張云 薛柯 代俊俊蘇亞菲李欽

1 河南省杜仲栽培與利用工程實驗室,河南 開封 475004;2 河南大學 藥學院,河南 開封 475004;3 河南大學 醫(yī)學院,河南開封475004

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(Postmenopausal Osteoporosis,PMO)屬于原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥,是婦女絕經(jīng)后常見的疾病之一,以骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破損、骨脆性增加、易發(fā)生骨折為主要特征的全身性骨骼疾病[1]。正常的腸道微生物群是骨量的調(diào)節(jié)劑,通過調(diào)節(jié)機體的代謝及免疫狀態(tài)來調(diào)節(jié)骨代謝,對維持骨穩(wěn)態(tài)平衡起著至關(guān)重要作用[2]。絕經(jīng)后女性腸道菌群種屬比例驟變,免疫細胞和炎癥因子激增,促進破骨細胞分化成熟,增強骨溶解吸收,導致骨質(zhì)疏松[3]。因此,腸道微生物群與骨代謝的關(guān)系成為目前的研究熱點。

杜仲葉是杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoidesOliv.的干燥葉。在《中華人民共和國藥典》2020年版中,杜仲葉具有補肝腎,強筋骨的功效,用于肝腎不足,頭暈?zāi)垦?腰膝酸痛,筋骨痿軟[4]。近年來研究[5]發(fā)現(xiàn),杜仲葉的主要活性成分為木脂素類、黃酮類、環(huán)烯醚萜類化合物。杜仲葉中的總黃酮含量高達10.05%[6]。黃酮類化合物廣泛存在于自然界植物中,具有多種生理活性和藥理作用。近年來,黃酮類化合物在骨質(zhì)疏松方面的研究取得了一定進展,有研究表明黃酮類化合物具有改善骨微結(jié)構(gòu)和提高骨密度的功能,達到預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的目的[7]。本實驗采用高通量測序技術(shù)研究杜仲葉總黃酮對去卵巢大鼠腸道菌群多樣性的影響,以期為用杜仲葉總黃酮預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松提供數(shù)據(jù)支撐。

1 實驗材料

1.1 藥物與試劑

杜仲葉總黃酮(實驗室自制,總黃酮含量＞80%);常規(guī)飼料購自于斯貝克思有限公司;注射用青霉素鈉(哈藥集團,批號20110319-2)。

糞便基因組DNA 提取試劑盒(Magen,Mag-Pure Soil DNA LQ Kit),Qubit dsDNA 檢測試劑盒(Life Technologies,Qubit dsDNA Assay Kit),TksGflex DNA 聚合酶(Takara,TksGflex DNA Polymerase)。

1.2 儀器

Centrifuge 5418臺式高速離心機(Eppendorf,Centrifuge 5418);高分辨率活體X 射線顯微成像儀(德國Bruker,SkyScan 1276);NanoDrop超微量分光光度計(Thermo Fisher,2000);PCR 儀(Biorad,580BR10905);高通量核酸提取儀(QIAGEN,SN 002358);生化分析儀(Aglient,2100)。

1.3 動物

SPF級3月齡雌性SD 大鼠32只,體質(zhì)量240±10 g,購自于濟南彭悅實驗動物繁育有限公司,實驗動物合格證號SCXK(魯)20190003。SD 大鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房,保持室溫20±2 ℃,自由飲水和進食。

2 實驗方法

2.1 去卵巢大鼠模型

大鼠適用性飼養(yǎng)一周后采用隨機數(shù)字法分為4組,每組8只,分別為假手術(shù)組、模型組、雌二醇組(陽性對照)和杜仲葉總黃酮組。假手術(shù)組僅切除雙側(cè)卵巢周圍等量脂肪,其余各組均由背部行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)[8]。術(shù)后3天內(nèi)每天注射青霉素G8萬IU,并用碘伏消毒,預(yù)防感染。術(shù)后一周起,開始每天灌胃給藥,杜仲葉總黃酮組給藥劑量為200 mg/(kg·d-1),雌二醇組給藥劑量為0.208 mg/(kg·d-1),假手術(shù)組和模型組灌胃同等體積的蒸餾水,每日給藥一次,連續(xù)給藥13周。

2.2 標本的采集

各組大鼠按照對應(yīng)藥物治療13周,最后一次灌胃禁食不禁水24 h后,用體積分數(shù)為10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉,采集標本。剖腹在回盲部做一V 形剪切口,滅菌牙簽收集糞便放入凍存管中保存于-80℃以備16S r RNA 基因測序。剝?nèi)∽訉m,濾紙吸干水分后稱重。剝離出大鼠雙側(cè)股骨,剔除附著的肌肉及結(jié)締組織,股骨采用75%乙醇固定,并保存于透明離心管中備用。

2.3 骨組織Micro-CT掃描

將股骨從體積分數(shù)為75%乙醇中取出,對標本進行固定處理后進行Micro-CT 掃描。由軟件計算出組織的骨密度(BMD)、骨體積分數(shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)和結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(SMI)等參數(shù)。

2.4 腸道菌群的高通量測序

采用DNA抽提試劑盒對樣本的基因組DNA 進行提 取,以343F TACGGRAGGCAGCAG 和798R AGGGTATCTAATCCT 為引物,對16S rRNA 可變區(qū)(V3+V4)進行PCR擴增,引物由賽維爾有限公司合成。Illumina MiSeq測序生成原始雙端序列。使用Trimmomatic(0.35)、Flash(version 1.2.11)、split_libraries(version 1.8.0)和UCHIME(version 2.4.2)進行原始數(shù)據(jù)的預(yù)處理,得到用于OUT(Operational Taxonomic Unit)劃分的va-lid tags。使用Vsearch(version 2.4.2)軟件,對質(zhì)控得到的優(yōu)質(zhì)序列valid tags按照97%的相似度進行OTU分類,并選取每個OTU 中豐度最大的序列作為該OTU的代表序列,采用RDP Classifier Naive Bayesian分類算法對代表序列與Silva(V138)數(shù)據(jù)庫進行比對注釋,得到OTU 的注釋信息,并進行alpha多樣性和beta多樣性分析。

2.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism 8.0 處理。采用平均值±標準差()表示,各組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用t檢驗,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠體重及子宮指數(shù)

見表1所示,實驗前,各組大鼠體重無統(tǒng)計學意義。實驗3 mon后,模型組大鼠的體重顯著高于假手術(shù)組(P＜0.01),而杜仲葉總黃酮組和模型組相比,大鼠體質(zhì)量增加有所降低,但無顯著性差異(P＞0.05),說明杜仲葉總黃酮有降低去卵巢大鼠體重的趨勢。與假手術(shù)組相比,模型組大鼠的子宮系數(shù)顯著低于假手術(shù)組(P＜0.001),具有統(tǒng)計學差異;而杜仲葉總黃酮組大鼠子宮系數(shù)與模型組接近,說明杜仲葉總黃酮對子宮無毒副作用,安全性高。

表1 大鼠體重和子宮指數(shù)(n=8,)

表1 大鼠體重和子宮指數(shù)(n=8,)

注:與假手術(shù)組相比,a P＜0.01,b P＜0.001。

3.2 骨組織Micro-CT掃描結(jié)果

由大鼠股骨Micro-CT 成像分析3D 圖可以看出(見圖1),假手術(shù)組大鼠的骨小梁排列緊密,分離度小,而模型組大鼠的骨小梁排列明顯疏松,骨小梁間存在較大的間隙。與假手術(shù)組相比,模型組的骨密度、骨體積分數(shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量均顯著降低(P＜0.001),且骨小梁分離度和結(jié)構(gòu)模型指數(shù)均顯著增加(P＜0.001),說明造模成功。經(jīng)杜仲葉總黃酮治療后,與雌二醇組結(jié)果較類似,顯著提高了大鼠的骨密度、骨體積分數(shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量(P＜0.05)降低了骨小梁分離度和結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(P＜0.01)。見圖2。

圖1 大鼠的股骨Micro-CT圖像

圖2 骨組織形態(tài)計量學指標

3.3 OTU 水平的Venn分析

根據(jù)聚類得到OTUs分析結(jié)果,繪制成韋恩圖,圖中每個圈代表一個組,同時存在于多個組的,用其重疊部分的數(shù)字表示。聚類后共獲得615 種OTU,其中假手術(shù)數(shù)組、模型組、雌二醇組和杜仲葉總黃酮組的腸道菌群物種豐富程度不同,OTU 種類分別為280 種、265 種、282種和287 種,特有OTU 種類分別為91、88、86和101種。這一結(jié)果表明,摘除卵巢使大鼠糞便菌群豐度有所降低,給藥后各組糞便菌群豐度均有所增加。見圖3。

圖3 OTUs的Venn分析圖

3.4 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性分析用于反映樣品內(nèi)的微生物多樣性程度。Alpha多樣性指數(shù)中的Shannon指數(shù)反映群落多樣性,Chao1 和Observed species指數(shù)反映樣品中菌落的豐富度。見圖4所示,與假手術(shù)組相比,模型組的Chao1 指數(shù)、Observed species 指數(shù)、Shannon指數(shù)顯著降低(P＜0.05),差異具有統(tǒng)計學意義,說明模型組的腸道微生物豐度和多樣性低于假手術(shù)組;與模型組相比,杜仲葉總黃酮組的Chao1指數(shù)、Observed species指數(shù)、Shannon指數(shù)顯著升高(P＜0.05),說明杜仲葉總黃酮組樣本的腸道微生物豐度和多樣性高于模型組。

圖4 Alpha多樣性分析

3.5 Beta多樣性分析

Beta多樣性為生境間的多樣性程度,即比較不同分組樣本的差異。本實驗進行主坐標分析(Principal Co-ordinates Analysis,PCo A),并選取貢獻率最大的主坐標組合進行作圖。樣本物種組成結(jié)構(gòu)越相似,反映在PCo A 圖中的樣本距離越近,見圖5。由圖可知,假手術(shù)組與模型組明顯分開,說明兩組之間物種組成結(jié)構(gòu)差異顯著,杜仲葉總黃酮組與假手術(shù)數(shù)組之間的距離明顯縮短,說明給藥后的大鼠腸道菌群組成趨向于假手術(shù)組。

圖5 Beta多樣性分析

3.6 物種相對分布

3.6.1 在門分類水平上的組成

在假手術(shù)組樣本中,其腸道菌群排名前五位的優(yōu)勢門類為擬桿菌門(Bacteroidetes)比率是53.678%,厚壁菌門(Firmicutes)比率是38.860%、螺旋菌門(Spirochaetes)比率是4.699%、Campilobacterota比率是1.175%、變形菌門(Proteobacteria)比率是0.628%,其它菌門所占比率為0.960%。在模型組樣本中,其腸道菌群排名前五位的優(yōu)勢門類為擬桿菌門(Bacteroidetes)比率是58.108%,厚壁菌門(Firmicutes)比率是37.171%、螺旋菌門(Spirochaetes)比率是2.937%、變形菌門(Proteobacteria)比率是0.903%、Campilobacterota比率是0.348%,其它菌門所占比率為0.533%。與假手術(shù)組相比,模型組中的擬桿菌門比率有升高趨勢,Campilobacterota比率明顯下降。在杜仲葉總黃酮給藥組樣本中,其腸道菌群排名前五位的優(yōu)勢門類為擬桿菌門(Bacteroidetes)比率是52.991%,厚壁菌門(Firmicutes)比率是43.080%、變形菌門(Proteobacteria)比率是1.238%、Campilobacterota比率是1.137%、螺旋菌門(Spirochaetes)比率是0.874%、,其他菌門所占比率為0.680%。與模型組相比,杜仲葉總黃酮組能降低擬桿菌門比率,提高Campilobacterota比率。由此可見,三組動物腸道菌群雖然在前五大優(yōu)勢門類種類相同,但各優(yōu)勢門類所占比例各不相同,杜仲葉總黃酮組的第三大優(yōu)勢門類是變形菌門而在模型組和假手術(shù)組的第三大優(yōu)勢門類為螺旋菌門。見圖6。

圖6 樣本腸道菌群門水平的相對豐度圖

3.6.2 屬分類水平上的組成

見圖7所示,在假手術(shù)組樣本中,其腸道菌群排名前五位的優(yōu)勢菌屬為Prevotella比率為21.932%、Muribaculaceae比率為21.784%、Lactobacillus比率為6.293%、Clostridia_UCG-014比率為5.083%、Treponema比率為4.630%。在模型組樣本中,其腸道菌群排名前五位的優(yōu)勢菌屬為Prevotella 比率為39.615%、Muribaculaceae比率為10.269%、Lactobacillus的比率為4.375%、Clostridia_UCG-014的比率為2.914%、Treponema 比率為2.869%。與假手術(shù)組相比,模型組中的Prevotella的菌群比率顯著升高,而Muribaculaceae菌群比率明顯降低。在杜仲葉總黃酮給藥組樣本中,其腸道菌群排名前五位的優(yōu)勢菌屬為Muribaculaceae比率為20.379%、Prevotella 比率為13.425%、Clostridia_UCG-014比率為4.695%、Lactobacillus比率為2.992%、Lachnospiraceae_NK4A136_group比率為2.970%。與模型組相比,杜仲葉總黃酮組能顯著降低Prevotella菌群比率,提高Muribaculaceae菌群比率。由此可見,雖然在三組動物中的腸道菌群在前五大優(yōu)勢菌屬大致相同,但每一種菌屬所占比率各不相同。

圖7 樣本腸道菌群屬水平的相對豐度圖

4 討論

骨重塑過程主要由破骨細胞的骨吸收作用和成骨細胞的骨形成構(gòu)成。絕經(jīng)后女性由于卵巢功能衰退,卵巢分泌的雌激素水平降低,致使骨代謝紊亂、骨量降低、骨密度下降,最終引發(fā)的一種代謝性疾病[9]。研究[10]發(fā)現(xiàn),雌激素不僅能抑制成骨細胞、T細胞和B細胞分泌RANKL,還可以增加RANKL的競爭性受體骨保護素的水平。T 細胞可以增加骨微環(huán)境中TNF-α 的含量,TNF-α 可通過促進RANKL的表達,間接調(diào)節(jié)破骨細胞的生成,引起骨質(zhì)流失[11]。本研究中模型組大鼠骨密度顯著降低,骨小梁連接密度減小且結(jié)構(gòu)受損。而經(jīng)杜仲葉總黃酮治療后,骨密度、骨體積分數(shù)、骨小梁數(shù)量和骨小梁厚度均有所升高,而骨小梁分離度和模型結(jié)構(gòu)指數(shù)都有所降低,說明杜仲葉總黃酮能改善骨微結(jié)構(gòu)。

近年來有研究表明,腸道菌群與機體骨代謝調(diào)控密切相關(guān)。腸道菌群是人體最大的微生物系統(tǒng),與人體健康密切相關(guān),其數(shù)量是人類細胞的數(shù)十倍,可通過多種途徑調(diào)節(jié)骨代謝,主要包括鈣和磷酸鹽吸收、免疫調(diào)節(jié)等方面[12]。有研究發(fā)現(xiàn),無菌小鼠骨量高于正常小鼠、骨礦物質(zhì)密度和骨體積分數(shù)增加,并且骨吸收標記物含量降低,說明腸道菌群對骨代謝有調(diào)控作用[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)去卵巢模型大鼠腸道菌群多樣性低于假手術(shù)組。去卵巢模型大鼠的腸道菌群嚴重失調(diào),其中瘤胃球菌屬、梭菌屬和糞球菌屬與破骨性指標呈正相關(guān),并與去卵巢大鼠骨量丟失的趨勢一致[15]。在本實驗中,與假手術(shù)組相比,模型組的的Prevotella(普雷沃菌屬)的豐度有所增加。厚壁菌門細菌特具有免疫調(diào)節(jié)作用,可促進調(diào)節(jié)性Treg細胞的形成,維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài),并且還可以抑制破骨細胞分化,影響破骨細胞形成[16]。在本研究中,去卵巢大鼠經(jīng)杜仲葉總黃酮干預(yù)后Bacteroidota豐度減少,同時能夠提高的Firmicutes豐度,并提高去卵巢大鼠骨量,表明杜仲葉總黃酮可以通過腸道菌群改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的骨代謝進程,但其具體機制尚不清楚。

本實驗初步探討了杜仲葉總黃酮對去卵巢模型大鼠骨微結(jié)構(gòu)和腸道菌群多樣性的影響。發(fā)現(xiàn)杜仲葉總黃酮能改善去卵巢模型大鼠的股骨微觀結(jié)構(gòu),提高骨密度,同時還能影響腸道菌群的Alpha、Beta多樣性和菌群組成,從而有效的緩解絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。由于本實驗未設(shè)計機制研究,杜仲葉總黃酮對腸道菌群及骨免疫的作用機制還有待進一步實驗探討和驗證。