.mossambicus and other species

系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示，TAUT2蛋白氨基酸序列與尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚的?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)蛋白聚為一支，已知的莫桑比克羅非魚tTAUT1蛋白分別與奧利亞羅非魚的另一種?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)蛋白聚為另一支，然后2個(gè)分支聚為一支（圖5）。

圖5 基于?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)蛋白氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree based on amino acid sequence of taurine transporter protein

2.3 莫桑比克羅非魚TauT2基因組織表達(dá)分析

用qRT-PCR檢測(cè)TauT2基因在莫桑比克羅非魚13個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示TauT2基因在這些組織中均有表達(dá)，其中在血液中表達(dá)量最高，其次是眼、脾、腎、卵巢、腦、心、皮、鰓、胃、肌、肝表達(dá)水平依次降低，在腸中的表達(dá)量最低（圖6）。

圖6 莫桑比克羅非魚TauT2基因在13個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Relative expression of TauT2 gene in 13 tissues of O.mossambicus

2.4 鹽堿脅迫下莫桑比克羅非魚鰓、腎、腸、肝組織中TauT2基因的表達(dá)分析

如圖7所示，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，鹽堿脅迫條件下，在鰓、腎、腸和肝4個(gè)組織中TauT2基因表達(dá)水平的變化趨勢(shì)均是先顯著上升再顯著下降（P＜0.05，下同），但每個(gè)組織到達(dá)峰值的時(shí)間不同，腎是在24 h達(dá)峰值，鰓和肝在48 h達(dá)峰值，腸則是在72 h達(dá)峰值，各組織在96 h時(shí)與峰值相比均顯著下降。鹽堿脅迫處理至96 h，處理組與對(duì)照組（0 h）相比，TauT2基因表達(dá)量整體表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)。

圖7 鹽堿脅迫下TauT2基因在鰓、腎、腸、肝組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Relative expression level of TauT2 gene in gill，kidney，intestine and liver under saline-alkali stress

3 討論

本研究獲得的莫桑比克羅非魚TauT2基因CDS全長(zhǎng)1881 bp，編碼626個(gè)氨基酸，與已報(bào)道的莫桑比克羅非魚?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)蛋白（tTAUT1）（CDS全長(zhǎng)1890 bp，編碼629個(gè)氨基酸）略有不同。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示其具有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，并在第3和第4跨膜區(qū)域間存在1個(gè)親水環(huán)，同時(shí)在這個(gè)親水環(huán)上具有3個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，與莫桑比克羅非魚的tTAUT1相似，均具有典型的Na+、Cl-依賴型神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)構(gòu)特征，說明本研究中所發(fā)現(xiàn)的莫桑比克羅非魚TAUT2蛋白也是存在于細(xì)胞膜上具有跨膜運(yùn)輸功能的Na+、Cl-依賴型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（鄭偉賢，2012；伍琴，2016）。但莫桑比克羅非魚這2種?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)在細(xì)胞膜外的轉(zhuǎn)角區(qū)域存在結(jié)構(gòu)上的差異，推測(cè)其功能也存在一定差異。將其氨基酸序列與其他8個(gè)物種的?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行同源比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)莫桑比克羅非魚TAUT2蛋白的氨基酸序列與其他物種一致性很高（77.64%~98.72%），說明該蛋白在各個(gè)物種間具有較高的保守性。與此同時(shí)，莫桑比克羅非魚的2種?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)蛋白tTAUT1和TAUT2分別與奧利亞羅非魚的2種?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)蛋白聚為一支，說明在羅非魚體內(nèi)可能至少具有2種序列不同、功能有潛在差異的?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

本研究結(jié)果表明，TauT2基因在莫桑比克羅非魚腦、鰓、腸、腎等13個(gè)組織中均有表達(dá)，與之前研究的TauT基因廣泛表達(dá)于鱸魚（鄭偉賢，2012）、鯽魚（Carassius auratus）（伍琴，2016）、斑馬魚（Danio rerio）（Kozlowski et al.，2008）和羅非魚（Takeuchi et al.，2000）各組織中的結(jié)果相似。但?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)蛋白在不同動(dòng)物體內(nèi)各組織中的表達(dá)量略有不同，如在莫桑比克羅非魚的胃和鰓中tTauT1基因的表達(dá)量遠(yuǎn)高于腎臟（Takeuchi et al.，2000），而本研究發(fā)現(xiàn)莫桑比克羅非魚胃和鰓中TauT2基因的表達(dá)量顯著低于腎。推測(cè)莫桑比克羅非魚體內(nèi)有多種?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)蛋白分子，雖均具有?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)功能，但不同的牛磺酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分子在動(dòng)物體內(nèi)的功能存在一定差異，在不同組織中對(duì)滲透壓具有多個(gè)時(shí)空的細(xì)微調(diào)節(jié)作用。

在鹽堿脅迫下，鰓組織中TauT2基因的表達(dá)水平逐漸上升，至48 h達(dá)峰值，隨后到96 h表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)，與高鹽脅迫下莫桑比克羅非魚鰓中tTauT1基因mRNA表達(dá)水平變化的研究結(jié)果不同，tTauT1基因在6 h達(dá)峰值，隨即表達(dá)水平開始下降（Takeuchi et al.，2000）。魚類鰓組織不僅是主要的離子交換場(chǎng)所，更是直接與養(yǎng)殖水環(huán)境接觸的滲透壓感受器官，處于波動(dòng)的外界水環(huán)境中，魚類鰓組織能較快速啟動(dòng)滲透壓響應(yīng)機(jī)制。本研究中莫桑比克羅非魚直接與高濃度鹽堿溶液接觸，魚鰓受到鹽堿的毒害而損傷，高滲的鹽堿環(huán)境影響了鰓組織泌氯細(xì)胞中Na+-K+-ATPase酶的活性（Velan et al.，2011），由于TAUT2蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)依賴于Na+-K+-ATPase酶，Na+-K+-ATPase酶活性被抑制后，降低了TAUT2蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)效率，促使TauT2基因的上調(diào)表達(dá)，以加強(qiáng)組織的離子調(diào)控功能（Gether et al.，2006；黨云飛等，2012）。隨著處理時(shí)間的增長(zhǎng)，莫桑比克羅非魚逐漸適應(yīng)外界的高滲水環(huán)境，鰓的調(diào)控功能也逐漸恢復(fù)，從而TauT2基因的表達(dá)水平在48 h達(dá)峰值后開始緩慢下降。這與高鹽脅迫下，莫桑比克羅非魚tTauT1基因在鰓中的表達(dá)模式有相似之處，均是先上調(diào)再下降，但tTauT1基因上調(diào)表達(dá)到峰值的時(shí)間為處理后6 h（Takeuchi et al.，2000），比本研究中TauT2基因到達(dá)峰值的時(shí)間早42 h，這可能是由于2種牛磺酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在鹽堿脅迫條件下的響應(yīng)和調(diào)節(jié)功能存在差異。TauT2基因雖響應(yīng)較慢，但卻可更持久地轉(zhuǎn)錄出TAUT2蛋白，2種牛磺酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白共同作用于魚體，可更高效地轉(zhuǎn)運(yùn)Tau，更精細(xì)地調(diào)節(jié)魚體內(nèi)的滲透壓。

腎臟作為魚類的主要排泄器官（劉海燕等，2009；陳德芳等，2013），當(dāng)魚類處于高滲環(huán)境時(shí)，腎臟的反應(yīng)速度較快，腎小管的重吸收功能可起到“保鹽排水”的作用（毛非凡等，2021），所以腎臟作為重要的滲透壓調(diào)節(jié)器官也參與魚類的滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制，并發(fā)揮重要的滲透壓調(diào)控功能。在腎組織中，TauT2基因表達(dá)水平的變化趨勢(shì)也是先升高，在24 h時(shí)達(dá)峰值，然后逐漸下降，TauT2基因在腎組織中對(duì)高鹽堿的響應(yīng)速度比在腸（72 h達(dá)峰值）、鰓和肝（48 h達(dá)峰值）中快。組織表達(dá)研究結(jié)果表明，腸組織中TauT2基因的表達(dá)量最低，但腸道作為魚類主要的消化吸收?qǐng)鏊矃⑴c機(jī)體的滲透壓調(diào)節(jié)活動(dòng)。海水魚可通過腸道吸收液體來緩解因?yàn)楦邼B環(huán)境造成的脫水，馬加迪羅非魚（Oreochromis alcalica）通過吞飲湖水和鰓泌鹽來維持體內(nèi)滲透壓穩(wěn)態(tài)（Wood et al.，2007；Whittamore，2012）。雖然腸參與滲透壓調(diào)節(jié)過程，但其反應(yīng)速度較慢，在本研究中72 h時(shí)才達(dá)峰值，對(duì)此也有研究認(rèn)為腸在機(jī)體滲透壓調(diào)控中起作用，但其調(diào)控作用可能不及鰓和腎組織（Grosell and Taylor，2007）。肝臟作為魚類重要的代謝器官，主要作用是參與蛋白質(zhì)的合成，糖、脂肪及藥物和毒物的代謝，并參與免疫和應(yīng)激調(diào)節(jié)等（韓冉和周俊英，2011；陳德芳等，2013），在魚類受到滲透壓脅迫初期，對(duì)與滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及在此過程中所消耗的能量需求均會(huì)增加（Hwang et al.，2011；Kang et al.，2012），同時(shí)鹽堿為魚體帶來的毒性效應(yīng)，均需肝臟進(jìn)行一系列復(fù)雜的應(yīng)答反應(yīng)，所以肝臟在魚類的滲透壓調(diào)節(jié)過程中扮演著必不可少的重要角色。本研究中TauT2基因的表達(dá)水平在肝組織中也呈先上升，48 h達(dá)峰值，然后下降的趨勢(shì)，說明在鹽堿脅迫初期，高滲的鹽堿環(huán)境也促進(jìn)肝臟中TauT2基因的表達(dá)以維持魚體的滲透壓穩(wěn)態(tài)。

由此可見，當(dāng)莫桑比克羅非魚受到鹽堿脅迫時(shí)，莫桑比克羅非魚體內(nèi)通過提高TauT2基因的表達(dá)水平來進(jìn)行滲透壓的調(diào)節(jié)，以此適應(yīng)高滲的鹽堿水環(huán)境，維持自身滲透壓穩(wěn)態(tài)。

4 結(jié)論

莫桑比克羅非魚在受到鹽堿脅迫后，通過提升TauT2基因的表達(dá)量來有效調(diào)控體內(nèi)滲透壓，為滲透壓穩(wěn)態(tài)的維持發(fā)揮作用。莫桑比克羅非魚體內(nèi)至少有2種不同的?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)蛋白，已發(fā)現(xiàn)的這2個(gè)蛋白氨基酸序列、三級(jí)結(jié)構(gòu)及在魚體不同組織中精細(xì)調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透壓的功能存在一定差異。