張鏡偉 馬勝利 謝程國(guó)

前列腺癌的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)不斷上升，特別是在老年人群中，其發(fā)病率和死亡率均較高[1-2]。雄激素剝奪療法(androgen deprivation therapy, ADT)是目前前列腺癌治療最有效的策略，盡管早期ADT有效率達(dá)90%以上[3-4]，但幾乎所有患者在治療2～3年后，均不可避免地出現(xiàn)對(duì)ADT耐藥，晚期前列腺癌仍然是一種不治之癥[5-8]。因此，需要進(jìn)一步研究前列腺癌的發(fā)病機(jī)制，開發(fā)新的治療手段。

微小RNA(miRNA)是一類通過(guò)與靶基因的3′非編碼區(qū)(UTR)相結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控靶基因水平的小RNA分子[9]。目前研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可以作為細(xì)胞周期調(diào)控因子[10-11]，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[12-15]。miRNA-155(miR-155)是一個(gè)受抑癌基因p53調(diào)節(jié)的小RNA分子，在多種腫瘤細(xì)胞中呈低表達(dá)[16-17]，且與腫瘤進(jìn)展相關(guān)[18-19]。然而，有關(guān)miR-155在前列腺癌中的作用尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究旨在探討miR-155在前列腺癌中的表達(dá)及其與患者預(yù)后之間的關(guān)系，揭示miR-155對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖能力的影響，為前列腺癌的靶向治療提供潛在新靶點(diǎn)。

材料與方法

一、材料和試劑

收集我院臨床前列腺癌和相應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本(2019年1月至2020年1月)各30例，所有參與本研究的患者均給予知情同意，本研究得到廣州市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。熒光定量PCR反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增試劑盒均購(gòu)自Takara公司；MTS細(xì)胞增殖定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；主要使用的抗體包括 cyclin D1(ab16663)、cyclin E2(ab40890)、GAPDH (ab8245)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；ECL熒光底物試劑盒購(gòu)自美國(guó) Pierce公司。miR-155抑制劑(miR212529133043-1-10)和相應(yīng)的對(duì)照RNAs購(gòu)自廣州銳博公司。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

人前列腺癌細(xì)胞株DU145和正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)，RWPE-1細(xì)胞在角質(zhì)細(xì)胞血清游離培養(yǎng)液(Gbico，Grand Island，NY)+1%青霉素和鏈霉素混合液中培養(yǎng)；DU145在含有10%胎牛血清(Gbico)+1%青霉素和鏈霉素組合的DMEM (Gbico)中培養(yǎng)。所有細(xì)胞在37 ℃標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)條件下(5% CO2，95%濕度)生長(zhǎng)。

三、qRT-PCR檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，采用Trizol/氯仿/異丙醇法提取細(xì)胞總RNA，通過(guò)微量核酸蛋白定量?jī)x(NanoDrop 2000)測(cè)定所提取RNA的濃度及純度；然后，參照Takara公司的PrimeScriptTMRT Reagent Kit試劑盒說(shuō)明書，將總RNA(1 μg)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；按照Takara公司的PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)試劑盒說(shuō)明書，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所需引物序列如表1所示。記錄各組CT值并采用公式2-ΔΔCT對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，得到各個(gè)細(xì)胞株中基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 熒光定量PCR所需的各基因引物序列

四、Western blot檢測(cè)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞3次，然后加入細(xì)胞裂解緩沖液裂解細(xì)胞，經(jīng)超聲、離心后去掉其他細(xì)胞成分，使用微量核酸蛋白定量?jī)x測(cè)定各蛋白樣品的濃度及純度；加入5×SDS上樣緩沖液在沸水中煮沸10 min以使蛋白充分變性；配液10%的SDS聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜、封閉，并在4 ℃條件下與一抗孵育過(guò)夜；二抗室溫孵育2 h，采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的蛋白表達(dá)，并進(jìn)行灰度值分析。

五、MTS細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

按照MTS細(xì)胞增殖定量檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟，將100 μl完全培養(yǎng)液中的2 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板中，在37 ℃和5% CO2條件下培養(yǎng)1～5 d，然后每隔24 h在培養(yǎng)液中加入10 μl MTS，37 ℃條件下孵育4 h后，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔吸光度值，根據(jù)結(jié)果繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

六、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞以每孔500個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)7 d。用4%多聚甲醛溶液固定，0.1%結(jié)晶紫液染色，于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)在50個(gè)以上的克隆形成數(shù)目。

七、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用 D-Hanks清洗3遍后加入不含胎牛血清的培養(yǎng)液靜置過(guò)夜，然后用預(yù)冷PBS清洗3次，使用預(yù)冷75%乙醇固定細(xì)胞，放置于4 ℃冰箱內(nèi)過(guò)夜；上機(jī)前離心去除乙醇，PBS洗滌3次后，加入100 μl RNase A，于37 ℃水浴條件下放置30 min；然后加400 μl的PI溶液，4 ℃避光染色1 h；在流式細(xì)胞儀上，根據(jù)測(cè)定DNA的含量確定細(xì)胞周期各期的百分比。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、前列腺癌組織及細(xì)胞中miR-155的表達(dá)水平

采用qRT-PCR檢測(cè)臨床前列腺組織標(biāo)本中miR-155的表達(dá)水平，如圖1所示，miR-155在腫瘤組織中的表達(dá)水平(0.27±0.03)明顯低于癌旁組織(1.02±0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；且與miR-155高表達(dá)組相比，miR-155低表達(dá)組患者的Gleason評(píng)分、臨床分期更高，總體生存情況更差(P<0.05)，而年齡、PSA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05, 表2)。同樣，我們也檢測(cè)了miR-155在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，結(jié)果與臨床標(biāo)本相一致，miR-155在前列腺癌細(xì)胞DU145、PC-3、LNCaP、C4-2中的表達(dá)水平低于正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1中的表達(dá)水平，且在DU145細(xì)胞中表達(dá)最低(圖2，P<0.05)。

圖1 miR-155在前列腺癌組織中的表達(dá) (**P<0.01)

圖2 miR-155在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)

表2 miR-155表達(dá)與前列腺癌患者臨床特征之間的關(guān)系(例)

二、miR-155過(guò)表達(dá)抑制前列腺癌細(xì)胞增殖能力

為了探討miR-155在前列腺癌細(xì)胞中的生物學(xué)作用，我們通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-155 mimics或者加入miR-155抑制劑至DU145細(xì)胞培養(yǎng)液中，過(guò)表達(dá)/沉默miR-155表達(dá)。如圖3所示，miR-155過(guò)表達(dá)后，DU145細(xì)胞的增殖速率明顯減慢，平板克隆形成數(shù)目明顯減少，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而加入miR-155抑制劑后，則結(jié)果相反(P<0.05)。

A：平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力；B：MTS細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力(*P<0.05)圖3 miR-155抑制前列腺癌細(xì)胞增殖能力

三、miR-155過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1/S期阻滯

我們進(jìn)一步探討miR-155對(duì)細(xì)胞周期分布的影響及其機(jī)制。結(jié)果如圖4A所示，相比miR-NC組細(xì)胞，miR-155 mimics組細(xì)胞G1期細(xì)胞百分比從(46.61±2.45)%增加到(71.92±3.68)%，而S期細(xì)胞百分比則由(38.77±4.12)%減少到(25.46±8.57)%，細(xì)胞周期G1/S期的進(jìn)展表現(xiàn)出明顯阻滯；而且miR-155過(guò)表達(dá)后，cyclin D1、cyclin E2蛋白表達(dá)水平降低，說(shuō)明miR-155可能通過(guò)下調(diào)細(xì)胞周期素的表達(dá)抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖(圖4B)。

A：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況；B：Western blot檢測(cè)miR-155表達(dá)對(duì)cyclin D1、cyclin E2表達(dá)的影響圖4 miR-155表達(dá)誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞周期阻滯

四、miR-155通過(guò)靶向MYC抑制前列腺癌細(xì)胞增殖

為了探究miR-155下游的生物靶點(diǎn)，通過(guò)TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_80/)microRNA靶基因預(yù)測(cè)工具，我們發(fā)現(xiàn)原癌基因MYC是miR-155的潛在靶點(diǎn)(圖5A)；且miR-155可以下調(diào)MYC表達(dá)水平(圖5B)。挽救實(shí)驗(yàn)證明，MYC過(guò)表達(dá)后，可以逆轉(zhuǎn)miR-155介導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，以及細(xì)胞周期素cyclin D1、cyclin E2的下調(diào)(圖5C)，說(shuō)明MYC 是miR-155的關(guān)鍵下游靶點(diǎn)。

討 論

近年來(lái)，miRNA作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要調(diào)控因子，在腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中受到越來(lái)越多的關(guān)注。在許多類型的癌癥(如肝癌、結(jié)腸癌)中，miR-155能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和分化，并抑制細(xì)胞凋亡[20-21]。然而，在某些類型的癌癥(如胃癌)中，miR-155又起到相反的作用——如抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[22]。因此，miR-155在不同類型的癌細(xì)胞中要么作為腫瘤致癌因子，要么作為腫瘤抑制因子。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-155在前列腺癌細(xì)胞中起腫瘤抑制作用。

A：miR-155與MYC 3′UTR結(jié)合位點(diǎn)示意圖；B：Western blot檢測(cè)miR-155表達(dá)對(duì)MYC表達(dá)的影響；C：MTS細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力(*P<0.05)；D：Western blot檢測(cè)cyclin D1、cyclin E2表達(dá)水平圖5 miR-155通過(guò)靶向MYC抑制前列腺癌細(xì)胞增殖

有研究報(bào)道m(xù)iR-155在前列腺癌中低表達(dá)[23]；然而，miR-155在前列腺癌中的作用尚未完全闡明。本研究發(fā)現(xiàn)miR-155在前列腺癌中抑制DU145細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯。miR-155在結(jié)腸癌中抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[24]，這與本研究結(jié)果一致。 細(xì)胞周期失控可導(dǎo)致細(xì)胞增殖異常，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要組成部分。細(xì)胞周期的過(guò)程受多個(gè)控制點(diǎn)的調(diào)控，其中G1/S和G2/M是最重要的調(diào)控點(diǎn)[25]。cyclin D1是調(diào)節(jié)G1/S檢測(cè)點(diǎn)最關(guān)鍵的蛋白，它與cyclin D1-CDK4結(jié)合激活CDK4，導(dǎo)致RB蛋白高磷酸化而失活，進(jìn)而引起轉(zhuǎn)錄因子E2F的釋放，從而驅(qū)動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期[26]。本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-155顯著抑制了cyclin D1的表達(dá)，提示過(guò)表達(dá)miR-155可能通過(guò)G1/S限制點(diǎn)下調(diào)cyclin D1來(lái)抑制細(xì)胞增殖。對(duì)于其機(jī)制研究，我們發(fā)現(xiàn)miR-155通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)，靶向結(jié)合cyclin D1上游蛋白MYC，MYC通過(guò)上調(diào)cyclin D1和cyclin E2表達(dá)，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)展，在腫瘤中發(fā)揮致癌作用。miR-155靶向沉默MYC基因，因此，在前列腺癌中誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1/S阻滯，抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖。

綜上所述，miR-155在前列腺癌組織及細(xì)胞中呈低表達(dá)，miR-155過(guò)表達(dá)可能通過(guò)靶向沉默MYC，下調(diào)cyclin D1和cyclin E2的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1/S期阻滯并抑制前列腺癌細(xì)胞增殖。因此，miR-155可能在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。但是，本研究中僅采用了一個(gè)前列腺癌細(xì)胞系，也缺乏體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，miR-155 影響細(xì)胞周期蛋白的潛在機(jī)制尚有待進(jìn)一步深入研究。