劉瑞紅，周 全，2，楊 帆，2，吳麗杰，2，任瑞鵬，2，呂永康，2

(1.太原理工大學 省部共建煤基能源清潔高效利用國家重點實驗室，太原 030024；2.山西省工業(yè)與城市污水處理工程技術研究中心，太原 030024)

生物酶是一種綠色高效的催化劑，通常具有專一性強、反應條件溫和、催化效率高等優(yōu)點[1]，其催化效率是無機催化劑的107～1 013倍[2]。然而在實際應用中，天然游離酶容易失活，導致其穩(wěn)定性差、重復利用性低，限制了生物酶的廣泛應用。研究表明，固定化技術是解決天然游離酶技術缺陷的有效手段[3-5]。

固定化酶的催化活性在很大程度上取決于固定化的載體材料。近年來納米纖維如納米片、層層自組裝膜以及三維納米花、納米膠束和納米管等[6-9]已經(jīng)被用于固定化酶。其中納米纖維膜因具有比表面積大、負載能力強等優(yōu)點受到了人們的廣泛關注，但是在納米纖維外表面固定化的酶穩(wěn)定性較差。TAHERAN et al[10]在聚丙烯腈納米纖維膜表面固定漆酶，在催化底物2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)反應10次循環(huán)后，只保持了其初始活性的17%.ZEUNER et al[11]將乙醇脫氫酶固定在多孔的金屬陶瓷基納米纖維膜的表面，七個循環(huán)后該酶的殘留活性只有6%.

納米纖維的制備方法多種多樣，其中靜電紡絲法制備的納米纖維膜具有孔隙率高、比表面積大、性能可調(diào)控和容易與反應體系分離等優(yōu)點[12]。常規(guī)靜電紡絲方法有乳液靜電紡、同軸靜電紡和多頭噴絲等[13-14]。通過同軸靜電紡絲法制備的中空納米纖維[15]，可以將酶包埋在納米纖維內(nèi)空腔中，防止生物酶的流失，增強固定化酶的穩(wěn)定性。目前已經(jīng)報道的靜電紡絲納米纖維材料包括聚砜、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚丙烯腈、聚四氟乙烯等[16-17]，其中PVDF由于其出色的機械強度、耐化學腐蝕性和良好的熱穩(wěn)定性成為靜電紡絲材料的較好選擇[18-20]。

為了提高固定化酶的催化活性和穩(wěn)定性，本研究采用同軸靜電紡絲法，制備了中空型PVDF納米纖維膜，利用內(nèi)芯紡絲液中添加的多巴胺(dopamine，DA)原位聚合生成聚多巴胺(polydopamine，PDA)，將漆酶(Laccase)和辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)固定在中空納米纖維的內(nèi)空腔中，探討了外殼紡絲液中PVDF良溶液和不良溶液的溶劑比、紡絲溫度、干燥方式等靜電紡絲參數(shù)對PVDF中空納米纖維膜形貌及結構的影響，篩選了最優(yōu)的制備條件，并對在最優(yōu)條件下制備的PVDF中空納米纖維膜進行了掃描電子顯微鏡SEM、比表面積及孔徑、親疏水性等表征，探究了孔分布、親疏水性對固定化Laccase和HRP的儲存穩(wěn)定性、重復使用性的影響。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

聚偏氟乙烯(PVDF，相對分子質量100萬)；N，N-二甲基甲酰胺(DMF，C3H7NO，AR，99.5%)；丙酮(Acetone)；多巴胺鹽酸鹽；甘油(Glycerol，C3H8O3，≥99%)；異硫氰酸熒光素(FITC)；異硫氰酸羅丹明B熒光素(RBITC)；漆酶(Laccase，來源于云芝，≥0.5 U/mg)；辣根過氧化物酶(HRP，來源于辣根)；2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)；Tris-HCl緩沖液；牛血清蛋白(BSA)；Bradford蛋白試劑盒；高純水；磷酸鹽緩沖液(PBS).

1.2 實驗儀器

同軸靜電紡絲裝置(實驗室自裝)；掃描電子顯微鏡(JSM-IT200，日本，測試電壓20 kV)；氣體吸附分析儀(Autosorb-i3，美國)；接觸角測試儀(JC200C，上海梭倫信息科技有限公司)；激光共聚焦測試儀(OLYMPUS，型號：FV1200)；UV-分光光度計(752UV-vis，上海頻譜儀器有限公司)。

1.3 中空PVDF納米纖維膜的制備

采用同軸靜電紡絲制備PVDF中空納米纖維，實驗裝置如圖1所示。配置N，N二甲基甲酰胺(DMF)與丙酮的體積比分別為4∶6、5∶5、6∶4、7∶3的質量分數(shù)10%的PVDF聚合物溶液作為外殼紡絲液，甘油作為內(nèi)芯紡絲液并添加一定量的生物酶和多巴胺(DA).同軸靜電紡絲參數(shù)為：殼層PVDF溶液進料速率2 mL/h、內(nèi)芯酶溶液進料速率0.6 mL/h、施加(10±1) kV電壓、接收器距噴嘴端15 cm、濕度(35±1)%、靜電紡絲溫度分別為(20±1) ℃、(25±1) ℃、(30±1) ℃，收集PVDF納米纖維膜4 h，然后將收集到的納米纖維膜浸入500 mL超純水中，溶去內(nèi)芯的甘油得到PVDF中空型納米纖維，取出沖洗，在三種不同條件下干燥，-20 ℃保存，觀察納米纖維形貌。

圖1 靜電紡絲裝置圖Fig.1 Coaxial electrospinning device

1.4 生物酶在PVDF納米纖維中的固定化

將內(nèi)芯添加DA、Laccase和HRP的PVDF中空納米纖維膜浸入到0.1 mol/L、pH=7.4的Tris-HCl緩沖液中，DA原位聚合生成PDA固定酶，用Bradford法測定流失到緩沖液中的酶的含量，分析酶在PVDF中空納米纖維中的固定效果。固定酶后，將納米纖維膜從緩沖液中取出，室溫自然風干，-20 ℃保存。為了證實酶被固定在PVDF中空納米纖維中，用異硫氰酸熒光素(FITC)和異硫氰酸羅丹明B熒光素(RBITC)分別標記的牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)代替兩種酶固定，在激光共聚焦顯微鏡下觀測。

1.5 固定化酶PVDF納米纖維親疏水性測試

內(nèi)芯溶液分別加入0 mg/mL、0.2 mg/mL、2 mg/mL DA，制備固定化酶的PVDF中空納米纖維。將制備的納米纖維膜剪成2 cm×2 cm大小的正方形，在接觸角測試儀下測量接觸角，分析材料親疏水性。

1.6 固定化酶的活性與酶穩(wěn)定性測試

以2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)為底物檢測固定化Laccase和HRP的活性。將2 cm×2 cm的PVDF中空納米纖維膜(膜的質量為25 mg，負載酶2 mg)放入反應體系，用UV-分光光度計在420 nm檢測1 min內(nèi)待測量溶液的吸光度變化，計算酶活性，并計算在不同時間間隔時吸光度變化值與時間的比值，表示其酶促反應速率。固定化酶與游離酶的對比實驗中，加入游離酶的量和固定化酶的含量相同。測定了兩種游離酶和固定化酶在7天內(nèi)的儲存穩(wěn)定性，以及重復反應10次的重復使用性。

2 結果與討論

2.1 同軸靜電紡絲參數(shù)對PVDF納米纖維膜形貌與結構的影響

2.1.1溶劑比的影響

紡絲液的黏度會影響PVDF中空納米纖維的形貌。良溶劑DMF和不良溶劑丙酮的比例不同，PVDF聚合物紡絲液的黏度也不同，因此制備了DMF與丙酮體積比分別為4∶6、5∶5、6∶4、7∶3的PVDF納米纖維膜，形貌如圖3所示。當DMF與丙酮體積比為4∶6時(圖2(a))，纖維呈現(xiàn)帶狀，有部分粘連和破損；當DMF與丙酮體積比為5∶5時(圖2(b))，纖維之間相互粘連；當溶劑比為6∶4時(圖2(c))，纖維直徑分布不均勻；當溶劑比為7∶3時(圖2(d))，單根纖維幾乎沒有粘連，且直徑分布均勻。這是由于當DMF與丙酮體積比為7∶3時，外殼紡絲液的黏度和同軸靜電紡絲的參數(shù)相匹配，電場力能夠克服表面張力，形成Taylor錐實現(xiàn)穩(wěn)定噴射流，隨之高分子射流拉伸形成絲狀聚合物纖維，溶劑在拉絲伸長的過程中不斷揮發(fā)，最后沉積到滾筒接收器上形成具有規(guī)整形貌的PVDF納米纖維膜。

DMF與丙酮的體積比分別為(a)4∶6、(b)5∶5、(c)6∶4、(d)7∶3圖2 DMF與丙酮不同體積比時PVDF納米纖維膜載體的SEM圖Fig.2 SEM images of PVDF nanofiber membrane carrier with different volume ratio of DMF to acetone

2.1.2溫度的影響

溫度影響溶劑丙酮的揮發(fā)從而影響紡絲液的黏度，因此探究了溫度對PVDF中空納米纖維形貌的影響。在溫度分別為(20±1) ℃、(25±1) ℃和(30±1) ℃時制備了PVDF中空納米纖維膜，形貌如圖3所示，當溫度為(20±1) ℃、(25±1) ℃時，單根纖維幾乎粘連成塊(圖3(a)和圖3(b)).粘連的主要原因是溫度過低，紡絲過程中溶劑不能及時揮發(fā)，纖維沉積導致單根纖維中的溶劑互溶。這種粘連成塊的纖維結構會影響底物與酶的接觸，降低固定化酶的活性。當溫度為(30±1) ℃時溶劑在紡絲過程中及時揮發(fā)，呈現(xiàn)出均勻規(guī)整的PVDF納米纖維形貌(圖3(c)).

DMF與丙酮的體積比為7∶3，(a) (20±1) ℃，(b) (25±1) ℃，(c) (30±1) ℃圖3 不同溫度下PVDF納米纖維膜載體的SEM圖Fig.3 SEM images of PVDF nanofiber membrane carrier at different electrospinning temperatures

2.1.3干燥方式的影響

考慮到酶對溫度的耐受性，我們對載體的干燥方式做了探究。用上述優(yōu)化的電紡參數(shù)制備PVDF納米纖維膜，浸入水中溶去內(nèi)芯的甘油，然后采用40 ℃真空干燥、室溫下自然風干、冷凍干燥3種不同方式干燥，PVDF納米纖維膜的截面結構如圖4所示。采用真空干燥(圖4(a))，PVDF納米纖維膜中空結構變癟，破裂；采用冷凍干燥(圖4(c))，PVDF納米纖維膜截面拉伸撕裂，并且分層；將PVDF纖維膜放在通風柜中，室溫下自然風干，干燥之后中空結構完整(圖4(b)).因此，自然風干能維持PVDF納米纖維的中空結構。

圖4 不同干燥方式下PVDF納米纖維膜載體橫截面的SEM圖Fig.4 SEM images of the cross section of PVDF nanofiber membrane carrier with different drying conditions

2.1.4PVDF納米纖維膜的孔結構

經(jīng)靜電紡絲參數(shù)的優(yōu)化，在溶劑比7∶3、溫度為(30±1) ℃時電紡，自然干燥，可制備出直徑均勻的PVDF中空納米纖維膜。納米纖維的孔道結構是酶與底物的接觸通道[21]，因此進一步對PVDF中空納米纖維的孔結構進行探究。PVDF中空納米纖維膜載體表面形貌如圖5所示。單根纖維表面有大量孔隙?？椎男纬墒怯捎谕饧与妷菏沟镁酆衔镆旱螏щ姡芤褐须姾赊D移，在噴絲時造成了PVDF聚合物與溶液的相分離，且DMF與丙酮混合溶劑的沸點降低，溶劑揮發(fā)在纖維表面形成了大小隨機的孔隙。為了進一步研究PVDF中空納米纖維表面的孔結構，對PVDF中空納米纖維膜做了氮氣吸脫附實驗，結果如圖6所示，PVDF中空納米纖維膜的比表面積為20.557 m2/g，孔徑分布在3～5 nm、20～40 nm左右，大于底物的尺寸，為底物與酶的接觸提供了物理通道。

圖5 PVDF中空納米纖維膜載體表面形貌Fig.5 SEM image of the surface morphology of PVDF nanofiber membrane carrier

圖6 PVDF納米纖維膜的氮氣吸脫附曲線(a)和孔徑分布圖(b)Fig.6 (a)Nitrogen adsorption-desorption curves and (b) pore size distribution of PVDF nanofiber membrane

2.2 生物酶在PVDF中空納米纖維內(nèi)空腔中的固定化

Laccase與HRP具有催化活性，可以與熒光分子發(fā)生反應而無法進行標記。Laccase與HRP的本質是蛋白質[22-23]，因此，為了確認Laccase和HRP這兩種生物酶可以固定在PVDF中空納米纖維中，在最佳同軸靜電紡絲參數(shù)條件下，將具有綠色熒光FITC標記的BSA和紅色熒光RBITC標記的BSA代替Laccase和HRP加入內(nèi)芯紡絲液，制備熒光標記的PVDF中空納米纖維。將帶有FITC和RBITC標記BSA的PVDF中空納米纖維膜浸在0.1 mol/L、pH=7.4的Tris-HCl緩沖液中4 h固定熒光標記蛋白，在激光共聚焦顯微鏡(CLSM)下觀察固定化BSA后的PVDF中空納米纖維膜，結果如圖7所示。固定有兩種熒光標記蛋白的納米纖維在488 nm處發(fā)出綠色熒光(圖7(a))，在559 nm處發(fā)出紅色熒光(圖7(b))，綠色熒光和紅色熒光照片疊加，顯示出黃色(圖7(c))，與明場照片中納米纖維一一對應(圖7(d))，表明2種熒光標記的BSA是在納米纖維內(nèi)部均勻分布的。內(nèi)芯添加的DA原位聚合生成PDA[24]可以將生物酶均勻地固定在PVDF中空納米纖維的內(nèi)空腔中。采用Bradford法測定酶流失的量，計算得到81.3%的Laccase和HRP被固定在PVDF中空納米纖維中。

圖7 固定化FITC-BSA和RBITC-BSA的PVDF納米纖維膜的激光共聚焦圖Fig.7 CLSM images of PVDF nanofiber membrane with FITC-BSA and RBITC-BSA

2.3 固定化酶的PVDF中空納米纖維膜的親疏水性

在酶固定化的過程中，DA聚合生成的PDA與PVDF中空納米纖維復合時，會改變PVDF中空納米纖維膜載體本身的親疏水性[25]。因此我們制備了內(nèi)芯紡絲液中DA質量濃度分別為0 mg/mL、0.2 mg/mL、2 mg/mL的PVDF纖維膜，接觸角測試如圖8所示。當內(nèi)芯紡絲液中不添加DA時(圖8(a))，纖維膜載體的接觸角為104.4°，其疏水性強歸因于PVDF材料表面的F元素[26]。加入DA后，接觸角逐漸降低顯示出親水性，這是由于生成的PDA中含有—OH和—NH3親水性基團導致的。PDA改善了PVDF載體的強疏水性，有利于載體固定化生物酶后參與水環(huán)境中的催化反應。

2.4 PVDF中空納米纖維膜固定化酶的催化活性與存儲穩(wěn)定性

通過檢測Laccase/HRP-PDA@PVDF的催化活性，發(fā)現(xiàn)固定化之后2種酶Laccase/HRP的酶催化活性保持了游離酶的80%，比文獻中報道的固定化酶的活性(50%)高[27]。這歸因于PVDF中空納米纖維載體表面的孔結構為Laccase/HRP與底物的接觸提供了有效的物理通道，此外PDA在中空納米纖維內(nèi)部形成了一層親水層，對酶的親和力使得固定化酶穩(wěn)定性提高[28]。

Laccase/HRP-PDA@PVDF與相同含量的游離酶在4 ℃磷酸鹽緩沖液(pH值為7.4)中的存儲穩(wěn)定性如圖9所示。圖9(a)是固定化酶和游離酶與ABTS反應產(chǎn)生的紫外吸收強度隨儲存時間的變化曲線，圖9(b)是固定化酶和游離酶的相對活性隨儲存時間的變化。圖9(a)表明游離酶的最初活性高于固定化酶，但是游離酶活性急劇下降，固定化酶的活性衰減緩慢，在第一天出現(xiàn)交叉點，從第二天開始固定化酶的活性高于游離酶。儲存7 d后游離的Laccase/HRP的酶活性降低了60%，而Laccase/HRP-PDA@PVDF的活性只降低了18%，固定化酶仍保持初始活性的82%.這歸因于Laccase/HRP固定在PVDF中空納米纖維的內(nèi)空腔中，外層的聚合物對纖維內(nèi)部的生物酶起保護作用，避免外部環(huán)境對酶活性的影響；而且內(nèi)空腔中用來固定酶的PDA讓納米纖維膜載體更加親水，對酶有親和作用，所以固定化酶的存儲穩(wěn)定性高于游離酶。

內(nèi)芯紡絲液中DA的質量濃度為：(a) 0 mg/mL、(b) 0.2 mg/mL、(c) 2 mg/mL圖8 PVDF納米纖維膜載體的接觸角示意圖Fig.8 Contact angle images of PVDF nanofiber membrane

圖9 游離酶和固定化酶在4 ℃磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)中的存儲穩(wěn)定性Fig.9 Storage stability of free and immobilized enzymes in 4 ℃ phosphate buffer (pH=7.4)

2.5 固定化酶的重復使用性

重復使用性是酶固定化的重要性能之一，因此我們檢測了固定化Laccase/HRP的PVDF中空納米纖維膜重復反應10次的催化活性，如圖10所示。從圖中可以看出，進行10個反應操作后，固定化酶仍保持初始活性的40%以上，比文獻[10-11]報道的重復使用性好。這是由于除了外層PVDF聚合物的保護作用，內(nèi)部原位生成的PDA將Laccase/HRP固定在納米纖維的內(nèi)空腔中，降低了酶的流失。

圖10 Laccase/HRP-PDA@PVDF催化底物ABTS的重復使用性Fig.10 Laccase/HRP-PDA@PVDF reusability test by catalyzing substrate ABTS

2.6 固定化酶的反應速率

酶被固定在PVDF中空納米纖維的內(nèi)部活性較高、穩(wěn)定性良好，但聚合物殼層會影響底物與內(nèi)空腔中固定化酶的接觸，進而對固定化酶的反應速率產(chǎn)生影響。為此，以ABTS作反應底物，計算了游離Laccase/HRP和固定化酶Laccase/HRP-PDA@PVDF分別在1～5 min、5～10 min、10～20 min區(qū)間內(nèi)紫外吸光度與時間的比值ΔA/ΔT，以此表示反應速率，結果如圖11所示。實驗顯示在反應最開始固定化酶的速率低于游離酶，這是由于聚合物管壁對底物擴散進入中空納米纖維的阻礙造成的；而在10 min后固定化酶的速率比游離酶高，可能是由于Laccase/HRP兩種酶在中空納米纖維內(nèi)部形成了底物通道提高了催化活性；在20 min時，固定化酶的反應速率與游離酶相當，說明這時反應都趨近了平衡。

圖11 游離Laccase/HRP和Laccase/HRP-PDA@PVDF分別在1～5 min、5～10 min、10～20 min區(qū)間內(nèi)的反應速率Fig.11 Reaction rate of free Laccase/HRP and Laccase/HRP-PDA@PVDF in the interval of 1～5 min, 5～10 min, and 10～20 min

3 結論

1) 探究了同軸靜電紡絲參數(shù)如溶劑比、溫度、干燥方式等對PVDF中空納米纖維膜載體形貌的影響，最佳紡絲條件為DMF和丙酮的溶劑比7∶3、溫度為(30±1) ℃、自然干燥。

2) 在最佳紡絲條件下制備PVDF中空納米纖維，在其內(nèi)空腔中原位生成PDA并固定化2種酶Laccase和HPR，測試了固定化酶的親疏水性、催化活性、存儲穩(wěn)定性和重復使用性。與游離酶相比，固定化Laccase/HRP的穩(wěn)定性大大提高，在4 ℃磷酸鹽緩沖液中存儲7 d仍保持其初始活性的82%，固定化酶在進行10個反應操作后仍保持其初始活性的40%以上，研究結果表明同軸靜電紡絲法制備的表面多孔的PVDF中空納米纖維膜是酶固定化的優(yōu)良載體。