■楊 闖 郭勇慶 王明月 高沖亞 孫寶麗

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642）

草食動物能夠?qū)㈦y以消化的植物纖維通過胃腸道發(fā)酵轉(zhuǎn)化成可利用的能量形式，這與棲息于它們瘤胃中數(shù)以萬億計的微生物作用密不可分。厭氧真菌（anaerobic fungi，AF）廣泛存在于反芻動物瘤胃中，因此被習(xí)慣性地稱為瘤胃真菌，由于后期在馬、牛等腸道也發(fā)現(xiàn)了同樣的厭氧真菌，因此，瘤胃厭氧真菌這一稱呼也逐漸被腸道厭氧真菌（anaerobic gut fungi，AGF）所替代。AGF被認(rèn)為是重要的瘤胃功能性微生物，這主要是由于它們可以作為植物飼料高效的降解劑，雖然AGF在胃腸道中僅占微生物總量的7%～9%，卻能從植物性飼料中釋放出超過50%的發(fā)酵糖類物質(zhì)。AGF 能夠產(chǎn)生各種形式的水解酶作用于植物纖維，使得它們成為植物性飼料消化的發(fā)起者，因而具有極高應(yīng)用價值。然而，迄今為止，AGF 在現(xiàn)實中的應(yīng)用并不是太理想，這主要是由于AGF 對氧高度敏感，使得無論是運輸或是保存都成為令人頭疼的問題。因此，優(yōu)化分離培養(yǎng)以及保存技術(shù)在開發(fā)AGF利用價值方面顯得格外重要。文章擬從AGF 菌株已鑒定屬類現(xiàn)狀、分離培養(yǎng)和保存技術(shù)以及AGF現(xiàn)階段的應(yīng)用潛力情況做簡單綜述，以期能夠為相關(guān)科研人員在AGF探究過程中提供一些啟發(fā)與幫助。

1 AGF的研究發(fā)展及形態(tài)學(xué)特征

AGF發(fā)現(xiàn)過程經(jīng)歷多個階段，其種屬的分類也隨著生命科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步發(fā)生了不小的變化。1912年，相關(guān)研究在瘤胃中發(fā)現(xiàn)了AGF的存在，觀測發(fā)現(xiàn)這種新微生物具有多鞭毛的結(jié)構(gòu)，但受限于當(dāng)時的技術(shù)，并未將這種新發(fā)現(xiàn)的微生物歸類為真菌，而是歸類為原蟲，并命名為Callimastix cyclops；1913 年，相關(guān)研究在瘤胃中發(fā)現(xiàn)了在形態(tài)結(jié)構(gòu)上類似的“原蟲”，并將其命名為Callimastix frontalis；直到1975 年Orpin（1975）將C. frontalis重新培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其具有真菌的特性，并將其重新命名為Neocallimastix frontalis，歸類為藻菌綱（Phycomycetes）。至此，人們開始使用真菌的研究方式來探索AGF的奧秘。Orpin（1977）在該類生物細(xì)胞壁中發(fā)現(xiàn)了幾丁質(zhì)成分的存在，Barr（1988）認(rèn)為該類微生物不應(yīng)為藻菌類生物，而是真正的真菌，重新將該類生物歸類為壺菌綱（Chytridiomycetes）。隨著分子生物學(xué)的興起，AGF 的分類更加細(xì)化。通過對核糖體RNA操縱子與蛋白質(zhì)編碼等基因以及其代謝特性進(jìn)行分析，使得AGF以一個新的門類獨立出來，形成新毛菌門（Neocallimastigomycota）。自1975 年首次確定AGF 后的40 年里，僅有6 個屬為人們所鑒定與命名。隨著鑒定技術(shù)的發(fā)展以及AGF 在植物細(xì)胞降解過程中的價值逐漸為人們所重視，近些年來，不斷有新的AGF屬類被鑒別與命名，且大多來源于野生反芻動物。

AGF的形態(tài)學(xué)特征是其屬類劃分的重要依據(jù)，根據(jù)Mountfort 在1994 年所描述的方式，屬類劃分在形態(tài)學(xué)方面的標(biāo)準(zhǔn)主要根據(jù)AGF是單中心或是多中心，假根形態(tài)以及游動孢子的鞭毛特點，而種的劃分需要根據(jù)游動孢子的超微結(jié)構(gòu)來確定。上述所提到屬的形態(tài)學(xué)特點主要涉及的幾個概念如下：首先，單或多中心AGF可根據(jù)真菌形成的孢子囊數(shù)量劃分，單中心（monocentric）AGF 為僅產(chǎn)生1 個（簇）孢子囊，而多中心（polycentric）AGF 則會產(chǎn)生多個（簇）孢子囊，在生長過程中，單中心AGF 的細(xì)胞核不會遷移到假根中，而多中心AGF 的細(xì)胞核會遷移至假根中形成具核假根；其二是假根形態(tài)，絲狀（filamentous）假根AGF 的假根會經(jīng)歷多次分支而形成類似于樹根狀的結(jié)構(gòu)，而球狀假根（bulbous）AGF 的假根會膨大形成球莖狀假根結(jié)構(gòu)；其三為游動孢子的鞭毛特點，根據(jù)游動孢子體表的鞭毛數(shù)量，可分為多鞭毛（polyflflagellate）游動孢子和單鞭毛（uniflflagellate）游動孢子，單鞭毛游動孢子的體表一般有1～4根鞭毛，而多鞭毛游動孢子一般有7～30根鞭毛。目前已分離鑒定的AGF名稱及主要的形態(tài)學(xué)特點如表1所示。

表1 現(xiàn)階段已分離鑒定的菌種

2 AGF分離培養(yǎng)技術(shù)現(xiàn)狀

近5 年來，AGF 被鑒定與命名的數(shù)量快速增加，但這一數(shù)量遠(yuǎn)不足以揭示厭氧真菌在微生態(tài)中的多樣性。AGF 鑒定的起始環(huán)節(jié)是要將菌體從其所處的生態(tài)中分離出來，而后經(jīng)過擴(kuò)增繁殖，才能通過各類方法進(jìn)行鑒定分類。然而，由于AGF的嚴(yán)格厭氧特性且連續(xù)傳代易衰老，在很大程度上限制了AGF 的發(fā)展，遑論其應(yīng)用價值。下面簡要介紹了現(xiàn)階段AGF從樣品采集、分離、培養(yǎng)以及保存與復(fù)蘇方法的研究現(xiàn)狀與注意事項，以期為AGF的分離鑒定以及應(yīng)用價值的探索提供參考。

2.1 AGF樣品的采集與分離

2.1.1 AGF樣品的采集與富集

AGF 的樣品來源主要是反芻動物的糞便以及瘤胃內(nèi)容物，在采集過程中需盡可能裝滿取樣管以排空氧氣，采集后的樣品應(yīng)24 h內(nèi)于冷藏條件下轉(zhuǎn)移至實驗室進(jìn)行分離培養(yǎng)。獲取的樣品需要在厭氧工作臺內(nèi)打開，然后接種于高壓蒸汽處理后的瘤胃液-纖維二糖（rumen-fluid-cellobiose, RFC）培養(yǎng)基內(nèi)39 ℃富集24 h，其中纖維二糖可以使用0.5%的纖維素替代。當(dāng)樣品中AGF 達(dá)到一定數(shù)量后，可將富集好的AGF連續(xù)稀釋5～10倍并分別接種于添加了1∶1纖維素和柳枝稷（Panicum virgatumL.）的厭氧瘤胃液（rumen fluid, RF）培養(yǎng)基內(nèi)，39 ℃培養(yǎng)。由于AGF 常在植物表面定植，且在其生長過程產(chǎn)生的氣體會導(dǎo)致培養(yǎng)基內(nèi)的植物纖維上浮并發(fā)生顏色改變，因此該現(xiàn)象可以作為AGF 的生長旺盛的標(biāo)志，也提示分離的最佳時期，一般72 h 左右出現(xiàn)上述現(xiàn)象。此外，培養(yǎng)基內(nèi)可以加入抗生素以減少細(xì)菌對AGF生長過程中的干擾，Hanafy等（2018）在分離Feramyces austinii時推薦的抗生素組合為50 μg/mL 卡那霉素、50 μg/mL 青霉素、20 μg/mL鏈霉素以及50 μg/mL氯霉素。

2.1.2 亨氏滾管技術(shù)培養(yǎng)AGF

AGF的分離主要采用亨氏厭氧滾管技術(shù)，該方法由Hungate（1969）建立并于1969 年發(fā)表，該方法主要基于銅在高溫條件下與玻璃管腔內(nèi)氧氣反應(yīng)，進(jìn)而制造出厭氧環(huán)境。經(jīng)過處理后的亨氏管管腔內(nèi)的氧氣被消耗殆盡，使用特制耐熱橡膠塞封閉開口后，便人工制造出適合AGF 生長的厭氧環(huán)境。將前文提到的培養(yǎng)完畢的AGF 使用生理鹽水稀釋后與瓊脂培養(yǎng)基（RFC+2%瓊脂）混合，使用無菌注射器接種于除氧后的亨氏管中，平放于滾管機中較低溫度迅速滾動，使得管壁內(nèi)混合AGF與培養(yǎng)基的液體凝固形成薄膜，而后置于39 ℃培養(yǎng)48～72 h，培養(yǎng)物在亨氏管內(nèi)可以長期存活。

2.2 AGF的分離純化與形態(tài)學(xué)觀察

經(jīng)上述方法培養(yǎng)后，可挑取形成的菌落接種于RFC培養(yǎng)基內(nèi)擴(kuò)增，需進(jìn)行至少3輪的純化與亨氏滾管培養(yǎng)以保證所分離菌群的純度，直至所有培養(yǎng)管內(nèi)的菌落形態(tài)一致。菌株需通過每2～3 周一次傳代培養(yǎng)到RFC培養(yǎng)基中進(jìn)行維持。

形態(tài)學(xué)觀察方法可以用來判定所分離的AGF 真菌形態(tài)是否一致，可用于驗證分離的純度。主要使用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡對生長在液體或者固體（加入2%瓊脂來凝固）的RFC 培養(yǎng)基內(nèi)的AGF 進(jìn)行觀察，通過鑒別假根形態(tài)、生長類型以及游動孢子的鞭毛數(shù)量來初步鑒定AGF。使用光學(xué)顯微鏡觀察菌體結(jié)構(gòu)時，可以使用乳酚棉藍(lán)染色，使用激光共聚焦顯微鏡在微分干涉對比（DIC）模式下進(jìn)行觀察。為了使細(xì)胞核在光學(xué)顯微鏡下可視化，可以加入10 μg/mL的4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）并在暗室內(nèi)孵育10 min，洗去多余的DAPI后，將玻片于暗室中風(fēng)干，然后置于4%沒食子酸正丙酯和90%甘油（V/V）的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中。電子顯微鏡觀察菌體結(jié)構(gòu)需將樣品在室溫下使用戊二醛中浸泡，而后使用四氧化鋨固定、多梯度乙醇溶液脫水后干燥，最后使用Au-Pb濺射涂層，置于電子顯微鏡下觀察。

2.3 AGF的保存與復(fù)蘇

根據(jù)Bio-protocol 出版的《微生物組實驗手冊》中所描述，純化后的AGF可使用稻秸培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中稻秸浮起即證明傳代成功。取培養(yǎng)72 h 且稻秸浮起的培養(yǎng)管加入含有5%二甲基亞砜的纖維二糖培養(yǎng)基，并迅速轉(zhuǎn)移至凍存管內(nèi)冰浴5～10 min 后，-80 ℃冰箱過夜，隔天放入液氮進(jìn)行中長期保存。復(fù)蘇時可將凍存管于冰上解凍，而后將解凍后的稻秸置于加入0.1 mL 氯霉素溶液的纖維二糖培養(yǎng)基內(nèi)，39 ℃培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)期間內(nèi)觀察到稻秸浮起且形成菌膜則證明復(fù)蘇成功。

3 草食動物AGF在甲烷生產(chǎn)與反芻動物飼養(yǎng)中的應(yīng)用現(xiàn)狀

3.1 AGF優(yōu)秀的纖維降解作用

在研究的早期人們便發(fā)現(xiàn)，新攝入植物性飼料中血紅素以及卟啉等各類植物成分會促進(jìn)AGF 孢子的釋放，且游動的孢子具有趨化作用，會向可溶性糖或酚酸豐富的區(qū)域聚集，在觀察AGF 對黑麥草的作用時，發(fā)現(xiàn)AGF 會優(yōu)先對植物的氣孔或破損處進(jìn)行侵襲，孢子萌發(fā)后會生長出根狀組織從植物中汲取碳源以供菌體需要。體外試驗也證實AGF 在瘤胃中對植物纖維的降解作用要遠(yuǎn)大于瘤胃中具有纖維降解能力的細(xì)菌。優(yōu)秀的植物纖維降解能力要歸功于AGF所產(chǎn)生的種類廣泛的碳水化合物活性酶（carbohydrate-active enzymes，CAZymes）以及物理穿透能力，AGF的菌絲末端可以產(chǎn)生高濃度的纖維分解酶，這些酶類可以有效地降解植物細(xì)胞的纖維成分，其產(chǎn)物也為生態(tài)內(nèi)的其他微生物提供了養(yǎng)分，因此AGF常被認(rèn)為是植物性飼料降解的發(fā)起者。

AGF在降解纖維的過程中，除了能夠形成多種游離的CAZymes外，還可以產(chǎn)生由各類纖維分解酶以及相關(guān)輔酶形成獨有的纖維復(fù)合酶體（cellulosomes，也稱纖維小體），這種纖維復(fù)合酶體是將多種纖維降解酶與相關(guān)的輔酶打包在一起，從而達(dá)到協(xié)作以高效水解纖維的效果。有研究表明，纖維素復(fù)合酶體的效率是游離狀態(tài)下酶的12 倍。此外，AGF 還可以形成細(xì)胞結(jié)合態(tài)的纖維素復(fù)合酶體，主要位于假根的末端，配合假根的物理穿透能力，可以從多角度對植物細(xì)胞壁進(jìn)行侵襲，以破壞植物細(xì)胞壁，完成纖維的分解過程。Hagen 等（2021）利用分子生物學(xué)手段對AGF 以及纖維分解細(xì)菌的CAZymes進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)瘤胃內(nèi)的細(xì)菌所產(chǎn)生的CAZymes 主要作用于較易分解的半纖維素，而AGF 產(chǎn)生的CAZymes 主要針對難以降解的纖維素進(jìn)行水解，因此二者可能會有互補作用。

3.2 AGF在產(chǎn)甲烷中的應(yīng)用

AGF 優(yōu)秀的纖維降解能力也使得其與產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)生了十分緊密的共存關(guān)系。產(chǎn)甲烷菌同樣嚴(yán)格厭氧，且只能利用一些結(jié)構(gòu)較為簡單的化合物（H2、CO2、HCOOH等）來合成甲烷，并在此過程中產(chǎn)生菌體生長所需要的能量，而AGF的代謝產(chǎn)物剛好可以產(chǎn)生產(chǎn)甲烷菌代謝所需要的大部分原料。產(chǎn)甲烷菌的代謝過程對于瘤胃發(fā)酵有十分重要的作用，他們大量利用氫，通過合成甲烷來消耗電子，維持氫濃度，促進(jìn)纖維降解微生物對植物組織的降解。AGF嚴(yán)格厭氧，細(xì)胞內(nèi)并不含線粒體，而是在細(xì)胞內(nèi)生物隔膜形成的小區(qū)室-氫化酶體中進(jìn)行底物水平磷酸化，進(jìn)而產(chǎn)生代謝所需的ATP。在AGF代謝過程中，蘋果酸和丙酮酸進(jìn)入氫化酶體后會被代謝成為H2、CO2、甲酸和乙酸并產(chǎn)生ATP，而在與產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)更多的蘋果酸與丙酮酸進(jìn)入了氫化酶體，促使產(chǎn)生更多的乙酸和ATP。這樣的現(xiàn)象可能是由于產(chǎn)甲烷菌消耗了H2，而使得氫化酶受到的抑制減弱，促進(jìn)了氫化酶體內(nèi)NAD（P）H 生成H2的途徑，進(jìn)而使得更多碳水化合物被代謝成為乙酸和ATP，促進(jìn)了AGF的生命活動。

AGF與產(chǎn)甲烷菌在瘤胃中共存使得反芻動物成為人為甲烷的重要來源，每年90 Tg（1 Tg=1012g）的甲烷排放量對于全球溫室治理與畜牧業(yè)來說都是一個不可忽視的問題。而AGF 與產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)可以快速將含有大量纖維的植物材料轉(zhuǎn)化為甲烷，在農(nóng)副產(chǎn)品能源開發(fā)領(lǐng)域中大有可為。工業(yè)上的厭氧發(fā)酵大多都存在木質(zhì)素降解能力有限的問題，這是由于木質(zhì)素類材料無論是物理結(jié)構(gòu)還是化學(xué)性質(zhì)都相對穩(wěn)定，因此，生產(chǎn)沼氣的首要步驟是對材料進(jìn)行預(yù)處理。工業(yè)上常規(guī)用于處理木質(zhì)材料的物理化學(xué)方法不但昂貴，而且廢液的處理也是對環(huán)境不小的威脅。而使用AGF 與產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)來發(fā)酵木質(zhì)材料生產(chǎn)甲烷可以很好地代替?zhèn)鹘y(tǒng)物理化學(xué)處理方法，且在復(fù)雜的生物反應(yīng)過程中，能夠更加高效地生產(chǎn)甲烷，且減少了二次污染物的產(chǎn)生。產(chǎn)甲烷菌的存在也可以上調(diào)AGF對CAZymes的表達(dá)量，促進(jìn)其對木質(zhì)素的降解效率。各類報道也證明了AGF 與產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)可以有效地提高甲烷生產(chǎn)效率：Wei等（2016）利用從牦牛體內(nèi)分離的AGF與產(chǎn)甲烷菌進(jìn)行簡單的共培養(yǎng)，分別以小麥秸稈、玉米秸稈以及稻秸作為底物，經(jīng)過7 d 的培養(yǎng)，分別產(chǎn)生了3.00、3.29 mmol/g以及3.15 mmol/g甲烷干物質(zhì)；Shi等（2019）利用AGF 和產(chǎn)甲烷菌的共同培養(yǎng)來降解未經(jīng)蒸汽爆破的玉米秸稈，便可生產(chǎn)出（37.10±1.09）mL甲烷。綜上所述，AGF與產(chǎn)甲烷菌共同接種于植物原料來生產(chǎn)甲烷是一種十分高效的方式且對環(huán)境影響較小，同時也可以解決農(nóng)副產(chǎn)品產(chǎn)量過剩的問題，但分離并篩選高效的AGF 與產(chǎn)甲烷菌組合的研究進(jìn)展較為緩慢，在一定程度上制約了該技術(shù)的發(fā)展。

3.3 AGF在飼料處理及提升反芻動物健康中的作用

如前文所述，AGF可以產(chǎn)生一系列的酶類降解植物纖維，尤其引人注目的是其對木質(zhì)材料等難消化纖維的降解能力，這也使得人們開始考慮應(yīng)用AGF及其酶來改善低質(zhì)量飼料，進(jìn)而提升草食動物對低質(zhì)量飼料的消化率。

資源合理化利用一直是人們的追求，在飼料資源匱乏的地區(qū)，將低質(zhì)量飼料中的能量轉(zhuǎn)化為高質(zhì)量動物蛋白是十分有意義的。AGF的嚴(yán)格厭氧特點，也使得其在青貯貯藏過程中展現(xiàn)出了較大的潛力。Lee等（2015）分離篩選出3種纖維素分解活性高的菌株參與水稻秸稈青貯的發(fā)酵，分別測得10、30、60、90 d 和120 d 的干物質(zhì)損失率以及纖維降解程度，結(jié)果表明AGF 處理后，稻秸青貯干物質(zhì)損失率下降，且纖維降解程度顯著提高；Wang 等（2019）在全株玉米青貯制作過程中以AGF作為添加劑，在發(fā)酵30 d后，發(fā)現(xiàn)接種AGF 提升了全株玉米的干物質(zhì)回收率以及中性洗滌纖維（NDF）與酸性洗滌纖維（ADF）的消化率。然而，利用AGF進(jìn)行飼料開發(fā)也存在著一定的制約，Ravi等（2021）研究了3 種厭氧真菌（Anaeromyces mucronatusYE505,Neocallimastix frontalis27,Piromyces rhizinflatusYM600）對玉米和蘆葦木質(zhì)素纖維水解的影響，并測定干物質(zhì)損失率以及纖維降解程度等指標(biāo)，但遺憾的是，3種不同類型的AGF對玉米以及蘆葦纖維的水解并沒有改善作用，這可能是由于發(fā)酵系統(tǒng)中AGF的存活率較低，提示在利用AGF 開發(fā)飼料的過程中，研究優(yōu)化培養(yǎng)和工藝的重要性。

除飼料開發(fā)外，AGF也可以作為飼料添加劑提升反芻動物健康水平。Piromycessp. FNG5 菌株對反芻動物的益處早在2004年就被證實，其在瘤胃中降解纖維、提高有機物和纖維全腸道消化率的效果也讓人們相信AGF 在飼料添加劑領(lǐng)域具有極大的潛力。但就目前而言，市面上較少甚至沒有真正意義上的AGF飼料添加劑，其原因可能是由于AGF 對氧氣高度敏感，需要人工采用極其迅速的方式令其抵達(dá)瘤胃，現(xiàn)階段的方法（瘤胃插管、混拌后立即飼喂等）僅限于科學(xué)研究，很難大規(guī)模使用。當(dāng)然，也可以采取封裝的方式來降低AGF 與氧氣的接觸，以提高AGF 的存活率，Paul 等（2004）設(shè)計并封裝了Neocallimaastixsp. CF-17，從而減少氧氣對菌體的損害，成功地提高了水牛的生產(chǎn)性能，但封裝的最佳效果只能持續(xù)12 h。雖然使用AGF 作為飼料添加劑工作量巨大且難以規(guī)模化使用，但AGF 仍然是一個未經(jīng)大規(guī)模開發(fā)的寶庫，且大多數(shù)可應(yīng)用的AGF 菌來源于草食動物胃腸道中未馴化的菌種，因此野生反芻動物體內(nèi)的AGF是一個十分有價值的益生菌庫，或許存在著對氧氣具有抗性且極具利用價值的菌種。

4 總結(jié)與展望

盡管AGF 進(jìn)入人們的視野已經(jīng)有百年之久，但受限于技術(shù)水平，直到20 世紀(jì)70 年代人們才對AGF有了較為正確的認(rèn)識，且AGF的高度氧敏感性也使得人們對于AGF 的研究進(jìn)展遠(yuǎn)落后于需氧真菌。近幾年來，特別是2020年以來，被分離并鑒定的AGF數(shù)量急速增加，體現(xiàn)出人們越來越重視AGF重要的應(yīng)用潛力。當(dāng)前，AGF 主要在甲烷生產(chǎn)、飼料處理及提升動物健康中表現(xiàn)出巨大潛力。在甲烷生產(chǎn)方面，AGF與產(chǎn)甲烷菌復(fù)雜的互作關(guān)系可以有效提升甲烷的生產(chǎn)效率，且利用AGF處理發(fā)酵原料是一種對環(huán)境友好的辦法，符合國家可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略。但AGF與產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)還存在著許多制約：首先，AGF與產(chǎn)甲烷菌的具體協(xié)作關(guān)系并不十分明確，其具體的互作機制還有待更深入的研究；此外，AGF 與產(chǎn)甲烷菌的種類繁多，挑選出優(yōu)秀的AGF與產(chǎn)甲烷菌組合對接生產(chǎn)，以提升甲烷生產(chǎn)效率還需要不斷分離與驗證。在飼料處理與動物健康提升方面，已經(jīng)有許多學(xué)者證明AGF能夠有效地促進(jìn)動物的健康養(yǎng)殖、提升飼料利用率，但受限于AGF 高度厭氧的生理特性，導(dǎo)致很少有報道將AGF 真正應(yīng)用于大規(guī)模實際生產(chǎn)之中，AGF封裝技術(shù)或可成為解決其高度厭氧導(dǎo)致難以利用的一個突破口。

就現(xiàn)階段的研究來看，AGF 的應(yīng)用潛力雖然巨大，但其高度厭氧的特性也使我們距AGF的大規(guī)模應(yīng)用仍有很長的路需要探索。對AGF的研究，無論是前文提及的篩選鑒定或是生理機制研究，都要以分離培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)。然而，現(xiàn)今人們對AGF的分離培養(yǎng)技術(shù)尚停留在較為原始的技術(shù)方法，這或許也是雖然AGF 在自然界中存在的數(shù)量、種類繁多，但能為人們所知曉的卻十分稀少的原因之一。因此，推陳出新優(yōu)化并制定出行之有效的分離培養(yǎng)方案，或成為了探索AGF 奧秘的首要任務(wù)。近些年來，雖然人們已經(jīng)對AGF 的進(jìn)化、生物學(xué)特性，以及生態(tài)學(xué)領(lǐng)域方面均有了進(jìn)一步了解，但諸如AGF為何高度厭氧？AGF為何能夠產(chǎn)生獨有的纖維小體等？這些疑問讓我們認(rèn)識到人們對于AGF的了解仍然僅是冰山一角，但或許這些問題的答案在未來被揭曉時，AGF分離培養(yǎng)等方面的技術(shù)難題便能夠真正被破解，進(jìn)而使得AGF真正體現(xiàn)出其巨大的應(yīng)用價值。