楊 航，楊志剛，張 龍

( 1.上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306； 2.上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部魚類營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心，上海 201306； 3.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306 )

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)，俗稱河蟹，為我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)主要的淡水蟹類養(yǎng)殖種類之一，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。蛻殼是中華絨螯蟹必經(jīng)的生理過程，中華絨螯蟹長(zhǎng)至成熟通常蛻殼約20次，并且在幼蟹階段會(huì)蛻殼約11次[1-3]。然而，在實(shí)際養(yǎng)殖中，由于蟹蛻殼的存活率低，導(dǎo)致中華絨螯蟹養(yǎng)殖的成本提高，影響了養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)效益[4-6]。

鈣是中華絨螯蟹蛻殼不可缺少的物質(zhì)。中華絨螯蟹外殼及體內(nèi)的鈣會(huì)隨著舊外殼的蛻去而流失，蛻殼后蟹會(huì)從水體、食物等來(lái)源中獲取和吸收鈣質(zhì)[7-9]。已有研究表明，肝胰腺和鰓均與鈣離子交換有關(guān)[10-12]。實(shí)際養(yǎng)殖過程中，在蟹大面積蛻殼季節(jié)到來(lái)時(shí)，養(yǎng)殖戶會(huì)往蟹塘中投入適量的鈣制劑(如磷酸二氫鈣)，以保證中華絨螯蟹能攝入足夠的鈣離子，避免其在蛻殼時(shí)死亡[13]。不過，關(guān)于中華絨螯蟹的鈣離子交換機(jī)制的研究較少。

目前，蛻殼死亡率高仍是中華絨螯蟹養(yǎng)殖需解決的問題。筆者通過對(duì)不同蛻殼時(shí)期的中華絨螯蟹的肝胰腺和鰓中的鈣含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)合組織學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，觀察組織結(jié)構(gòu)的變化，分析鈣網(wǎng)蛋白基因表達(dá)量，初步探究蛻殼周期內(nèi)中華絨螯蟹鈣離子的變化情況，以期為進(jìn)一步研究如何提高中華絨螯蟹蛻殼的存活率，增加中華絨螯蟹養(yǎng)殖產(chǎn)量，擴(kuò)大養(yǎng)殖效益提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2019年4月在上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院進(jìn)行。中華絨螯蟹為1年生幼蟹，取自上海市崇明縣上海海洋大學(xué)崇明基地，平均體質(zhì)量(5.63±2.35) g。將蟹養(yǎng)殖在配置有循環(huán)水系統(tǒng)的雙層玻璃養(yǎng)殖缸內(nèi)，每層養(yǎng)殖缸內(nèi)部用塑料板分隔成約20 cm×20 cm的隔間，每個(gè)隔間放1～2只蟹。試驗(yàn)期間自然水溫，自然光節(jié)律，人工充氧，每日更新約1/4的水，每日傍晚投喂，喂食前清除殘餌。

1.2 樣品采集

通過觀察中華絨螯蟹外殼顏色的深淺變化和腹部縫線的開裂情況，初步區(qū)分蛻殼間期和蛻殼前期的蟹，之后采用文獻(xiàn)[14]的方法在光鏡下確定蛻殼時(shí)期。一般規(guī)定中華絨螯蟹在蛻下舊殼后的0.5 h內(nèi)為蛻殼期。在蟹蛻下舊殼的0.5 h后直至新殼未完全硬化之前為蛻殼后期。通常將中華絨螯蟹的蛻殼時(shí)期分為4個(gè)時(shí)期，分別是蛻殼間期(C期)、蛻殼前期(D期)、蛻殼期(E期)及蛻殼后期(AB期)[15]。根據(jù)文獻(xiàn)[14]確定中華絨螯蟹的蛻殼時(shí)期，收集不同蛻殼時(shí)期的樣本，每個(gè)時(shí)期至少10只蟹。解剖前將中華絨螯蟹置于冰上使其休克。肝胰腺和鰓的樣品第1部分保存于-20 ℃冰箱用于鈣含量的測(cè)定，第2部分保存于波恩氏固定液中用于蘇木精—伊紅染色，第3部分保存于-80 ℃冰箱用于熒光定量PCR。

1.3 鈣含量測(cè)定

肝胰腺和鰓的鈣含量測(cè)定采用鈣測(cè)定試劑盒(甲基百里香酚藍(lán)比色法，南京建成生物工程研究所)，單位以質(zhì)量摩爾濃度表示(mmol/g)，蛋白含量采用蛋白定量測(cè)試盒(考馬斯亮藍(lán)法，南京建成生物工程研究所)測(cè)定。根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。

1.4 常規(guī)蘇木精—伊紅染色

將肝胰腺和鰓樣品在波恩氏固定液中固定12 h后，用梯度體積分?jǐn)?shù)的乙醇脫水，用二甲苯透明，石蠟包埋，旋轉(zhuǎn)切片機(jī)切片，切片厚度為5 μm，用蘇木精—伊紅進(jìn)行常規(guī)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察顯微結(jié)構(gòu)。

1.5 熒光定量PCR

采用Trizol法提取肝胰腺和鰓樣品的總RNA后，用熒光定量專用反轉(zhuǎn)錄試劑進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，得到的反應(yīng)液進(jìn)行熒光定量PCR。采用7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)，用熒光定量預(yù)混液(南京諾唯贊生物科技有限公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。擴(kuò)增在96孔板中進(jìn)行，每個(gè)樣品具有3個(gè)平行孔。用中華絨螯蟹的β-actin基因作為內(nèi)參，本實(shí)驗(yàn)室的轉(zhuǎn)錄組庫(kù)中的中華絨螯蟹的鈣網(wǎng)蛋白基因序列作為參考序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。引物序列見表1，實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)采用10 μL的體系。使用比較閾值循環(huán)(2-ΔΔCt)公式計(jì)算轉(zhuǎn)錄物水平。

表1 相關(guān)引物及其序列Tab.1 Primers and their sequences

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，P<0.05時(shí)為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。采用GraphPad Prism 7.0軟件繪圖，Adobe Illustrator CS 5修圖。采用SPSS 24.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用Levene檢驗(yàn)方法檢測(cè)方差齊次性，當(dāng)不滿足使用齊性方差時(shí)進(jìn)行反正弦或平方根處理，然后對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析和Duncan′s多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 鈣含量

在肝胰腺中，蛻殼后期的鈣質(zhì)量摩爾濃度顯著高于其他3個(gè)時(shí)期(P<0.05)，蛻殼間期、蛻殼前期和蛻殼期之間未見顯著差異(P>0.05)(圖1)。在鰓中，蛻殼前期的鈣含量最高，蛻殼期的鈣質(zhì)量摩爾濃度最低，蛻殼間期與蛻殼前期無(wú)顯著差異，蛻殼期與蛻殼后期無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖2)。

圖1 不同蛻殼時(shí)期中華絨螯蟹肝胰腺中的鈣質(zhì)量摩爾濃度Fig.1 Calcium molality in hepatopancreas of Chinese mitten crab E. sinensis during the molting cycle不同字母表示差異顯著，相同字母表示差異不顯著，下同.Means with different letters are significant difference, and means with same letter are not significant difference, et sequentia.

圖2 不同蛻殼時(shí)期中華絨螯蟹鰓中的鈣質(zhì)量摩爾濃度Fig.2 Calcium molality in gill of Chinese mitten crab E. sinensis during the molting cycle

2.2 組織學(xué)觀察

通過光學(xué)顯微鏡觀察肝胰腺組織蘇木精—伊紅染色的切片，在蛻殼間期(圖3a～b)和蛻殼前期(圖3c～d)，肝胰腺肝小管的細(xì)胞中有較多內(nèi)容物，染色較深；在蛻殼期(圖3e～f)和蛻殼后期(圖3g～h)，肝胰腺肝小管中的細(xì)胞內(nèi)容物減少，染色較淺。通過光學(xué)顯微鏡觀察鰓組織蘇木精—伊紅染色的切片，蛻殼間期(圖4a～b)和蛻殼前期(圖4c～d)的鰓沒有顯著差異，鰓葉末端有邊緣管結(jié)構(gòu)，且上皮細(xì)胞層與外層角質(zhì)層分離成空腔。在蛻殼期(圖4e～f)，鰓的上皮細(xì)胞層與外層角質(zhì)層松散分離，鰓葉末端邊緣管處的空腔較大。在蛻殼后期(圖4g～h)，鰓的邊緣管結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常形態(tài)，空腔恢復(fù)正常形態(tài)。

圖3 不同蛻殼時(shí)期中華絨螯蟹肝胰腺的組織學(xué)觀察Fig.3 Histological observation of the hepatopancreas of Chinese mitten crab E. sinensis during the molting cyclea～b.蛻殼間期； c～d.蛻殼前期； e～f.蛻殼期； g～h.蛻殼后期； Co.細(xì)胞內(nèi)容物； Rc.儲(chǔ)存細(xì)胞； Bc.吸收細(xì)胞； Fc.纖維細(xì)胞； Ec.胚胎細(xì)胞.a—b.intermolt; c—d.premolt; e—f.ecdysis; g—h.postmolt; Co.cell content; Rc.resorptive cell; Bc.bulliform cell; Fc.fibrillar cell; Ec.embryonic cell.

圖4 不同蛻殼時(shí)期中華絨螯蟹鰓的組織學(xué)觀察Fig.4 Histological observation of the gill of Chinese mitten crab E. sinensis during the molting cyclea～b.蛻殼間期； c～d.蛻殼前期； e～f.蛻殼期； g～h.蛻殼后期； Pc.柱狀細(xì)胞； El.上皮細(xì)胞； Cu.角質(zhì)層； Mv.邊緣管； Ha.血淋巴； ICu.內(nèi)角質(zhì)層； OCu.外角質(zhì)層.a—b.intermolt; c—d.premolt; e—f.ecdysis; g—h.postmolt; Pc.pillar cell; El.epithelial layer; Cu.cuticle; Mv.marginal vessel; Ha.hemocyte; ICu.inter cuticle; OCu.outer cuticle.

2.3 鈣網(wǎng)蛋白基因表達(dá)量

熒光定量PCR的分析結(jié)果表明，在肝胰腺中，鈣網(wǎng)蛋白基因的表達(dá)量在蛻殼前期最低，在蛻殼期最高(P<0.05)(圖5～6)。與蛻殼期的表達(dá)量相比，蛻殼后期的表達(dá)量略有降低，但變化不顯著(P>0.05)。在鰓中，鈣網(wǎng)蛋白基因的表達(dá)量在蛻殼前期最低，在蛻殼后期最高(P<0.05)。表達(dá)量在蛻殼期和蛻殼后期逐漸升高，但變化不顯著(P>0.05)。

圖5 不同蛻殼時(shí)期中華絨螯蟹肝胰腺中的鈣網(wǎng)蛋白基因的表達(dá)分析Fig.5 Expression of CRT mRNA in hepatopancreas of Chinese mitten crab E. sinensis during the molting cycle

圖6 不同蛻殼時(shí)期中華絨螯蟹鰓中的鈣網(wǎng)蛋白基因的表達(dá)分析Fig.6 Expression of CRT mRNA in gill of Chinese mitten crab E. sinensis during the molting cycle

3 討 論

3.1 鈣含量

在蛻殼后期，肝胰腺中的鈣含量顯著增加，可能是中華絨螯蟹在蛻殼后從外界攝入鈣質(zhì)，以促進(jìn)機(jī)體功能恢復(fù)及進(jìn)行外殼礦化[16]。中華絨螯蟹通常通過兩種途徑獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，一種是從食物中攝入，另一種是從水體中攝入。食物中攝入的鈣質(zhì)儲(chǔ)存在肝胰腺，水體中攝入的鈣質(zhì)通過鰓轉(zhuǎn)運(yùn)至機(jī)體內(nèi)。已經(jīng)有研究表明，中華絨螯蟹的鰓具有交換與運(yùn)輸離子的功能[17-21]。中華絨螯蟹在蛻殼前會(huì)補(bǔ)充大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及鈣質(zhì)，以確保蛻殼順利完成。因此，在蛻殼間期和蛻殼前期，鰓中的鈣含量較高。中華絨螯蟹完成蛻殼后，機(jī)體中的鈣質(zhì)流失嚴(yán)重，結(jié)合切片觀察結(jié)果，中華絨螯蟹的鰓在蛻殼期的結(jié)構(gòu)尚未恢復(fù)正常形態(tài)，此時(shí)可能無(wú)法發(fā)揮正常功能，并且剛蛻完殼的蟹身體機(jī)能較為虛弱，通常蟄伏不動(dòng)，不進(jìn)食不活動(dòng)，所以鰓中的鈣含量在蛻殼期較低[22]。

3.2 組織學(xué)觀察

通過觀察蘇木精—伊紅染色的切片結(jié)果，在肝胰腺中觀察到的細(xì)胞內(nèi)容物有可能是某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因?yàn)檫@些內(nèi)容物隨著蛻殼的進(jìn)行，在蛻殼前期較多，在蛻殼期消失，直到蛻殼后期逐漸出現(xiàn)，符合中華絨螯蟹在蛻殼過程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的變化趨勢(shì)。中華絨螯蟹的鰓具有兩層角質(zhì)層，內(nèi)角質(zhì)層與上皮細(xì)胞緊密貼合形成上皮細(xì)胞層，外角質(zhì)層在邊緣管處與上皮細(xì)胞層形成空腔，這種空腔結(jié)構(gòu)與中華絨螯蟹交換鈣離子的過程有關(guān)[23]。在蛻殼期，外角質(zhì)層與上皮細(xì)胞層明顯分散，這是由于中華絨螯蟹蛻殼會(huì)將舊鰓一起蛻去，剛蛻完殼的蟹形成的新鰓尚未發(fā)育完全，上皮細(xì)胞層還未與外角質(zhì)層完全貼合。

3.3 鈣網(wǎng)蛋白基因表達(dá)量

在分子生物學(xué)層面，中華絨螯蟹的蛻殼是由多個(gè)基因協(xié)同參與形成[24]。其中，鈣網(wǎng)蛋白功能廣泛，對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡有重要作用[25-27]。在1個(gè)蛻殼周期內(nèi)，中華絨螯蟹處于蛻殼間期的時(shí)間最長(zhǎng)，因此將蛻殼間期的鈣網(wǎng)蛋白基因的表達(dá)量作為其他3個(gè)時(shí)期的參照。在肝胰腺和鰓中，與蛻殼前期相比，蛻殼期和蛻殼后期的鈣網(wǎng)蛋白基因表達(dá)量相對(duì)較高，表明蛻殼期和蛻殼后期的鈣網(wǎng)蛋白基因的表達(dá)過程較活躍，此變化趨勢(shì)與Xu等[28]對(duì)擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)的研究結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

綜上，在蛻殼周期內(nèi)，中華絨螯蟹肝胰腺及鰓中的鈣含量、組織結(jié)構(gòu)及鈣網(wǎng)蛋白基因表達(dá)量的變化較為明顯。中華絨螯蟹在蛻殼前后的鈣含量變化差異較大，肝胰腺中的鈣含量在蛻殼后期顯著升高，可能表明中華絨螯蟹在蛻殼后的鈣離子交換過程較活躍。蘇木精—伊紅染色結(jié)果顯示，在蛻殼期，中華絨螯蟹鰓的鰓葉末端邊緣管處未形成正?？涨唬Y(jié)合鰓中的鈣含量結(jié)果，推測(cè)此結(jié)構(gòu)可能與鈣離子交換過程有關(guān)。熒光定量PCR結(jié)果顯示，鈣網(wǎng)蛋白基因在不同蛻殼時(shí)期的表達(dá)量變化明顯，表明鈣網(wǎng)蛋白基因與鈣離子交換過程有密切關(guān)系。本試驗(yàn)中，對(duì)蛻殼周期內(nèi)中華絨螯蟹的鈣含量、組織學(xué)和鈣網(wǎng)蛋白基因表達(dá)的初步研究結(jié)果，可為中華絨螯蟹蛻殼和鈣轉(zhuǎn)運(yùn)更深入的研究提供一定理論基礎(chǔ)。