李輝李攀峰楊婷張文杰李欽

河南大學(xué) 藥學(xué)院,河南 開封475004

高血壓作為一種危害人類健康的全球性慢性疾病,可引起心、腦、眼、腎等多種靶器官損傷[1-2]。高血壓與血管結(jié)構(gòu)變化密切相關(guān),長(zhǎng)期壓力超載使血管壁張力持續(xù)升高,血管活性因子受損引起血管內(nèi)皮功能受損,若不能得到及時(shí)有效的阻止和逆轉(zhuǎn),極易導(dǎo)致腦卒中、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗塞等心血管疾病,加劇高血壓患者傷殘率[3-4]。

中醫(yī)理論認(rèn)為“病位在肝,根源在腎”是高血壓的主要病機(jī)[5]。杜仲葉性微辛、溫;具有補(bǔ)肝腎,強(qiáng)筋骨的功效[6]。杜仲葉含有環(huán)烯醚萜類、木脂素類、黃酮類、苯丙素類以及生物堿、氨基酸等多種化合物,有研究發(fā)現(xiàn)杜仲葉中綠原酸和總黃酮有降壓作用[7-8],但杜仲葉提取物對(duì)血管內(nèi)皮功能的保護(hù)機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)給藥期間SHR 大鼠尾動(dòng)脈收縮壓和舒張壓,血清中NO、e NOs、AngII、TNF-、IL-6 含量和主動(dòng)脈血管HE染色、Masson染色和Rho A 和ROCK1蛋白及mRNA 表達(dá)水平考察其對(duì)血管內(nèi)皮功能的保護(hù)機(jī)制,為杜仲葉進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與動(dòng)物

無(wú)創(chuàng)尾套法血壓儀(上海艾爾科特生物科技有限公司);Multiskan MK3酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司);Nikon Eclipse E100正置光學(xué)顯微鏡(日本尼康);JHBE-100A 閃式提取器(智晶生物);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)儀器有限公司);DYY-6C 垂直電泳儀(北京六一儀器廠)。

杜仲葉由國(guó)家林業(yè)局原陽(yáng)杜仲種植基地提供,經(jīng)河南大學(xué)李欽教授鑒定為杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoidesOliv.的干燥葉。一氧化氮(NO)試劑盒(Servicebio),內(nèi)皮型一氧化氮(eNOs)ELISA 試劑盒(上海江萊生物科技有限公司),血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)試劑盒、白介素-6(IL-6)試劑盒、腫瘤壞死因子(TNF-α)試劑盒(均購(gòu)自Boster Biological Technology 公司),BCA蛋白濃度試劑盒,ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒均購(gòu)自Servicebio,抗體:RhoA、ROCK1、β-actin(abcam),其余所用試劑均為分析純。

SPF級(jí)雄性Wistar Kyoto大鼠和原發(fā)性高血壓(SHR)大鼠,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,許可證編號(hào):SCXK(京)2016-0006。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)藥物制備

杜仲葉提取物采用實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化工藝制備[9],將20 L 70%乙醇和2 kg杜仲葉粉浸泡8 h后,閃式提取3次(每次5 min),濾液合并后減壓濃縮至2 L,得到杜仲葉提取物(出膏率28.67%)。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥

雄性WKY 大鼠8只作為正常(CK)組(0.5%CMC-Na)。雄性SHR 大鼠40只,隨機(jī)分為5組(n=8):杜仲葉提取物高劑量(HEU)組(8.24 g·kg-1)、中劑量(MEU)組(4.12 g·kg-1)、低劑量(LEU)組(2.06 g·kg-1)、模型(DM)組(0.5%CMC-Na)、陽(yáng)性藥(P)組(0.4 mg·kg-1培哚普利),以10 ml·kg-1·d-1體積灌胃8周。

1.2.3 大鼠收縮壓和舒張壓

采用無(wú)創(chuàng)尾套法測(cè)量大鼠安靜清醒狀態(tài)下尾動(dòng)脈收縮壓(SBP)和舒張壓(DBP),入組前和給藥8周后測(cè)量大鼠的收縮壓(SBP)和舒張壓(DBP)變化,每只大鼠連續(xù)測(cè)量3次取均值。

1.2.4 大鼠血清活性因子

給藥結(jié)束后禁食12 h,腹腔注射10%水合氯醛麻醉,腹主動(dòng)脈采血,4 ℃3 000 r·min-1離心15 min,取血清。按照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定血清中NO、eNOs、AngII、TNF-、IL-6的含量。

1.2.5 大鼠主動(dòng)脈組織病理學(xué)檢查

腹主動(dòng)脈采血結(jié)束后打開大鼠胸腔,打開胸腔分離并剪下主動(dòng)脈,去除周圍過(guò)多的結(jié)締組織,一半固定于4%多聚甲醛,一半保存在電鏡固定液中。HE 染色觀察血管形態(tài)變化,Masson 膠原染色觀察血管膠原沉積情況,電鏡觀察主動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)變化。

1.2.6 大鼠主動(dòng)脈Rho A、ROCK1 蛋白的表達(dá)

取大鼠主動(dòng)脈組織用預(yù)冷的PBS緩沖液漂洗,PIPA 裂解液與PMSF 以4∶1 的比例配制裂解液提取蛋白,4 ℃12 000 r/min離心20 min后取上清液,BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白含量,然后加入上樣緩沖液沸水浴進(jìn)行蛋白變性,-80 ℃分裝保存。取蛋白30 g,行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳,0.45-μmPVDF膜轉(zhuǎn)膜2 h,5%脫脂奶粉封閉1 h,一抗4 ℃孵育過(guò)夜,TBST洗膜3次,8 min/次,二抗室溫孵育1 h,TBST 洗膜3次,8 min/次。用ECL化學(xué)發(fā)光技術(shù)對(duì)印跡曝光攝圖并進(jìn)行灰度值分析。

1.2.7 大鼠主動(dòng)脈RhoA、Rock1 m RNA 的表達(dá)

取主動(dòng)脈組織100 mg,用Trizol一步法提取總RNA,使用Nanodrop 2000得到RNA 的濃度,濃度過(guò)高的則進(jìn)行稀釋,使其終濃度為200 ng/μL左右。取一個(gè)PCR 試管,加入RNA2μg。加入oligo(d T)181μL,用無(wú)核糖核酸酶的去離子水補(bǔ)充至12μL。取PCR,配制反應(yīng)體系,每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物均配制3管,試劑及使用量為:2×PCR Mix(12.5μL)、7.54 M 基因引物(2.0μL)、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(2.5μL)、dd H2O(8.0μL)。95 ℃條件下,預(yù)變性10 min;60 ℃條件下,60s循環(huán)40次,60 ℃至95 ℃條件下,每30s溫度增加1℃進(jìn)行PCR 的擴(kuò)增。計(jì)算表達(dá)水平比率:表達(dá)量的比值=2-ΔΔCT,實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。引物序列如下:GAPDH 引物:上游:5＇-CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3＇,下游:5＇-GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT-3＇;Rho A 引物:上游:5＇-TGTGGCAGATATTGAAGTGGACG-3＇,下游:5＇-CGCCTTGTGTGCTCATCATTC-3＇;ROCK1 引物:上游:5＇-CCCGATCATCCCCTAGAACC-3＇,下游:5＇-TTGGAGCAAGCTGTCGACTG-3＇。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0進(jìn)行分析處理,計(jì)量資料均用表示,多組間比較采用單因素方差分析,2組間比較采用t檢驗(yàn),用P＜0.05表示顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲葉提取物對(duì)大鼠收縮壓和舒張壓的影響

給藥前,DM 組和各給藥組收縮壓(SBP)和舒張壓(DBP)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),且SBP 和DBP值均顯著高于CK 組(P＜0.05)。給藥8 周后,與DM 組相比,各給藥組大鼠的SBP和DBP均明顯降低(P＜0.05),HEU 和MEU 組降血壓效果最好。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 杜仲葉提取物對(duì)SHR大鼠血壓的影響(,mmHg)

表1 杜仲葉提取物對(duì)SHR大鼠血壓的影響(,mmHg)

a與CK 組比較,P＜0.05;b與DM 組比較,P＜0.05。

2.2 杜仲葉提取物對(duì)大鼠血清活性因子的影響

給藥8周后,與CK 組相比,DM 組大鼠血清中TNF-α、IL-6、Ang Ⅱ含量顯著升高(P＜0.05),NO、eNOs含量顯著降低(P＜0.05),與DM 組比較,LEU、MEU、HEU、P組血清中NO、e NOs含量升高(P＜0.05),TNF-α、IL-6、Ang Ⅱ含量降低(P＜0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 杜仲葉提取物對(duì)SHR大鼠血管活性因子的影響()

表2 杜仲葉提取物對(duì)SHR大鼠血管活性因子的影響()

a與CK 組比較,P＜0.05;b與DM 組比較,P＜0.05。

2.3 杜仲葉提取物對(duì)大鼠主動(dòng)脈的影響

HE 染色:CK 組大鼠主動(dòng)脈形態(tài)結(jié)構(gòu)完整、層次清晰,排列整齊,管壁無(wú)增厚,內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)損傷;與CK組相比,DM 組主動(dòng)脈內(nèi)膜呈不規(guī)則增厚,細(xì)胞外基質(zhì)增多,內(nèi)皮細(xì)胞排列紊亂,邊緣粗糙、斷裂。給藥8周后,LEU、MEU、HEU 組和P組可不同程度地改善內(nèi)皮損傷的病理狀態(tài),主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚不明顯,內(nèi)皮細(xì)胞排列整齊,無(wú)明顯斷裂。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 杜仲葉提取物對(duì)SHR大鼠主動(dòng)脈形態(tài)變化影響(HE,200×)

Masson 染色:血管中膜平滑肌細(xì)胞漿和肌纖維被染成紅色,細(xì)胞核呈黑藍(lán)色,膠原纖維被染成藍(lán)色。與CK 組相比,DM 組主動(dòng)脈血管中膜平滑肌膠原纖維明顯增多,且細(xì)胞排列紊亂;LEU、MEU、HEU 組和P組可不同程度地改善血管平滑肌膠原纖維異常增殖情況。見(jiàn)圖2。

圖2 杜仲葉提取物對(duì)SHR大鼠主動(dòng)脈膠原沉積情況的影響(Masson,200×)

電鏡觀察:CK 組細(xì)胞質(zhì)均勻,細(xì)胞內(nèi)空泡少,核染色質(zhì)均勻分布;DM 組可見(jiàn)線粒體嵴形態(tài)腫脹變形,管壁增厚,有泡沫細(xì)胞產(chǎn)生,MEU、HEU 組和P組可不同程度地減輕泡沫細(xì)胞聚集,細(xì)胞器腫脹變形的情況。見(jiàn)圖3。

圖3 杜仲葉提取物對(duì)SHR大鼠主動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)的影響(電鏡,1200×)

2.4 杜仲葉提取物對(duì)大鼠主動(dòng)脈RhoA、ROCK 1蛋白表達(dá)的影響

與CK 組比較,DM 組Rho A、ROCK 1 蛋白表達(dá)均顯著升高(P＜0.01),表明高血壓引起大鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮功能損傷;與DM 組比較,P 組與HEU、MEU 組均顯著降低Rho A 蛋白表達(dá)(P＜0.05),P組與HEU、MEU、LEU 組均顯著降低ROCK 1 蛋白表達(dá)(P＜0.05)。提示HEU、MEU可顯著改善SHR 大鼠血管內(nèi)皮功能受損。見(jiàn)圖4。

圖4 杜仲葉提取物對(duì)SHR大鼠主動(dòng)脈RhoA、ROCK 1 蛋白表達(dá)的影響

2.5 PCR法檢測(cè)SHR大鼠胸主動(dòng)脈Rho A、Rock 1 mRNA含量表達(dá)

熒光定量PCR 結(jié)果顯示,與CK 組比較,DM組RhoA、Rock1 m RNA 的表達(dá)顯著上調(diào),與DM組比較,P 組與HEU、MEU、LEU 組胸主動(dòng)脈RhoA mRNA表達(dá)(P＜0.01)、胸主動(dòng) 脈Rock1 m RNA 表達(dá)(P＜0.05)均顯著下調(diào),HEU、MEU、LEU 組均能不同程度的抑制胸主動(dòng)脈RhoA、Rock1 m RNA 的表達(dá),其中,HEU、MEU 組效果較好。見(jiàn)圖5。

圖5 各組大鼠胸主動(dòng)脈Rho A、Rock 1 mRNA的表達(dá)

3 討論

高血壓導(dǎo)致eNOS/NO 信號(hào)通路受損,eNOS水平降低時(shí),血管內(nèi)皮NO 釋放減少進(jìn)而導(dǎo)致血管收縮功能障礙,啟動(dòng)粥樣斑塊的形成及發(fā)展,引起血管內(nèi)皮功能損傷[10]。Ang II在RAAS(腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng))中發(fā)揮重要作用[11]。高血壓患者由于異常增高的動(dòng)脈壓力,使得機(jī)體難以維持炎癥反應(yīng)穩(wěn)態(tài),造成血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙及代謝損傷[5]。TNF-α升高可激活NF-κB 信號(hào)通路和NADPH 氧化酶,加劇機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)并促進(jìn)內(nèi)皮素ET 表達(dá),引起血管外周阻力增大,血壓持續(xù)升高。IL-6通過(guò)激活NO-cGMP 信號(hào)通路促進(jìn)超氧化物生成。炎癥因子TNF-、IL-6 分泌的增加加劇血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡[12]。本研究中杜仲葉提取物顯著升高NO、eNOs含量,顯著降低AngⅡ、TNF-、IL-6含量,保護(hù)血管內(nèi)皮功能,改善原發(fā)性高血壓大鼠血管內(nèi)皮慢性炎癥狀態(tài)。

Rho/ROCK 信號(hào)通路是近年來(lái)神經(jīng)血管類疾病研究熱點(diǎn),研究表明Ras同族體基因家族成員A(RhoA)/Rho激酶(ROCK1)與血管平滑肌收縮、應(yīng)力纖維形成及血壓調(diào)節(jié)等過(guò)程有關(guān)[13]。Rho A 介導(dǎo)應(yīng)力纖維的形成,Rock1為Rho激酶是RhoA 的下游靶基因,具有調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移收縮的功能。高血壓導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能受損,Rho A/ROCK信號(hào)通路激活誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)鈣離子的敏感性增加,抑制血管舒張,增加血管內(nèi)皮通透性,加劇血管內(nèi)皮功能受損[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),杜仲葉提取物中、高劑量組可明顯抑制Rho A、ROCK1 蛋白和m RNA表達(dá),改善SHR 大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮損傷。

綜上所述,杜仲葉提取物可能通過(guò)調(diào)控血管活性因子NO、eNOs、Ang Ⅱ,抑制炎癥因子TNF-、IL-6含量,下調(diào)血管中Rho A、ROCK1蛋白和m RNA 表達(dá)改善原發(fā)性高血壓大鼠血管內(nèi)皮損傷。