焦萬明 ，馬 園 ，尹衍峰 ，付 偉 ，賈曉晴 ，馬俊杰 ，丁玉林 ，杜 山 ，王 瑞 *

（1.內(nèi)蒙古阿拉善盟額濟納旗動物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 阿拉善 735400；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；3.濟南市長清區(qū)畜牧獸醫(yī)事業(yè)發(fā)展中心，山東 濟南 250399）

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病（Haemonchosis）是一種由圓線目（Strongylata），毛圓科 （Trachostrongylidae），血矛屬（Haemonchus）的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（Haemonchxs contortus）引起的寄生蟲病[1]。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲是一種小反芻動物的寄生線蟲，分布于世界各地，以寄主血液為食，可導(dǎo)致動物嚴(yán)重貧血甚至死亡[2]。目前，使用胃腸驅(qū)蟲藥仍是針對該病的首選治療手段，但是由于耐藥情況日益嚴(yán)重，迫使我們急需開發(fā)新的藥物或者更好地改進防控策略，如研制寄生蟲疫苗、加強飼養(yǎng)管理等[3]。

近年來，針對寄生蟲病基因工程疫苗的研究已成為熱點，其中選擇合適且能夠刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的抗原蛋白是關(guān)鍵因素之一。目前，針對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病研制的重組抗原疫苗所進行的免疫試驗均未取得理想效果[4]。新發(fā)現(xiàn)的Hc-dhs-28蛋白是Ce-dhs-28蛋白的同系物，Ce-dhs-28蛋白是氧化循環(huán)中的關(guān)鍵酶，該蛋白質(zhì)含有短鏈脫氫酶結(jié)構(gòu)域和過氧化物酶體靶向信號。研究發(fā)現(xiàn)Hc-dhs-28蛋白最有可能作為第3種3-羥?；o酶A脫氫酶參與過氧化物酶體脂肪酸B的氧化，從而調(diào)節(jié)與滯育相關(guān)的信息素的產(chǎn)生，進而影響捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的滯育形成[5-6]。

本研究利用生物信息學(xué)工具及在線分析軟件對Hc-dhs-28蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能等進行分析，進而確定Hc-dhs-28抗原的B細(xì)胞表位，為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病的進一步免疫診斷和疫苗研制提供參考信息。

1 材料與方法

1.1 目的基因信息

在GenBank上獲取捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc-dhs-28基因序列，編碼438個氨基酸（序列號：AVP73885.1）。

1.2 試驗方法

蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析：通過Expasy軟件中Protparam在線工具分析蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)[7]。跨膜結(jié)構(gòu)域、親疏水性和信號肽預(yù)測：采用TMHMM Server v.2.0、Signa1P4.1Server和 ProScale在線工具對蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域、親疏水性和信號肽進行預(yù)測[8-9]。磷酸化和亞細(xì)胞定位預(yù)測：通過NetPhos和PSORT Ⅱ在線工具對蛋白質(zhì)的磷酸化位點和亞細(xì)胞定位進行預(yù)測[10]。二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測：使用SOPMA和Phyre2在線分析軟件對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)分析并建模[11]。B細(xì)胞表位預(yù)測：使用IEDB Analysis Resource在線工具預(yù)測B細(xì)胞表位[12]。具體網(wǎng)址如表1所示。

表1 在線工具及網(wǎng)址

2 結(jié)果與分析

2.1 理化性質(zhì)

Hc-dhs-28蛋白的氨基酸組成見表2。Hc-dhs-28蛋白由438個氨基酸組成，其中占比最高的氨基酸為丙氨酸 （Ala，10%）。 蛋白分子式為 C2088H3339N569O640S17，相對分子質(zhì)量為47198.93，理論等電點為8.77，帶負(fù)電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）為46個，帶正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）為51個。預(yù)測的半衰期為30h（哺乳動物體內(nèi)），脂溶指數(shù)為86.57，親水性總平均值為-0.169，脂肪指數(shù)為85.53，不穩(wěn)定性指數(shù)為32.32，判定該蛋白為穩(wěn)定蛋白。

表2 Hc-dhs-28蛋白的氨基酸組成表

2.2 跨膜結(jié)構(gòu)域、親疏水性和信號肽預(yù)測結(jié)果

Hc-dhs-28蛋白跨膜區(qū)分析結(jié)果如圖1所示。如果蛋白質(zhì)包含跨膜區(qū)，則它可作為膜受體發(fā)揮作用，或是位于膜上的錨定蛋白和離子通道蛋白[13]。由TMHMM軟件分析可知，Hc-dhs-28蛋白預(yù)測結(jié)果均位于膜外，不存在跨膜結(jié)構(gòu)域。

圖1 Hc-dhs-28蛋白跨膜區(qū)分析結(jié)果

Hc-dhs-28蛋白親疏水性分析結(jié)果如圖2所示。多肽鏈的親疏水性在維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定中具有十分重要的作用。由ProScale軟件分析可知，Hc-dhs-28蛋白的平均親水性系數(shù)（GRAVY）為-0.169，該蛋白存在的親水性氨基酸數(shù)量>疏水性氨基酸數(shù)量，最大值為2.256，位于第139位（Lys），具有較強的疏水性。親水性最小值為-2.544，位于第348位（Ile），具有較好的親水性，分析該蛋白為親水蛋白。

圖2 Hc-dhs-28蛋白親疏水性分析結(jié)果

Hc-dhs-28蛋白信號肽分析結(jié)果如圖3所示。采用Signa1P軟件分析Hc-dhs-28蛋白是否存在信號肽，根據(jù)預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該蛋白無信號肽存在，表明其為非分泌型蛋白。

圖3 Hc-dhs-28蛋白信號肽分析結(jié)果

2.3 磷酸化和亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果

Hc-dhs-28蛋白磷酸化分析結(jié)果如圖4所示。蛋白質(zhì)磷酸化是一種翻譯后修飾，磷酸化主要集中在Tyr、Thr和Ser殘基上，這些殘基具有游離羥基且不帶電荷。經(jīng)過磷酸化后的蛋白質(zhì)帶電荷，使得其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，并由此導(dǎo)致蛋白質(zhì)活性的改變[14]。通過NetPhos3.1在線工具分析得知，Hc-dhs-28氨基酸序列含有43個磷酸化位點，分別為24個絲氨酸、14個蘇氨酸和5個酪氨酸位點。采用PSORT Ⅱ在線工具對蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示該蛋白可能主要在線粒體上發(fā)揮生物學(xué)作用。

圖4 Hc-dhs-28蛋白磷酸化分析結(jié)果

2.4 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

Hc-dhs-28蛋白二級結(jié)構(gòu)結(jié)果如圖5所示。使用SOPMA軟件預(yù)測Hc-dhs-28蛋白的二級結(jié)構(gòu)，α-螺旋占比最高為39.95%，β-轉(zhuǎn)角占比最少為7.31%，無規(guī)則卷曲占比34.47%，β-折疊占比18.26%。α-螺旋和β-折疊被認(rèn)為是蛋白的骨架區(qū)域，由于2種結(jié)構(gòu)的特殊性，這2個區(qū)域不利于形成位點。根據(jù)Hcdhs-28蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果，雖然α-折疊占比較高，但是結(jié)合其親疏水性，預(yù)測Hc-dhs-28蛋白上存在多個抗原位點。

圖5 Hc-dhs-28蛋白二級結(jié)構(gòu)結(jié)果

2.5 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

Phyre2是一套可在網(wǎng)絡(luò)上使用的生物信息學(xué)工具，用于預(yù)測和分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能和突變[11]。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測的準(zhǔn)確性關(guān)鍵取決于查詢序列和模板序列之間的相似性，如果待檢測的模板與查詢的序列同一性大于30%，那么通常大部分或全部比對將是準(zhǔn)確的，并且由此產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)元素在模型中的相對位置將是可靠的。低于這個序列同一性水平，Phyre通常會進行自行匹配。如果置信度匹配度高于90%，模型的整體折疊可以肯定是正確的，并且模型的結(jié)構(gòu)元素在模型中的相對位置將是趨于準(zhǔn)確的[15]。

Hc-dhs-28蛋白三級結(jié)構(gòu)模型如圖6所示。使用Phyre2軟件預(yù)測Hc-dhs-28蛋白三級結(jié)構(gòu)可知，Hc-dhs-28蛋白模型基于模板c1zbqB_，297個殘基（序列的68%）通過單個最高評分模板以100.0% 的置信度建模。Hc-dhs-28蛋白二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主，其次是β-折疊，與SOPMA預(yù)測二級結(jié)構(gòu)結(jié)果一致。

圖6 Hc-dhs-28蛋白三級結(jié)構(gòu)模型

2.6 B細(xì)胞表面抗原表位預(yù)測

IEDB在線軟件通過6個方面 （線性表位、β-折疊、表面可及性、靈活性、抗原指數(shù)和親水性）的預(yù)測確定蛋白的抗原表位。Hc-dhs-28蛋白的預(yù)測結(jié)果如圖7所示，綜合二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果，去除α-螺旋、β-折疊和疏水區(qū)等不易形成表位的區(qū)域，分析確定了5個B細(xì)胞表位，結(jié)果見表3。

圖7 Hc-dhs-28蛋白B細(xì)胞表位抗原結(jié)果

表3 B細(xì)胞抗原表位預(yù)測結(jié)果

3 討論

開發(fā)針對寄生線蟲的商業(yè)疫苗，一個主要障礙是難以獲得能夠誘導(dǎo)保護性免疫重組形式的保護性抗原。目前，疫苗接種研究受到從寄生蟲提取物中純化的天然蛋白質(zhì)含量低、對寄生蟲材料的需求量大以及這種方法的成本、安全性和倫理考慮的限制，迫切需要發(fā)現(xiàn)特定亞單位疫苗的替代方法[16]。

在世界范圍內(nèi)，家畜寄生線蟲依然是嚴(yán)重危害全球畜牧業(yè)生產(chǎn)的一類疫病。由于寄生蟲病控制目前仍依賴于使用驅(qū)蟲藥，但是寄生蟲抗藥性問題越來越普遍，意味著這種方法可能已不可持續(xù)[17]。雖也有資料報道，氨基乙腈衍生物的出現(xiàn)提供了一種替代方法，但其在使用不到2年的時間里，已有報告稱感染羊的線蟲對這種新型藥物便產(chǎn)生了耐藥性[18]。有研究表明，使用天然蛋白提取物接種疫苗后，對家畜線蟲感染具有顯著的保護作用，證明接種疫苗是可行的[19]。但是目前針對寄生線蟲的基因工程疫苗較少，許多研究都還在試驗階段，因此選擇合適的抗原來制備疫苗變得尤為關(guān)鍵。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的許多抗原被普遍用于防治試驗，但隨著研究的深入，由于蛋白表達(dá)量低、蛋白空間結(jié)構(gòu)折疊出現(xiàn)錯誤以及不能誘導(dǎo)動物機體產(chǎn)生針對蟲體的保護性免疫等原因，需選擇合適的抗原進行表達(dá)[20]。有研究顯示，Hc-dhs-28重組蛋白具有較好的免疫原性，對宿主具有較好的免疫保護效力，是一種潛在的疫苗候選因子，Hc-dhs-28主要在幼蟲自由生活期轉(zhuǎn)錄，在滯育期達(dá)到高峰。在寄生蟲自由生活的早期階段，為進入滯育階段做好準(zhǔn)備而激活滯育形成。這些結(jié)果表明，Hc-dhs-28蛋白可能參與滯育的形成[21-22]。

本文分析了Hc-dhs-28蛋白理化特性、結(jié)構(gòu)和抗原表位，顯示Hc-dhs-28蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，為親水性、非分泌型的穩(wěn)定蛋白，存在磷酸化位點，主要在線粒體發(fā)揮其生物學(xué)作用。進一步通過生物信息學(xué)工具預(yù)測結(jié)合其二級結(jié)構(gòu)，確定了5個B細(xì)胞優(yōu)勢表位。這些結(jié)果表明，Hc-dhs-28蛋白有很好的應(yīng)用價值，具有作為抗原的潛質(zhì)，表明后期可選擇其合適的短肽進行表達(dá)，深入分析該蛋白的功能，為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的高效安全防控提供理論依據(jù)。