呂菲菲，楊云，孫佩文，馮劍，劉培衛(wèi)，劉洋洋，徐艷紅*，魏建和，*

1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 海南分所/海南省南藥資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家中醫(yī)藥管理局沉香可持續(xù)利用重點(diǎn)研究室，海南 ?？?570311；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193

沉香是 瑞香科（Thymelaeaceae）沉 香屬（AquilariaLam.）或擬沉香屬植物傷害誘導(dǎo)防御反應(yīng)形成的含樹(shù)脂木材，是中國(guó)的傳統(tǒng)名貴中藥，廣泛應(yīng)用于中成藥、藏藥和日本漢方藥中[1-2]。因具有獨(dú)特的芳香氣味，沉香也被廣泛用于熏香香料行業(yè)，是高級(jí)香水香料的定香劑[3]。奇楠被認(rèn)為是品質(zhì)優(yōu)良的沉香，外表油潤(rùn)光滑，香味醇厚，味微苦、麻、辣、清涼[4]。中國(guó)產(chǎn)的奇楠沉香以野生采挖為主[5]，香農(nóng)在野外采香的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)某些白木香樹(shù)經(jīng)輕微傷害后可以持續(xù)地形成奇楠沉香，但這種優(yōu)良性狀很難通過(guò)有性繁殖而延續(xù)。近年來(lái)，香農(nóng)將采挖的野生奇楠沉香樹(shù)木進(jìn)行嫁接擴(kuò)繁，獲得了可穩(wěn)定遺傳的奇楠種質(zhì)，通過(guò)鉆孔法傷害成功地生產(chǎn)了奇楠沉香，由奇楠種質(zhì)生產(chǎn)的奇楠沉香已流通于市場(chǎng)。

倍半萜是沉香的主要成分之一，只有受傷害后才會(huì)在莖干、枝條和根內(nèi)大量合成，其組成和含量決定了沉香的藥用價(jià)值和芳香氣味[6]。奇楠種質(zhì)生產(chǎn)的奇楠沉香顏色重、油性大、香味獨(dú)特，明顯不同于普通白木香生產(chǎn)的沉香，可見(jiàn)2 種種質(zhì)生產(chǎn)的沉香中倍半萜組分和含量有所不同，但倍半萜合成差異的分子調(diào)控機(jī)制尚缺乏研究。倍半萜合酶是白木香傷害誘導(dǎo)合成倍半萜的關(guān)鍵催化酶，其活性受基因表達(dá)調(diào)控[7]。健康白木香中倍半萜合酶幾乎不表達(dá)，外界傷害刺激后，才會(huì)被激活誘導(dǎo)表達(dá)[8]，倍半萜合酶基因表達(dá)一定程度上決定了白木香受到傷害后倍半萜合成的種類和含量?；诖耍狙芯恳砸环N生產(chǎn)上的奇楠種質(zhì)和普通白木香種質(zhì)為研究對(duì)象，分析2 種種質(zhì)所結(jié)沉香倍半萜組分的差異，以及傷害早期顯著響應(yīng)的7 個(gè)倍半萜合酶基因（AsTPS2、AsTPS13、AsTPS14、AsTPS17、AsTPS18、AsTPS20、AsTPS23）誘導(dǎo)表達(dá)模式，初步分析這2 種種質(zhì)傷害誘導(dǎo)形成倍半萜差異的機(jī)制，也為沉香優(yōu)良結(jié)香種質(zhì)的鑒定和篩選、結(jié)香分子機(jī)制的解析提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥

奇楠種質(zhì)及其所結(jié)沉香取自廣東省茂名市電白區(qū)觀珠鎮(zhèn)，經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所采用DNA boarding 技術(shù)鑒定為白木香Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg。普通白木香種質(zhì)及其所結(jié)沉香取自海南省?？谑兄袊?guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所?？谘邪l(fā)中心。

乙醚（西隴科學(xué)股份有限公司）；液氮（純度＞99.99%，海南佳騰化工氣體有限公司）；EASY-spin plus RN38型植物RNA快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）；TransScript?First-Strand cDNA Synthesis SuperMix、TransStart?Top Green qPCR SuperMix、瓊脂糖均購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器

XPE 105 型電子天平（梅特勒-托利多公司）；7890A型氣相色譜-質(zhì)譜儀（安捷倫公司）；Nano Drop 2000C 超微量分光光度計(jì)（賽默飛世爾科技公司）；LightCycler?96 型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）儀（霍夫曼·羅氏公司）；SB25-12DTDN型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；MiniVac Beta 型真空離心濃縮干燥機(jī)（Labogene 公司）；ChemiDoc?XRS+型凝膠成像儀（Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 倍半萜提取與測(cè)定

沉香倍半萜提取參考文獻(xiàn)［9］方法，準(zhǔn)確稱取結(jié)香2 年沉香0.5 g，液氮研磨成粉，向粉末中加入乙醚5 mL，冰浴超聲提取30 min，靜置5 min，收集上清液備用。向沉淀中再次加入乙醚5 mL，重復(fù)提取2 次，合并3 次收集的上清液，真空旋轉(zhuǎn)干燥，向干燥物中加入乙醚1 mL 溶解，經(jīng)0.22 μm 濾膜濾過(guò)后，氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）測(cè)定化學(xué)組分。

GC 分析條件：毛細(xì)管柱為HP-5MS 5% Phenyl Silox（30 m×250 μm，0.25 μm）；載氣為氦氣；柱體積流量為1.0 mL·min-1，不分流；進(jìn)樣口溫度為240 ℃；升溫程序：初始柱溫60 ℃，保持2 min，5 ℃·min-1升至250 ℃，保持10 min，共運(yùn)行50 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源（EI）；電子能為70 eV；離子源溫度為230 ℃；四級(jí)桿溫度為150 ℃；質(zhì)量掃描范圍為m/z50～300。

2.2 莖干總RNA提取和cDNA合成

選取3 年生健康莖干，直徑為（1.2±0.2）cm，對(duì)莖干進(jìn)行全斷干傷害處理，并分別在傷害后0、2、6、24 h 截取傷口處2 cm 莖干（傷害誘導(dǎo)結(jié)香早期0～24 h 是傷害信號(hào)傳遞、防御反應(yīng)啟動(dòng)、基因誘導(dǎo)表達(dá)相對(duì)最活躍階段），立即投入液氮中冷凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

全斷干傷害處理莖干經(jīng)液氮研磨成粉，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取莖干總RNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 完整性，測(cè)定RNA 濃度。取所提取的RNA 約500 ng，根據(jù)要求反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，作為qRT-PCR模版。測(cè)定cDNA濃度。

2.3 qRT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)

根據(jù)本課題組白木香全基因組注釋的倍半萜合酶基因序列，采用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)特異性引物（表1），由廣州艾基生物有限公司合成，所有引物經(jīng)PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物由廣州艾基生物有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

qRT-PCR 檢測(cè)基因表達(dá)量：20 μL PCR 體系包含Mix enzyme 10 μL，10 μmol·L-1的上下游引物各1 μL，反轉(zhuǎn)錄所得cDNA 1 μL 和雙蒸水（ddH2O）7 μL。qRT-PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，按不同基因引物退火溫度退火15 s（表1），72 ℃延伸20 s，共40 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。實(shí)驗(yàn)設(shè)定3 個(gè)重復(fù)。以三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參[10]，將qRT-PCR 所得的樣品Ct值利用2-ΔΔCt方法轉(zhuǎn)化為基因相對(duì)表達(dá)量值。使用SPSS 1.1.0 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行單樣本t檢驗(yàn)顯著性分析，結(jié)果以（-x±s）表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 沉香倍半萜合酶基因引物和擴(kuò)增片段

3 結(jié)果與分析

3.1 倍半萜類成分差異

GC-MS 測(cè)定后，將測(cè)得的化合物與NIST 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，對(duì)匹配度＞75%的21個(gè)倍半萜及其衍生物進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)普通白木香所結(jié)的沉香中有17個(gè)，奇楠沉香中有16 個(gè)，在奇楠沉香中檢測(cè)到的香橙烯、檸檬烯、α-馬欖烯、石竹烯4個(gè)倍半萜類化合物在普通白木香結(jié)的沉香中沒(méi)有檢測(cè)到，而普通白木香所結(jié)沉香中存在的蛇麻烯、（-）-馬兜鈴烯、別香橙烯、長(zhǎng)葉醛、香橙烯氧化物1 也沒(méi)有在奇楠沉香中檢測(cè)到，可見(jiàn)2 種種質(zhì)所結(jié)沉香倍半萜組分差異較大。對(duì)兩者共有成分相對(duì)含量進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)倍半萜及其衍生物在兩者中的相對(duì)含量也有所不同，如普通白木香所結(jié)沉香中α-檀香醇的相對(duì)含量是奇楠沉香的6 倍左右，而奇楠沉香中α-愈創(chuàng)木烯相對(duì)含量是普通白木香所結(jié)沉香的2 倍有余（表2），綜上，奇楠沉香和普通白木香所結(jié)的沉香中倍半萜組分和含量差異明顯。

表2 普通白木香所結(jié)沉香和奇楠沉香中倍半萜及其衍生物對(duì)比（, n=3）

表2 普通白木香所結(jié)沉香和奇楠沉香中倍半萜及其衍生物對(duì)比（, n=3）

注：根據(jù)Duncan′s多區(qū)間統(tǒng)計(jì)分析，上標(biāo)不同字母代表各組間P＜0.05。

3.2 倍半萜合酶基因檢測(cè)

提取莖干的總RNA，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)明顯有18S 和28S 2 條帶，條帶清晰，無(wú)拖尾，28S/18S 約為1.5（圖1），說(shuō)明提取的莖干總RNA 質(zhì)量較好，經(jīng)反轉(zhuǎn)后可用于后續(xù)qRT-PCR檢測(cè)。

圖1 2種白木香莖干總RNA凝膠電泳

根據(jù)白木香全基因組（PRJNA524272）及前期白木香倍半萜合酶基因誘導(dǎo)表達(dá)模式[11]分析發(fā)現(xiàn)，傷害誘導(dǎo)結(jié)香早期顯著響應(yīng)的倍半萜合酶基因主要為AsTPS2、AsTPS13、AsTPS14、AsTPS17、AsTPS18、AsTPS20、AsTPS23。經(jīng)PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條帶大小與設(shè)計(jì)引物得到的片段大小基本一致（圖2）。將PCR產(chǎn)物測(cè)序，所得結(jié)果進(jìn)行BLAST 比對(duì)，所有序列比對(duì)結(jié)果均符合全基因組注釋結(jié)果，即所有擴(kuò)增產(chǎn)物為倍半萜合酶的DNA序列。

圖2 7個(gè)倍半萜合酶基因在傷害處理白木香莖干中PCR擴(kuò)增條帶

3.3 普通白木香倍半萜合酶基因傷害早期誘導(dǎo)表達(dá)

對(duì)已驗(yàn)證序列的7個(gè)傷害早期誘導(dǎo)表達(dá)倍半萜合酶基因進(jìn)行了qRT-PCR 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)普通白木香AsTPS2、AsTPS13、AsTPS14、AsTPS17、AsTPS18、AsTPS20、AsTPS23基因均響應(yīng)于傷害誘導(dǎo)，傷害24 h 內(nèi)基因表達(dá)量均先上升，2 h 達(dá)到最大值后下降，誘導(dǎo)表達(dá)最大相對(duì)倍數(shù)均在幾十倍到幾百倍，誘導(dǎo)表達(dá)強(qiáng)度明顯（圖3），說(shuō) 明AsTPS2、AsTPS13、AsTPS14、AsTPS17、AsTPS18、AsTPS20、AsTPS23均強(qiáng)烈響應(yīng)于普通白木香的早期傷害誘導(dǎo)，且誘導(dǎo)表達(dá)模式基本一致，呈先上升后下降的態(tài)勢(shì)。

圖3 不同傷害處理時(shí)間對(duì)普通白木香種質(zhì)中7個(gè)倍半萜合酶基因誘導(dǎo)表達(dá)水平的影響（, n=3）

3.4 奇楠種質(zhì)倍半萜合酶基因傷害早期誘導(dǎo)表達(dá)

經(jīng)qRT-PCR 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)除AsTPS18基因外，奇楠 種質(zhì)中的AsTPS2、AsTPS13、AsTPS14、AsTPS17、AsTPS20、AsTPS23基因也都響應(yīng)于傷害刺激，但各基因響應(yīng)傷害誘導(dǎo)的表達(dá)模式不同，AsTPS2、AsTPS13、AsTPS14、AsTPS17和AsTPS23基因在傷害誘導(dǎo)24 h 內(nèi)表達(dá)逐漸增強(qiáng)，基因表達(dá)量呈遞增態(tài)勢(shì)，AsTPS20則呈現(xiàn)先上升后下降的表達(dá)趨勢(shì)，傷害誘導(dǎo)6 h 表達(dá)量最高，這6 個(gè)倍半萜合酶基因傷害誘導(dǎo)24 h 內(nèi)最大表達(dá)相對(duì)倍數(shù)集中于十幾倍到幾十倍，與普通白木香相比誘導(dǎo)響應(yīng)強(qiáng)度較低（圖4）。AsTPS18基因在傷害誘導(dǎo)24 h 內(nèi)表達(dá)不明顯，6 h 達(dá)到最大表達(dá)量，僅為3.60，遠(yuǎn)低于普通白木香中的誘導(dǎo)相對(duì)表達(dá)量，其在奇楠種質(zhì)中可能不是早期響應(yīng)傷害的倍半萜合酶基因。說(shuō)明除AsTPS18外，其余6 個(gè)倍半萜合酶基因在奇楠種質(zhì)中均在傷害誘導(dǎo)結(jié)香早期有所響應(yīng)，但與普通白木香中的基因誘導(dǎo)表達(dá)模式不一致，誘導(dǎo)表達(dá)強(qiáng)度相對(duì)普通白木香較低。

圖4 不同傷害處理時(shí)間對(duì)奇楠種質(zhì)中7個(gè)倍半萜合酶基因表達(dá)水平的影響（, n=3）

3.5 健康奇楠種質(zhì)與普通白木香倍半萜合酶基因表達(dá)分析

為了進(jìn)一步探索2 種種質(zhì)的差異，對(duì)比了奇楠種質(zhì)和普通白木香健康莖干內(nèi)倍半萜合酶基因表達(dá)情況（圖5），發(fā)現(xiàn)普通白木香種質(zhì)中響應(yīng)早期傷害的7 個(gè)倍半萜合酶基因在健康莖干中幾乎不表達(dá)，而奇楠種質(zhì)中除AsTPS2與AsTPS20外，AsTPS13、AsTPS14、AsTPS17、AsTPS23和AsTPS18表達(dá)明顯，且高于健康白木香，說(shuō)明健康的奇楠種質(zhì)和普通白木香中倍半萜合酶基因的表達(dá)也存在明顯差異。

圖5 奇楠種質(zhì)和普通白木香健康莖干內(nèi)7個(gè)倍半萜合酶基因表達(dá)對(duì)比（, n=3）

4 討論

倍半萜是沉香的主要成分之一，其含量和組分在一定程度上決定了沉香的含油量和香味[4,12]。目前，奇楠種質(zhì)生產(chǎn)的奇楠沉香含油量高，香味醇厚，品質(zhì)明顯高于普通白木香種質(zhì)所結(jié)沉香。為了探索2種種質(zhì)結(jié)香差異及篩選優(yōu)良種質(zhì)，本研究選取一種市面上大量推廣嫁接的奇楠種質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其生產(chǎn)的奇楠沉香與普通白木香所結(jié)沉香的倍半萜組分有所不同，且共有組分含量差異也較大，說(shuō)明在相同傷害下，奇楠種質(zhì)和普通白木香種質(zhì)誘導(dǎo)合成沉香倍半萜的分子調(diào)控機(jī)制存在差異，兩者倍半萜組分和含量的差異可能是奇楠沉香品質(zhì)優(yōu)于普通白木香種質(zhì)的關(guān)鍵原因。該發(fā)現(xiàn)與大麻不同品種間萜類組分不同的研究結(jié)果相一致[13]。

倍半萜是沉香屬植物受傷害后形成的次生代謝產(chǎn)物，植物中多種因子協(xié)同調(diào)控其合成[14-17]。倍半萜合酶就是倍半萜合成的關(guān)鍵催化酶，可催化法呢烯焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP）形成不同的倍半萜骨架[7]。本研究發(fā)現(xiàn)普通白木香種質(zhì)中傷害誘導(dǎo)結(jié)香早期顯著誘導(dǎo)高表達(dá)的AsTPS2、AsTPS13、AsTPS14、AsTPS17、AsTPS20、AsTPS23基因在奇楠種質(zhì)中響應(yīng)強(qiáng)度較低，而AsTPS18基因在奇楠種質(zhì)中幾乎不響應(yīng)于早期傷害誘導(dǎo)，可見(jiàn)倍半萜合酶基因誘導(dǎo)表達(dá)機(jī)制在奇楠種質(zhì)和普通白木香種質(zhì)中差異顯著，表明2 種種質(zhì)傷害后啟動(dòng)防御反應(yīng)的機(jī)制有所不同，致使誘導(dǎo)合成倍半萜的組分和含量不同。此外，還發(fā)現(xiàn)AsTPS13、AsTPS14、AsTPS17、AsTPS23和AsTPS18基因在健康奇楠種質(zhì)中表達(dá)量顯著高于健康白木香，說(shuō)明奇楠種質(zhì)中倍半萜合酶基因表達(dá)更為敏感，這可能是盛傳的奇楠種質(zhì)不傷害也能產(chǎn)生奇楠沉香的原因。倍半萜合酶基因的差異表達(dá)機(jī)制是奇楠種質(zhì)和普通白木香種質(zhì)傷害誘導(dǎo)結(jié)香性能差異的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制，本研究首次從基因表達(dá)層面解析2 種種質(zhì)結(jié)香性能差異，對(duì)其深入研究有助于完善沉香形成機(jī)制，差異表達(dá)倍半萜合酶的篩選和論證將為新的分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)和沉香優(yōu)良結(jié)香種質(zhì)的鑒定提供參考。