陳佳，聶黎行，戴勝云，劉薇，魏鋒，馬雙成

中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629

甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、脹果甘草G.inflataBat.或光果甘草G.glabraL.的干燥根和根莖，在我國(guó)有悠久的使用歷史，近60%的中藥成方制劑中含有甘草[1]。甘草具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥的功效[2]，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品，又名“國(guó)老”。據(jù)本草考證，歷代古籍所描述的甘草基原為甘草G.uralensisFisch.，多產(chǎn)于寧夏、內(nèi)蒙古、陜西、甘肅一帶，以“梁外甘草”為最佳，即內(nèi)蒙古鄂爾多斯杭錦旗梁外地區(qū)[3-5]。新疆地區(qū)甘草主要包括3 種基原，分別是甘草G.uralensisFisch.、脹果甘草G.inflataBat.和光果甘草G.glabraL.，其中脹果甘草系新疆地區(qū)特有的甘草藥用資源，主要分布于新疆的南疆塔里木盆地和東疆哈密、吐魯番地區(qū)及塔里木河及孔雀河流域等地區(qū)[6]。光果甘草主產(chǎn)于中東及地中海地區(qū)，在我國(guó)主要分布在新疆北部及甘肅等地區(qū)[7-8]。

本課題組前期研究對(duì)甘草G.uralensisFisch.化學(xué)成分進(jìn)行了詳細(xì)分析[9]，本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，針對(duì)新疆地區(qū)光果甘草和脹果甘草化學(xué)成分進(jìn)行分析和探討。目前關(guān)于脹果甘草和光果甘草化學(xué)成分的研究報(bào)道很多，大多針對(duì)其中1 種基原開展深入研究[10-11]，也有相關(guān)報(bào)道對(duì)脹果甘草和光果甘草進(jìn)行化學(xué)成分對(duì)比研究，如含量測(cè)定方法的建立[12]、三萜皂苷類或黃酮類化合物的含量分析[13-14]、不同基原甘草的化學(xué)成分差異探討[15]等。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定了光果甘草和脹果甘草不同結(jié)構(gòu)類型的20個(gè)化學(xué)成分（2個(gè)三萜皂苷類、2個(gè)香豆素類、3 個(gè)查耳酮類、13 個(gè)黃酮類化合物）含量，并運(yùn)用多元統(tǒng)計(jì)分析，找出光果甘草和脹果甘草之間的差異化學(xué)成分，為多基原甘草藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制定提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀（2998 二極管陣列檢測(cè)器、Empower 網(wǎng)絡(luò)版工作站）；KQ-250DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XSE 205DU 型電子天平（梅特勒-托利多儀器公司）。

1.2 試劑

對(duì)照品甘草酸銨（批號(hào)：110731-202021，純度：96.20%）、甘草苷（批號(hào)：111640-201908，純度：95.00%）、芒柄花素（批號(hào)：111703-201504，純度：95.00%）均來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甘草皂苷G2（批號(hào)：PCS200904，純度：98.59%）購(gòu)自成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司；甘草異黃酮B（批號(hào)：PS20110202，純度：98.02%）、甘草酚（批號(hào)：PS010089，純度：98.71%）均購(gòu)自成都普思科技股份有限公司；半甘草異黃酮B（批號(hào)：MUST20072104，純度：99.91%）、甘草黃酮醇（批號(hào)：MUST20041311，純度：98.86%）均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司；芹糖甘草苷（批號(hào)：PRF9050224，純度：99.95%）、芹糖異甘草苷（批號(hào)：PRF9101021，純度：97.04%）、甘草素（批號(hào)：PRF20042742，純度：99.50%）、異甘草素（批號(hào)：PRF20060943，純度：99.87%）、光甘草酚（批號(hào)：PRF20032401，純度：99.95%）、刺甘草查耳酮（批號(hào)：PRF10122621，純度：99.81%）、異甘草苷（批號(hào)：PRF20040923，純度：98.23%）、新異甘草苷（批號(hào)：PRF20060942，純度：99.25%）、甘草香豆素（批號(hào)：PRF20060921，純度：99.77%）、甘草查耳酮A（批號(hào)：PRF20033022，純度：98.57%）、甘草查耳酮B（批號(hào)：PRF10101021，純度：99.74%）、佛來(lái)心苷（批號(hào)：PRF9110601，純度：95.77%）均購(gòu)自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；甲酸、乙腈均為色譜純；純凈水為Milli-Q 超純水，其他試劑均為分析純。

10批脹果甘草（S1～S10）及10批光果甘草（S11～S20）樣品經(jīng)中國(guó)食品藥品檢定研究院中藥標(biāo)本館張南平主任藥師鑒定，分別為豆科植物光果甘草Glycyrrhiza glabraL.及脹果甘草G.inflataBat.的干燥根和根莖，見表1。樣品保存于中國(guó)食品藥品檢定研究院中藥民族藥檢定所中藥標(biāo)本館。

表1 光果甘草及脹果甘草藥材信息

2 方法

2.1 光果甘草與脹果甘草中16個(gè)化合物含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 Shiseido Capcell Pak MG C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫。甘草查耳酮B、刺甘草查耳酮、甘草查耳酮A 及光甘草酚洗脫梯度為：0～30 min，25%～70%A；30～34 min，70%A；34～35 min，70%～95%A；35～40 min，95%A；40～41 min，95%～25%A；41～45 min，25%A。其余16 個(gè)化合物洗脫梯度為0～60 min，5%～95%A；60～65 min，95%A；65.0～65.2 min，95%～5%A；65.2～75.0 min，5%A。流速為1 mL·min-1。柱溫為40 ℃。進(jìn)樣量為10 μL。檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm（芒柄花素、甘草酸和甘草皂苷G2）、262 nm（半甘草異黃酮B 和甘草異黃酮B）、275 nm（甘草苷、芹糖甘草苷和甘草素）、360 nm（佛來(lái)心苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、新異甘草苷、異甘草素、甘草香豆素、甘草酚、甘草黃酮醇、甘草查耳酮B、刺甘草查耳酮和甘草查耳酮A）、282 nm（光甘草酚）[9,16]。色譜圖見圖1～2。

圖1 甘草藥材16個(gè)化學(xué)成分HPLC圖

圖2 甘草藥材4個(gè)化學(xué)成分HPLC圖

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取甘草皂苷G2、甘草酸銨、芒柄花素、半甘草異黃酮B、甘草異黃酮B、芹糖甘草苷、甘草苷、甘草素、佛來(lái)心苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、新異甘草苷、異甘草素、甘草香豆素、甘草酚及甘草黃酮醇對(duì)照品適量，加甲醇溶解并稀釋成質(zhì)量濃度分別為46.26、182.20、4.16、11.63、9.17、116.05、90.44、15.70、5.47、36.54、19.96、11.36、4.62、8.06、14.00、4.40 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液1。

精密稱取甘草查耳酮B、刺甘草查耳酮、甘草查耳酮A及光甘草酚對(duì)照品適量，加甲醇溶解并稀釋成質(zhì)量濃度分別為21.48、2.87、43.90、18.66 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液2，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取本品粉末（過三號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱量，超聲（超聲功率：300 W，頻率：40 kHz）處理30 min，放冷，再稱量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液1。

取本品粉末（過三號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱量，超聲（超聲功率：300 W，頻率：40 kHz）處理45 min，放冷，再稱量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液2。

2.1.4 方法學(xué)驗(yàn)證 依據(jù)課題組已建立的HPLC 方法[9,16]，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，20 個(gè)化合物的線性相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.999 4，檢出限（LOD）和定量限（LOQ）分別為0.002 7～0.062 8 μg·mL-1和0.008 8～0.209 2 μg·mL-1，加樣回收率為91.19%～101.25%，穩(wěn)定性、精密度和重復(fù)性RSD 分別為2.92%、1.00%和2.33%。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果符合《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版（四部）通則9101《藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》。

2.2 數(shù)據(jù)分析

聚類分析（HCA）和主成分分析（PCA）采用ChemPattern 2017 化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件；t檢驗(yàn)采用SPSS Statistics 23.0 軟件；正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）采用SIMCA 13.0軟件。

3 結(jié)果

3.1 光果甘草與脹果甘草中20個(gè)化合物含量

采用外標(biāo)法計(jì)算20批甘草樣品中20個(gè)化合物含量，見表2。分別統(tǒng)計(jì)光果甘草與脹果甘草中20 個(gè)化合物含量，結(jié)果見圖3。

圖3 脹果甘草和光果甘草中20個(gè)化學(xué)成分含量分布（n=10）

表2 甘草藥材中20個(gè)化學(xué)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（n=20）%

3.2 HCA

利用Chem Pattern 軟件將光果甘草和脹果甘草20 個(gè)化學(xué)成分含量數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后，以歐式距離為度量，采用遠(yuǎn)鄰法進(jìn)行聚類分析，見圖4。由圖4 可知，光果甘草和脹果甘草可以各自聚為一類。

圖4 光果甘草和脹果甘草20個(gè)化學(xué)成分含量的HCA

3.3 PCA

以20個(gè)化學(xué)成分含量為變量，采用ChemPattern軟件進(jìn)行主成分分析，見圖5。第一主成分（PC1）的方差貢獻(xiàn)率為73.30%，第二主成分（PC2）的方差貢獻(xiàn)率為18.59%，累積方差貢獻(xiàn)率為91.89%，說(shuō)明其能較好地反映樣品間的差異。PCA 散點(diǎn)圖顯示，光果甘草和脹果甘草可以各自聚為一類，該結(jié)果與聚類分析結(jié)果相符。

圖5 光果甘草和脹果甘草20個(gè)化學(xué)成分含量的PCA

3.4 OPLS-DA

采用SIMCA 13.0 軟件，以20 個(gè)化學(xué)成分含量為自變量，20批樣品為因變量，進(jìn)行OPLS-DA。由圖6 可以看出，2 種基原的甘草藥材可以較好地區(qū)分，脹果甘草（S1～S10）集中分布于模型左側(cè)，光果甘草（S11～S20）集中分布于模型右側(cè)，OPLSDA 分類結(jié)果與HCA、PCA 結(jié)果一致[17-21]。采用交叉驗(yàn)證法對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，模型對(duì)自變量擬合指數(shù)R2X=0.6，對(duì)因變量的擬合指標(biāo)R2Y=0.915，模型預(yù)測(cè)指數(shù)Q2=0.802，三者均大于0.5，說(shuō)明模型穩(wěn)定可靠，可用于光果甘草和脹果甘草的區(qū)分。

圖6 光果甘草和脹果甘草20個(gè)化學(xué)成分含量的OPLS-DA

為進(jìn)一步找出影響2 種基原甘草藥材差異的主要變量，得到了OPLS-DA 模型的變量重要性投影（VIP）值，見表3。VIP值的大小代表了各指標(biāo)成分對(duì)模型貢獻(xiàn)率的大小，值越大貢獻(xiàn)越大。以VIP值＞1為界限進(jìn)行篩選，新異甘草苷、異甘草苷、甘草查耳酮A、甘草苷、甘草酚、甘草皂苷G2、異甘草素和甘草查耳酮B 是影響光果甘草和脹果甘草差異的主要化學(xué)成分，對(duì)2 種基原甘草區(qū)分的影響程度為新異甘草苷＞異甘草苷＞甘草查耳酮A＞甘草苷＞甘草酚＞甘草皂苷G2＞異甘草素＞甘草查耳酮B。

3.5 t檢驗(yàn)

為驗(yàn)證經(jīng)OPLS-DA 找到的2 個(gè)基原甘草差異化學(xué)成分的準(zhǔn)確性，采用SPSS Statistics 23.0軟件，按照基原類別將20 批樣品分為2 類，并以樣本類別為自變量，20個(gè)化學(xué)成分含量測(cè)定結(jié)果為因變量進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果見表3[22]。新異甘草苷、異甘草苷、甘草查耳酮A、甘草苷、甘草酚、甘草皂苷G2、刺甘草查耳酮和異甘草素的含量在光果甘草和脹果甘草中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 光果甘草和脹果甘草20個(gè)化學(xué)成分含量OPLS-DA VIP值和t檢驗(yàn)P值

對(duì)2 種統(tǒng)計(jì)方法的分析結(jié)果進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)新異甘草苷、異甘草苷、甘草查耳酮A、甘草苷、甘草酚、甘草皂苷G2及異甘草素既對(duì)2 種基原甘草藥材OPLS-DA 模型貢獻(xiàn)大（VIP 值＞1），又在t檢驗(yàn)中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；甘草查耳酮B雖在OPLS-DA 中對(duì)模型貢獻(xiàn)大（VIP 值＞1），但在t檢驗(yàn)中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；刺甘草查耳酮雖在t檢驗(yàn)中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但在OPLS-DA 中對(duì)模型貢獻(xiàn)較?。╒IP值＜1）；甘草香豆素、甘草異黃酮B、光甘草酚、佛來(lái)心苷、甘草黃酮醇、甘草素、芒柄花素、芹糖甘草苷、半甘草異黃酮B、甘草酸和芹糖異甘草苷既對(duì)OPLS-DA模型貢獻(xiàn)較?。╒IP值＜1），又在t檢驗(yàn)中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。故將新異甘草苷、異甘草苷、甘草查耳酮A、甘草苷、甘草酚、甘草皂苷G2及異甘草素7 個(gè)化學(xué)成分作為區(qū)分2 個(gè)基原甘草藥材的差異化學(xué)成分。

4 討論

4.1 待測(cè)化學(xué)成分的選擇

甘草化學(xué)成分較復(fù)雜，以黃酮類和三萜皂苷類化學(xué)成分為主，另有香豆素類、二苯乙烯類等其他結(jié)構(gòu)類型的化學(xué)成分，不同結(jié)構(gòu)類型的化學(xué)成分藥理作用有所不同[23-24]。已有研究表明，光甘草定是光果甘草的特征化學(xué)成分，也是主要化學(xué)成分[25-26]，但光果甘草中其他化學(xué)成分的研究報(bào)道較少。本研究選擇黃酮類、三萜皂苷類、香豆素類等不同結(jié)構(gòu)類型的20 個(gè)化學(xué)成分作為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)光果甘草和脹果甘草的差異化學(xué)成分包括4 個(gè)黃酮類化合物、1 個(gè)三萜皂苷類化合物、1 個(gè)香豆素類化合物和1 個(gè)查耳酮類化合物，說(shuō)明不同結(jié)構(gòu)類型的化合物含量在2個(gè)基原的甘草藥材中均存在不同程度的差異。

4.2 統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析

本研究通過OPLS-DA 尋找光果甘草和脹果甘草的差異化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)甘草查耳酮B 在OPLS-DA 中VIP值＞1，初步認(rèn)為該化合物在2個(gè)基原甘草藥材中含量是有差異的，再采用t檢驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，甘草查耳酮B 在2 個(gè)基原甘草藥材中的含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用同樣的統(tǒng)計(jì)方法，發(fā)現(xiàn)新異甘草苷等7 個(gè)化學(xué)成分既在OPLS-DA 中VIP＞1，即對(duì)該模型貢獻(xiàn)大，又經(jīng)t檢驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)其在2 個(gè)基原甘草藥材中的含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此最終確定該7 個(gè)化學(xué)成分是光果甘草和脹果甘草的差異化學(xué)成分。

4.3 差異化學(xué)成分分析

本研究找到的7 個(gè)差異化學(xué)成分在光果甘草和脹果甘草中均能檢出，屬于含量高低的區(qū)別。甘草查耳酮A 在脹果甘草中的含量高于光果甘草，甘草苷、異甘草苷和異甘草素在光果甘草中的含量高于脹果甘草，這與已有文獻(xiàn)報(bào)道一致[11,27]。本研究發(fā)現(xiàn)，新異甘草苷在光果甘草和脹果甘草中的含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其在光果甘草中的含量高于脹果甘草。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，新異甘草苷在甘草清熱解毒功效方面具有潛在生物活性[23]，此外，在不同生長(zhǎng)年限甘草中的含量也具有顯著差異[28]，本課題組將對(duì)該化學(xué)成分開展深入研究，進(jìn)一步考察其作為不同基原甘草藥材質(zhì)量控制指標(biāo)的可能性。

本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，甘草與脹果甘草和光果甘草存在明顯的化學(xué)成分差異。本研究進(jìn)一步分析了脹果甘草和光果甘草化學(xué)成分的差異，發(fā)現(xiàn)甘草查耳酮A 等7 個(gè)化學(xué)成分在脹果甘草和光果甘草中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。脹果甘草富含甘草查耳酮類成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化等作用，常被用于制備甘草提取物。光果甘草黃酮類成分具有抗炎及抑制酪氨酸酶的活性，是良好的黑色素抑制劑，常被用作美白類化妝品原料[29-31]。本研究結(jié)果為多基原甘草藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制定提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為多基原甘草藥材綜合開發(fā)利用提供參考。