■陳 燕 王湘君 陳 文 匡浩宇 周 琪 王偉康 陳 冰

（1.海南熱帶海洋學(xué)院，海南三亞 572022；2.海南省熱帶海洋漁業(yè)資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南三亞 572022；3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，廣東廣州 510640）

魚類是優(yōu)質(zhì)食物蛋白源，能為人體各階段生長發(fā)育提供所需的營養(yǎng)物質(zhì)?；谒a(chǎn)養(yǎng)殖的快速發(fā)展和魚粉供應(yīng)的日益短缺，用價(jià)廉、質(zhì)量高的動(dòng)植物蛋白源替代水產(chǎn)飼料中昂貴的魚粉是保護(hù)海洋漁業(yè)資源和確保海洋生物可持續(xù)發(fā)展的重要途徑。黑水虻（Hermetia illucens, Black sodier fly meal, BSFL）是一種以腐食性生物（如畜禽的糞便、生活垃圾等）為食的，能將廢物轉(zhuǎn)化為富含氨基酸和脂肪酸的優(yōu)質(zhì)昆蟲蛋白，具有繁殖周期短、生長迅速、世代間隔短、飼養(yǎng)簡單的優(yōu)點(diǎn)，國內(nèi)外新型流行的飼料用蛋白源[1]。與魚粉相比，黑水虻含有與魚粉必需氨基酸模式相似的多種必需氨基酸，且其中的蛋氨酸、亮氨酸和賴氨酸的含量較高，還富含不飽和脂肪酸和必需脂肪酸，特別適合于替代水產(chǎn)飼料中的魚粉[2-3]（見表1、表2）。

表1 黑水虻幼蟲和魚粉之間必需氨基酸的比較(mg/g)[2-3]

表2 黑水虻幼蟲中不飽和脂肪酸的含量(%)[2-3]

魚類腸道微生物被認(rèn)為對(duì)宿主的生命活動(dòng)起重要的作用，其中的有益菌屬可通過改善宿主的免疫、營養(yǎng)吸收和內(nèi)環(huán)境等來促進(jìn)宿主生長發(fā)育[4-8]。魚類腸道菌群結(jié)構(gòu)受水體環(huán)境[4]、攝食類型[5]、發(fā)育階段[6]、營養(yǎng)生物節(jié)律[7]等因素的影響。宏基因組學(xué)（Metagenomics）即微生物環(huán)境基因組學(xué)，研究手段有全宏基因組技術(shù)和16S rRNA 片段擴(kuò)增技術(shù)。物種間16S rRNA 序列既有高變區(qū)（V 區(qū)，物種之間有差異）也有保守區(qū)（物種之間高度相似），其中的V4～V5區(qū)特異性好，數(shù)據(jù)庫信息全，是細(xì)菌多樣性分析注釋的最佳選擇。因此，16S rRNA 也被稱為細(xì)菌系統(tǒng)分類研究中最常用的和最有用的分子鐘。前期試驗(yàn)已經(jīng)采用不同比例的黑水虻替代魚粉研究對(duì)石斑魚的影響，篩選出黑水虻和魚粉的最佳比例，建立了針對(duì)養(yǎng)殖石斑魚的飼料配方。豹紋鰓棘鱸（Plectropomus leopardus），隸屬于石斑魚亞科，其肉質(zhì)細(xì)膩、營養(yǎng)全面，且體色艷麗，是一種具有較高的營養(yǎng)、經(jīng)濟(jì)和觀賞價(jià)值的海水魚類。日常生活中，豹紋鰓棘鱸體色與其經(jīng)濟(jì)價(jià)值和觀賞價(jià)值密切相關(guān)，故對(duì)該種魚的體色進(jìn)行研究很有實(shí)際意義。迄今，關(guān)于魚類體色的研究已有一些報(bào)道[9-10]，但涉及豹紋鰓棘鱸的研究不多。

蝦青素是一種3, 3-二羥基-4, 4′-二酮基-β,β′-胡蘿卜素，呈亮紅色橙色，由一些植物、微藻和微生物合成[11]。天然蝦青素主要來源于雨生紅球藻[12]。蝦青素因其抗氧化力和多種生物功能(如皮膚或皮膚色素沉著、增強(qiáng)免疫力、緩解壓力以及對(duì)生長性能和生存的積極影響)，作為飼料添加劑廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[9-10，13-15]。關(guān)于在昆蟲蛋白和魚粉最佳配比基礎(chǔ)下添加蝦青素對(duì)豹紋鰓棘鱸膚體色、肌肉組織形態(tài)和腸道菌群的影響尚未見報(bào)道。

本試驗(yàn)以豹紋鰓棘鱸為研究對(duì)象，探究在最佳的昆蟲蛋白源和魚粉配比的基礎(chǔ)飼料中添加不同水平蝦青素對(duì)其體色、肌肉組織結(jié)構(gòu)和腸道微生物的影響，進(jìn)而為豹紋鰓棘鱸養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 飼料配方和養(yǎng)殖試驗(yàn)

按照豹紋鰓棘鱸的營養(yǎng)需求，其配合飼料中的蛋白質(zhì)源由魚粉（FM）和黑水虻幼蟲粉提供，脂肪源為魚油和大豆油，小麥粉為碳水化合物源，按前期研究結(jié)果設(shè)計(jì)基礎(chǔ)飼料配方（見表3），分別向基礎(chǔ)飼料中添加0、0.025%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%的蝦青素配制了6 種等氮等能的飼料，標(biāo)記為D 0、D 0.025%、D 0.05%、D 0.10%、D 0.15%、D 0.20%組。試驗(yàn)所用蝦青素由德國巴斯夫（BASF）中國有限公司提供，蝦青素主要提取于雨生紅球藻，濃度為10%。

表3 試驗(yàn)飼料組成及主要營養(yǎng)水平（干物質(zhì)組成）

豹紋鰓棘鱸飼養(yǎng)試驗(yàn)在海南陵水德林誠信水產(chǎn)有限公司基地室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中開展。商業(yè)飼料每天喂食2 次，暫養(yǎng)2 周。正式試驗(yàn)開始后，禁食24 h，然后540 條魚將隨機(jī)分布在室內(nèi)海水循環(huán)系統(tǒng)（500 L/箱、30 尾/箱），3 個(gè)重復(fù)組。每日投喂2 次（上午08：00；下午16：00），并記錄日攝食量和死亡數(shù)。每周進(jìn)行1次海水交換（30%的系統(tǒng)容量）。在整個(gè)試驗(yàn)過程中，使用便攜式多探頭水表監(jiān)測水質(zhì)，其中溶氧保持7.0 mg/L以上，水溫28.0～29.0 ℃。

1.2 樣品收集和指標(biāo)測定

養(yǎng)殖周期結(jié)束后，每個(gè)養(yǎng)殖箱隨機(jī)抓取10 尾豹紋鰓棘鱸，用MS-222 對(duì)取樣的魚進(jìn)行麻醉。使用濾紙吸干豹紋鰓棘鱸體表水分，然后選用CR-400 色彩色差計(jì)測量魚類體色，分別檢測豹紋鰓棘鱸的背部和腹部的亮度（L*）、紅色（a*）和黃色（b*）。

測定魚類體色后，冰上解剖，摘取豹紋鰓棘鱸背部、腹部皮膚和肌肉測定總類胡蘿卜素含量?？傤惡}卜素測定方法按照陳秀梅[16]所述的方法。

類胡蘿卜素含量（F，mg/kg）=[（吸光值×常數(shù)（104）×提取液體積（mL）]/[（吸光系數(shù)（2 500）×樣品濕重（g）]

1.3 組織切片制作及觀察

按以上同樣的方法，摘取養(yǎng)殖魚背部肌肉，并切成1 cm×1 cm左右的塊狀并用4%多聚甲醛固定。采用蘇木精-伊紅（H.E.）染色法進(jìn)行染色[按照病理實(shí)驗(yàn)檢測SOP 程序進(jìn)行修剪、脫水、包埋、切片、染色、封片）并于全景切片掃描儀[3DHISTECH（Hungary），PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000]和正置白光拍照顯微鏡（Nikon，Japan，Eclipse Ci-L）進(jìn)行圖片采集。

1.4 16S rRNA基因測序

按以上同樣的方法將魚麻醉并于冰上解剖，每個(gè)養(yǎng)殖缸隨機(jī)抓取5尾魚于無菌條件下將致死的豹紋鰓棘鱸腸道內(nèi)的樣品擠出，腸道樣品-80 ℃冷凍備用。使用DNA提取試劑盒從樣本中提取DNA，使用Power Soil DNA Isolation Kit（MoBio）檢測DNA 濃度。采用包含“CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT”序列的上游引物和包含“GGACTACNVGGGTWTCTAATCC”序列的下游引物擴(kuò)增V3 和V4 區(qū)。通過高通量測序?qū)?6S rRNA基因V4～V5區(qū)進(jìn)行分析并對(duì)腸道細(xì)菌群落進(jìn)行表征。基于數(shù)據(jù)均一化后的OTU物種豐度譜，再對(duì)OTU 進(jìn)行豐度、多樣性指數(shù)等分析，同時(shí)對(duì)物種注釋，在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析（見圖1）。

圖1 16S rRNA基因測序流程

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦青素對(duì)豹紋鰓棘鱸皮膚色度值的影響（見表4）

從表4中可見，蝦青素使豹紋鰓棘鱸的背部和腹部體色L*值變?。ǜ共緿 0.10%組除外），但背部D 0.15%組L*值與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05），而腹部D 0.10%組L*值顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），說明D 0組（對(duì)照組）的魚背部和腹部體色除背部D 0.15%組和腹部D 0.10%組除外較其他各組的要明亮。蝦青素能使豹紋鰓棘鱸的體色a*值變大，即D 0.20%組的豹紋鰓棘鱸體表紅色比D 0組（對(duì)照組）的更明顯，尤其對(duì)D 0.10%組和D 0.15%組的腹部影響更大。蝦青素能使豹紋鰓棘鱸的體色b*值變大，即飼料中添加不同水平蝦青素比D 0組（對(duì)照組）能使豹紋鰓棘鱸的體色呈現(xiàn)黃色，尤其對(duì)D 0.10%組和D 0.15%組的腹部影響最大。總體而言，D 0.10%組和D 0.15%組蝦青素對(duì)豹紋鰓棘鱸體色a*值和b*值影響最為明顯。

表4 蝦青素對(duì)豹紋鰓棘鱸皮膚色度值的影響

2.2 蝦青素對(duì)豹紋鰓棘鱸背部、腹部和肌肉總類胡蘿卜素含量的影響（見表5）

表5 蝦青素對(duì)豹紋鰓棘鱸背部、腹部皮膚和肌肉總類胡蘿卜素含量的影響（mg/kg）

從表5可以看出，隨著飼料中不同水平蝦青素的添加，背部、腹部和肌肉總類胡蘿卜素含量均與對(duì)照組存在顯著性差異（P＜0.05），其中D 0.10%組和D 0.15%組的豹紋鰓棘鱸背部、腹部和肌肉總類胡蘿卜素含量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.3 蝦青素對(duì)豹紋鰓棘鱸肌肉組織結(jié)構(gòu)的影響（見圖2）

由圖2可知，a～f和A～F分別對(duì)應(yīng)是D 0、D 0.025%、D 0.05%、D 0.10%、D 0.15%組和D 0.20%組豹紋鰓棘鱸肌肉組織結(jié)構(gòu)在40×和400×放大倍率下的觀察。飼料中添加不同水平的蝦青素對(duì)豹紋鰓棘鱸肌肉組織結(jié)構(gòu)無顯著性影響。各組組織切片顯示肌肉切面可見肌細(xì)胞邊界清晰、排列整齊、走形一致，高倍下的肌細(xì)胞橫紋清晰，未出現(xiàn)變性和壞死；未看見結(jié)締組織的增生與炎性細(xì)胞的浸潤。

圖2 蝦青素對(duì)豹紋鰓棘鱸肌肉組織結(jié)構(gòu)的影響

2.4 蝦青素對(duì)豹紋鰓棘鱸腸道菌群的影響

2.4.1 下機(jī)數(shù)據(jù)處理（見表6）

采用Illumina MiSeq/HiSeq 測序平臺(tái)得到的下機(jī)數(shù)據(jù)（Raw Data）經(jīng)過數(shù)據(jù)拆分、去引物序列、PE Reads 拼接、Tags 質(zhì)量及長度過濾和截取以及去嵌合體后獲得最終的有效數(shù)據(jù)（Effective Tags），具體的數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表6?；贠TU的絕對(duì)豐度及注釋信息，將各組數(shù)據(jù)進(jìn)行不同分類水平[界（Kingdom），門Phylum，綱（Class），目（Order），科（Family），屬（Genus），種（Species）]展示，可精確到“屬”水平。

表6 數(shù)據(jù)預(yù)處理統(tǒng)計(jì)及質(zhì)控

2.4.2 腸道微生物的變化

圖3為豹紋鰓棘鱸腸道提取物測序統(tǒng)計(jì)各分類水平的物種在每個(gè)樣本中的相對(duì)豐度，圖3a，圖3b，圖3c、圖3d、圖3e分別為各分類水平腸道菌群的直方圖。門級(jí)水平上前6種優(yōu)勢菌群（相對(duì)豐度＞1%）為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、螺旋菌門（Spirochaetes）、OD1菌門，其中前4種為主要的菌群。各組魚腸道菌群（前4種）分別占比：D 0組：55%、15%、6%、6%；D 0.025%組：39%、24%、7%、26%；D 0.05%組：31%、24%、15%、11%；D 0.10%組：37%、32%、8%、8%；D 0.15%組：38%、30%、11%、9%；D 0.20%組：29%、39%、15%、9%（見表7）。屬級(jí)水平的屬科有15種，其中屬于變形菌門的有5種，分別是寡養(yǎng)單細(xì)胞屬（Stenotrophomonas）、青枯菌屬（Ralstonia）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobater）、假單胞菌屬（Pseudomnas）；屬于厚壁菌門的有6種，分別是乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、顫螺旋菌屬（Oscillospira）、嗜胨菌屬（Pepeoniphilus）、Allobaculum菌屬、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）；屬于擬桿菌門的有普氏菌屬（Prevotella）、Sediminibacterium菌屬、類桿菌屬（Bacteroides）；放線菌門的有棒狀桿菌屬（Corynetobacterium）。其他菌群如放線菌門（Actinobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、藍(lán)菌門（Cyanobacteria）等，這些菌群組成復(fù)雜繁多故不一一例舉。

表7 豹紋鰓棘鱸腸道微生物門級(jí)對(duì)比(%)

圖3 豹紋鰓棘鱸腸道提取物測序物種的相對(duì)豐度

3 討論

在本試驗(yàn)條件下，添加蝦青素D 0.10%組和D 0.15%組豹紋鰓棘鱸背部和腹部的紅色值和黃色值最大，顯著高于D 0 組，促使其背部和腹部變紅；此外，D 0.15%、D 0.20%組豹紋鰓棘鱸背部、腹部和肌肉中類胡蘿卜素含量也最高，顯著高于對(duì)照組。研究表明，在黃顙魚[16]、大鱗副泥鰍[17]、金曼龍魚（Trichogaster microlepis）[16]、東星斑[18]、錦鯉（Cyprinus carpioL.）[19]和血鸚鵡[20]飼料中添加100～200 mg/kg 的蝦青素顯著改善了體色。在金曼龍魚中研究發(fā)現(xiàn)，色素主要沉積在魚皮、魚鱗和魚鰭表面[16]。目前，國內(nèi)關(guān)于蝦青素在不同魚類的研究中，會(huì)因蝦青素的來源和蝦青素的計(jì)量單位不同（飼料中），其結(jié)果會(huì)有差異。但就有效成分而言，試驗(yàn)設(shè)計(jì)的青蝦素含量基本在0～300 mg/kg 范圍（有效成分）或0～0.3%（占飼料的百分比）。本試驗(yàn)中所用的蝦青素來源于雨生紅球藻源（10%），且為飼料中的含量，按有效成分計(jì)算本研究結(jié)果與以上試驗(yàn)結(jié)果一致（100～150 mg/kg）。

魚類的背部和腹部肌肉部分是給人體提供優(yōu)質(zhì)蛋白源的主要可食部分，其中的著色是大多數(shù)消費(fèi)者所青睞之處，比如人們偏愛蝦青素含量高的粉紅色的三文魚肉。大多數(shù)水產(chǎn)動(dòng)物及動(dòng)物組織的顏色歸因于各種類胡蘿卜素的存在[21]。在大西洋鮭魚飼料中添加88.6 mg/kg 蝦青素增加了鮭魚肌肉中的色素沉著[22]。在虹鱒魚飼料中添加蝦青素含量從0 增加到27.6 mg/kg，導(dǎo)致肌肉中總類胡蘿卜素含量和肌肉色度值增加。隨著蝦青素含量從27.6 mg/kg 增加到46.1 mg/kg，總類胡蘿卜素含量和色度值沒有明顯增加[23]。體色是魚類的重要遺傳性狀之一，除了受外界因素（如外源性添加劑）的影響外，還受到生理狀態(tài)以及體色基因（如SOX10和MITF基因）的調(diào)控的影響。在對(duì)大鱗副泥鰍的研究結(jié)果表明，SOX10和MITF在大鱗副泥鰍皮膚和肌肉中均表達(dá)，且飼料中添加150 mg/kg蝦青素對(duì)各組大鱗副泥鰍皮膚和肌肉組織中SOX10和MITE基因表達(dá)量均有顯著性影響[24]。本研究中未涉及相關(guān)調(diào)控基因的測定，是否也存在以上類似的現(xiàn)象，有待進(jìn)一步研究分析。綜上所述，100～200 mg/kg蝦青素添加于魚類飼料中有助于體色中紅色色澤的改善。然而，當(dāng)飼料中添加超過一定水平的蝦青素，體色色度值將沒有明顯增加，主要的原因可能是過量的蝦青素不能被魚類所充分吸收，故不能被沉淀[23]。

腸道中的微生物菌落和代謝產(chǎn)物直接宿主的營養(yǎng)、能量的吸收和代謝、腸道免疫功能等。在本試驗(yàn)中，Illumina MiSeq/Hiseq 測序平臺(tái)用于研究豹紋鰓棘鱸腸道菌群組成，不同蝦青素對(duì)豹紋鰓棘鱸腸道菌群豐度影響較高的4 種菌門分別是變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門，這與對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰、銀鯽和異育銀鯽腸道優(yōu)勢菌群的研究結(jié)論一致[25]。變形菌門是細(xì)菌中最大的菌門，大部分病原菌（如霍亂弧菌、大腸桿菌、幽門螺桿菌、沙門氏菌等）都屬于變形菌門。研究顯示，導(dǎo)致生物功能障礙和疾病風(fēng)險(xiǎn)增加的有可能是變形菌門。放線菌門是水生和陸地生態(tài)系統(tǒng)中普遍存在的最大細(xì)菌門之一，具有較高的G+C含量[26]，并且一直是新型抗生素的極佳來源，屬于潛在益生菌。厚壁菌門中的某些細(xì)菌在促進(jìn)腸道中纖維素分解和多糖發(fā)酵中起重要作用[27]，通過這樣的方式可以提高機(jī)體的免疫力[28]。擬桿菌屬被認(rèn)為是宿主腸道中重要的微生物，可降解碳水化合物，例如多糖和蛋白質(zhì)[29]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著飼料中添加的蝦青素的增加，變形菌門豐度在降低，說明飼料中添加適量的蝦青素有助于提高魚體的抗病力；而厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門這3種菌門豐度隨著飼料中的蝦青素水平的增加而增加，其中厚壁菌門、擬桿菌門在D 0.20%組時(shí)豐度達(dá)到最大，放線菌門隨飼料中蝦青素水平的增加，D 0.025%～D 0.20%組的放線菌門豐度均高于對(duì)照組，且在D 0.025%組時(shí)豐度達(dá)到最大。因此可見，豹紋鰓棘鱸魚養(yǎng)殖過程中在其飼料中添加蝦青素會(huì)改變其腸道菌群，在蝦青素添加量為0.20%時(shí)影響最大。

研究表明，在虹鱒（Oncorhynchus mykiss）養(yǎng)殖中用適量黑水虻幼蟲喂養(yǎng)，改變了虹鱒的腸道菌群和食糜有關(guān)的菌群，提升了虹鱒腸道有益菌群的增加，改變有益菌群的多樣性[30-31]。綜上所述，應(yīng)用黑水虻替代養(yǎng)殖過程的魚粉對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的機(jī)體健康和生長并無不良影響，甚至適量地使用黑水虻代替魚粉有利于提升水產(chǎn)動(dòng)物的生長性能，主要原因可能是黑水虻中的幾丁質(zhì)和甲殼素可提升水產(chǎn)動(dòng)物腸道有益菌群的多樣性。本試驗(yàn)所用基礎(chǔ)飼料是含有10%的黑水虻幼蟲粉的配合飼料，在此基礎(chǔ)上添加蝦青素，飼料中隨著蝦青素的添加，特別是0.20%的添加有助于改變?cè)摲N魚的腸道微生物的多樣性，是否與黑水虻幼蟲粉有關(guān)，有待進(jìn)一步試驗(yàn)考證。

4 結(jié)論

在黑水虻幼蟲粉和魚粉最優(yōu)配伍飼料配方基礎(chǔ)上，添加0.10%～0.15%（即100～150 mg/kg）蝦青素有助于使豹紋鰓棘鱸背部和腹部變紅和變黃，且對(duì)肌肉組織無影響，同時(shí)有利于提高腸道厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門等有益菌屬的多樣性和豐度，有利于提高豹紋鰓棘鱸機(jī)體的免疫力。由此說明在黑水虻幼蟲粉和魚粉最佳配伍基礎(chǔ)配方中添加蝦青素（雨生紅球藻源，10%）是可行的，添加0.10%～0.15%（即100～150 mg/kg）蝦青素有助于豹紋鰓棘鱸魚體色的增紅，推動(dòng)水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，增加收益。