許明召，景凱，崔貴，李易桐，邢涪涵

食管癌是全球與癌癥相關(guān)死亡的第六大原因，全世界每年報(bào)告近33萬新發(fā)病例，每年死于食管癌的人數(shù)超過27萬例[1]。盡管食管癌診斷技術(shù)和治療手段在不斷的進(jìn)步，但是由于食管癌患者早期無明顯癥狀，通常在晚期時被確診，其預(yù)后仍然較差[2]。由于致癌物暴露和營養(yǎng)缺乏，中國是食管癌的高危地區(qū)，情況更為嚴(yán)重，因此迫切需要探索食管癌新的治療手段以改善患者的預(yù)后[3]。微小RNA(microRNA, miRNA)是小的內(nèi)源性非編碼RNA，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用[4]。miR-522是與腫瘤惡性進(jìn)展密切相關(guān)的miRNA之一，研究報(bào)道其在不同的腫瘤中發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。研究顯示，miR-522在卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌等腫瘤中發(fā)揮抑癌作用[5-6]；而在骨肉瘤、肝細(xì)胞肝癌和胃癌等腫瘤中發(fā)揮促癌作用，密切調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥等惡性生物學(xué)行為[7-9]，可作為抗腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。但miR-522在食管癌中尚未有研究報(bào)道，因此，現(xiàn)觀察miR-522在食管癌中的表達(dá)水平及作用，旨在獲得miR-522作為抗食管癌潛在分子靶點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年1月—2015年6月遼寧省健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán)阜新礦總醫(yī)院心胸外科行食管癌根治性手術(shù)60例，患者術(shù)前未接受過任何形式的治療，病理證實(shí)為食管癌組織。其中男33例，女27例；年齡：≤60歲26例，>60歲34例；腫瘤大小：<3 cm 40例，≥3 cm 20例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：無 21例，有 39例；TNM分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期14例，Ⅲ期15例，Ⅳ期13例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 觀測指標(biāo)與方法

1.2.1 不同組織miR-522表達(dá)檢測：將手術(shù)中留取的食管癌和癌旁組織(距離腫瘤5 cm的非癌食管組織) 加入Trizol裂解液(北京百奧萊博科技有限公司)，移至EP管中加入氯仿，低溫高速離心20 min，吸取上層液體加入異丙醇試劑混勻，低溫高速離心20 min，加入無水乙醇洗滌2次后加入DEPC液，獲得組織總RNA。采用OneStep RT-PCR試劑盒(德國Qiagen公司)進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，其體系為QIAGEN One Step RT-PCR Buffer 4 μl、dNTP Mix 1 μl 、QIAGEN One Step RT-PCR Enzyme Mix 0.8 μl、上下游引物各0.4 μl、RNA 1 μg和DEPC液補(bǔ)足20 μl。反應(yīng)條件為逆轉(zhuǎn)錄50℃ 30 min、95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)，72℃終延伸10 min。miR-522上游引物：5’-TTTGGATCCAGCTAACCTGCTGATTCTTTG-3’，下游引物：5’-TAAGAATTCAGGTCGCAGTGAGCAGAGT-3’；GAPDH上游引物：5’-CTGGGCTACACTGAGCACC-3’，下游引物：5’-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3’。按照2-ΔΔCt公式以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算miR-522的相對表達(dá)量。miR-522和內(nèi)參GAPDH引物由上海生工試劑公司合成。

1.2.2 食管癌細(xì)胞系培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：食管癌細(xì)胞系GES-1、MKN1和Eca109及人正常食管黏膜上皮細(xì)胞系HEEC(中國科學(xué)院細(xì)胞庫)均采用含有10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基(美國Gibco公司)培養(yǎng)，放置在5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞長滿時采用胰酶(美國Gibco公司)消化進(jìn)行細(xì)胞傳代。收集細(xì)胞斑塊，加入Trizol裂解液提取細(xì)胞總RNA。采用qRT-PCR檢測各個細(xì)胞系中miR-522的表達(dá)水平。miR-522表達(dá)最高的Eca109細(xì)胞以每孔2×105個接種至6孔板中，隨機(jī)分為NC組和miR-522抑制劑組，細(xì)胞貼壁后采用脂質(zhì)體2000進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。NC組轉(zhuǎn)染10 pmol/L NC 抑制劑，miR-522 抑制劑組轉(zhuǎn)染10 pmol/L miR-522 抑制劑(廣州瑞博生物試劑有限公司)，培養(yǎng)48 h后采用qRT-PCR檢測NC組和miR-522 抑制劑組Eca109細(xì)胞中miR-522的表達(dá)。

1.2.3 食管癌細(xì)胞增殖檢測:NC組和miR-522 抑制劑組分別以每孔1 500個Eca109細(xì)胞重懸至150 μl培養(yǎng)基中，每組設(shè)置6個重復(fù)孔接種至96孔板中。分別在貼壁后的0 h、24 h、48 h和72 h時，更換新鮮培養(yǎng)基并加入 MTS試劑20 μl(美國Sigma公司)，放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，采用酶標(biāo)儀檢測NC組和miR-522 抑制劑組Eca109細(xì)胞在490 nm處的吸光度(OD值)。

1.2.4 食管癌細(xì)胞周期檢測：胰酶消化收集NC組和miR-522 抑制劑組食管癌Eca109細(xì)胞，PBS緩沖液洗滌3次后按照細(xì)胞周期檢測試劑盒(上海碧云天生物試劑有限公司)說明書進(jìn)行染色，以每管6×105個Eca109細(xì)胞中加入500 μl染色緩沖液、 PI染色試劑25 μl和RNA酶10 μl混勻，37℃避光孵育30 min，于流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，F(xiàn)low Jo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 食管癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移檢測：NC組和miR-522 抑制劑組食管癌Eca109細(xì)胞胰酶消化后，無血清培養(yǎng)基洗滌3次，以每孔1×105個Eca109細(xì)胞重懸至無血清培養(yǎng)基100 μl中，接種至Transwell小室(美國Coring公司)上室膜上，下室加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基500 μl作為趨化因子，每組設(shè)置3個重復(fù)孔。放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h后終止細(xì)胞培養(yǎng)。將Transwell小室膜上室面未穿過的細(xì)胞擦去后，PBS緩沖液洗滌3次后甲醇固定10 min，吉姆薩染色10 min后在顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞穿膜數(shù)目。

1.2.6 食管癌細(xì)胞蛋白檢測：胰酶消化收集NC組和miR-522 抑制劑組食管癌Eca109細(xì)胞，加入蛋白裂解液(上海貝博生物科技公司)，超聲裂解細(xì)胞30 min，離心后將上清移至新EP管中，獲得細(xì)胞總蛋白。并采用BCA試劑盒(美國Thermo公司)檢測蛋白濃度，加熱煮沸蛋白變性后上樣進(jìn)行凝膠電泳，80 V電泳2 h，并350 mA將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(美國Promega公司)上。5%封閉液室溫孵育1 h，TBST洗滌3次后，與一抗稀釋液4℃孵育過夜(CyclinD1、CDK4、CDK6、E-cadherin、N-cadherin、Snail稀釋液均為1∶500，抗體均購自美國cell signaling公司)，與二抗稀釋液室溫孵育2 h，蛋白條帶采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(上海慧穎生物科技有限公司)進(jìn)行曝光。

2 結(jié) 果

2.1 不同組織miR-522表達(dá) 食管癌組織 miR-522相對表達(dá)量為(2.11±0.81)，高于癌旁組織的表達(dá)(1.44±0.75)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.912，P=0.000)。

2.2 食管癌細(xì)胞系及HEEC細(xì)胞中miR-522表達(dá)比較 miR-522在食管癌細(xì)胞系TE-1、TE-8、Eca109和人正常食管上皮細(xì)胞系HEEC中的表達(dá)水平分別(3.39±0.60)、(4.78±0.89)、(6.66±0.67)和(1.14±0.06)， miR-522在食管癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于人正常食管上皮細(xì)胞HEEC，其中在Eca109細(xì)胞中的表達(dá)最高(F=40.427，P=0.000)，因此選擇Eca109細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)miR-522的功能研究。

2.3 miR-522 抑制劑轉(zhuǎn)染效果 NC組miR-522的表達(dá)量為(1.00±0.04)，高于miR-522抑制劑組的 (0.32±0.06)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=16.334,P=0.000)。

2.4 miR-522抑制劑對Eca109細(xì)胞增殖能力的影響 MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NC組0 h、24 h、48 h、72 h OD值分別為0.29±0.01、0.62±0.10、1.01±0.13、1.35±0.07，miR-522抑制劑組分別為0.29±0.01、0.40±0.05、0.55±0.12、0.75±0.15。2組24 h、48 h、72 h比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.557、4.623、6.412,P=0.024、0.010、0.003)。

2.5 miR-522 抑制劑對Eca109細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NC組細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)為(68.67±8.23)個，高于miR-522 抑制劑組的(24.33±6.27)個，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=7.421,P=0.001)，見圖1。

圖1 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測miR-522對Eca109細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響

2.6 miR-522抑制劑對Eca109細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,NC組Eca109細(xì)胞G1、S、G2期分別為(58.80±3.94)%、(23.37±2.98)%、(16.50±4.75)%，miR-522抑制劑組分別為(69.10±4.75)%、(18.00±0.01)%、(12.91±3.73)%。與NC組比較，miR-522抑制劑組Eca109細(xì)胞僅G1期細(xì)胞顯著增加(t=2.885、2.598、1.281，P=0.045、0.060、0.269)。

2.7 miR-522抑制劑對Eca109細(xì)胞周期和EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western-blot結(jié)果顯示,與NC組比較，miR-522抑制劑組細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1、CDK4、CDK6表達(dá)降低(t/P=8.521/0.000,5.792/0.002,7.746/0.001)，EMT相關(guān)蛋白N-cadherin、Snail表達(dá)降低(t/P=7.359/ 0.001,8.133/0.000)，E-cadherin蛋白表達(dá)增加(t/P=6.264/0.002),見圖2。

圖2 miR-522抑制劑對Eca109細(xì)胞周期和EMT相關(guān)蛋白的影響

2.8 食管癌組織miR-522表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 miR-522的表達(dá)在食管癌患者性別、年齡和腫瘤大小間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期表達(dá)均升高(P<0.05)，見表1。

表1 miR-522表達(dá)在不同食管癌患者臨床/病理參數(shù)中比較Tab.1 Comparison of miR-522 expression in esophagealcancer patients with different clinical/pathological parameters

2.9 miR-522的表達(dá)水平對食管癌患者預(yù)后的影響 以miR-522表達(dá)水平2.11為界值，將60例食管癌患者分為miR-522高表達(dá)亞組(32例)和miR-522低表達(dá)亞組(28例)。隨訪5年，Kaplan-Meier繪制患者生存曲線，Log Rank結(jié)果顯示，miR-522高表達(dá)亞組患者預(yù)后較miR-522低表達(dá)亞組預(yù)后差(χ2=4.468，P=0.035)，見圖3。

圖3 miR-522不同表達(dá)水平食管癌患者預(yù)后比較

3 討 論

食管癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，具有很高的致死率，其發(fā)病率和病死率在全球范圍內(nèi)存在差異，在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)的地區(qū)較為普遍[1]。食管癌的治療手段主要包括手術(shù)切除、化療、放療和分子靶向治療，現(xiàn)有的治療手段未能改善患者的預(yù)后，目前接受治療的食管癌患者5年生存率僅為25%～30%[2]。食管癌的主要危險(xiǎn)因素是飲酒、吸煙和引起食管黏膜慢性刺激的疾病[3]，但是其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，因此研究食管癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用的分子，是尋找用于治療食管癌分子靶標(biāo)的重要途徑。

miRNA是一類長度為20～25個核苷酸的非編碼RNA，雖然不具備編碼蛋白質(zhì)的功能，但可通過抑制其靶基因的翻譯或通過與3’非翻譯區(qū)結(jié)合而使其靶mRNA降解來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。超過50% miRNA的靶基因位于與腫瘤相關(guān)的基因組區(qū)域，表明miRNA與腫瘤的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[4]。在食管癌中異常表達(dá)并發(fā)揮重要作用的miRNA被越來越多報(bào)道。miR-522在多種人體組織中表達(dá)，并在子宮內(nèi)膜癌、骨肉瘤、肝細(xì)胞肝癌等多種類型的腫瘤中表達(dá)失控，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6-8]。苗志龍等[8]報(bào)道m(xù)iR-522在肝細(xì)胞肝癌組織中表達(dá)顯著升高，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分級較差及患者預(yù)后較差顯著相關(guān)，miR-522過表達(dá)可作為肝細(xì)胞肝癌患者預(yù)后不良的生物標(biāo)志物。miR-522在食管癌中的表達(dá)及意義未知，而本研究發(fā)現(xiàn)，食管癌組織中高表達(dá)的miR-522與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和不良預(yù)后相關(guān)，與miR-522在肝細(xì)胞肝癌中表達(dá)的臨床意義相似，同時也表明miR-522高表達(dá)促進(jìn)食管癌的惡性進(jìn)展，可能是食管癌患者預(yù)后不良的生物分子標(biāo)志物。同時本研究檢測了miR-522在食管癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，miR-522在4株食管癌細(xì)胞系中的表達(dá)顯著高于人正常食管上皮細(xì)胞系HEEC中的表達(dá)，與在組織水平的表達(dá)相一致，可以進(jìn)行miR-522在食管癌細(xì)胞中的功能研究。

在胃癌細(xì)胞中外泌體分泌來源的miR-522通過抑制鐵死亡促進(jìn)胃癌細(xì)胞化療耐藥，在骨肉瘤和肝細(xì)胞肝癌中miR-522促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[7,9-10]，提示miR-522與腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移等腫瘤惡性生物學(xué)行為相關(guān)。而本研究顯示，抑制miR-522的表達(dá)后，食管癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力降低，與miR-522在其他癌種的研究一致，均發(fā)揮促癌作用，但是作用機(jī)制需進(jìn)一步探討。研究顯示，細(xì)胞周期與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，其調(diào)控紊亂不受控制后是導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖的主要機(jī)制之一[11]。在肝細(xì)胞肝癌中miR-522過表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖、集落形成和細(xì)胞周期G1期至S期的進(jìn)程，并促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)的表達(dá)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-522的表達(dá)后，食管癌細(xì)胞周期阻滯在G1期，表明miR-522在食管癌中同樣通過調(diào)控細(xì)胞周期促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖，與Zhang等[10]的報(bào)道一致。而細(xì)胞周期進(jìn)程是機(jī)體通過細(xì)胞周期蛋白及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)等一系列蛋白經(jīng)過嚴(yán)格的調(diào)控機(jī)制完成的，CDKs是包括20個蛋白激酶的家族，其中CDK4和CDK6通過與CyclinD1特異性結(jié)合促進(jìn)G1期至S期的進(jìn)程[12]。本研究采用Western-blot檢測結(jié)果顯示，抑制miR-522的表達(dá)后食管癌細(xì)胞中CyclinD1、CDK4和CDK6蛋白的表達(dá)均減少，表明miR-522通過調(diào)控G1/S期的細(xì)胞周期蛋白加速細(xì)胞周期進(jìn)程進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖。EMT是促進(jìn)惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制，上皮標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)減少及間皮標(biāo)志物N-cadherin蛋白表達(dá)增加促進(jìn)EMT，Snail1通過抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄而誘導(dǎo)EMT[13-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-522表達(dá)后食管癌細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)增加，N-cadherin和Snail1蛋白表達(dá)減少。表明miR-522通過調(diào)控EMT促進(jìn)食管癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，與Xu等[7]在骨肉瘤中的報(bào)道一致。

綜上所述，miR-522在食管癌中表達(dá)上調(diào)，與食管癌惡性進(jìn)展相關(guān)，干擾miR-522的表達(dá)后通過調(diào)控細(xì)胞周期抑制細(xì)胞增殖及通過抑制EMT降低細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力。miR-522可能是食管癌預(yù)后不良的分子標(biāo)志物和抗腫瘤治療的潛在分子靶標(biāo)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

許明召、崔貴：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；景凱：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;李易桐：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改;邢涪涵：課題設(shè)計(jì)，論文撰寫