王 微，張 霞，張人俊，胡安東，楊 穎,4，溫貴蘭,4，文 明,4*

(1.貴州大學 動物科學學院，貴州 貴陽 550025;2.貴州省動物疫病預防控制中心，貴州 貴陽 550008;3.貴州農(nóng)業(yè)職業(yè)學院，貴州 清鎮(zhèn) 551400;4.貴州省動物生物制品工程技術研究中心，貴州 貴陽 550025)

禽流感是一種人獸共患傳染病，由A型流感病毒引起，主要威脅和危害家禽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)和人類健康安全。A型流感病毒屬正黏病毒科成員，其基因組分節(jié)段、單股負鏈RNA。根據(jù)病毒囊膜蛋白即血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)抗原性不同，A型流感病毒可分為18個HA亞型和11個NA亞型，其中H5亞型和H7亞型屬于高致病性禽流感病毒。H6亞型雖屬低致病性禽流感病毒，但在禽類中普遍存在，能跨越種間屏障進行傳播，且容易與其他亞型禽流感病毒發(fā)生基因重組，形成新的高致病性禽流感病毒亞型如H5N1亞型、H5N6亞型禽流感病毒等，對家禽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)和人類健康安全構成巨大的威脅。目前檢測禽流感抗體主要采用血凝與血凝抑制試驗方法，也有H5亞型和H7亞型禽流感抗體ELISA檢測方法，但尚未見到有關H6亞型禽流感抗體ELISA檢測方法的研究報道。為此，本試驗擬通過克隆H6亞型禽流感病毒H6基因并進行原核表達，以原核表達產(chǎn)物為包被抗原，建立檢測H6亞型禽流感病毒抗體ELISA方法，以期為H6亞型禽流感流行病學調(diào)查和隱性感染監(jiān)測提供有效的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

H6N6亞型禽流感病毒，由貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室保存；EcoliDH5α和pET-32α(+)，由貴州省動物疫病研究室保存；H6亞型AIV標準陽性血清(20191012)和陰性血清(20191020)、H5亞型AIV陽性血清(20190811)、H7亞型AIV陽性血清(20190618)和新城疫陽性血清(20191024)，購自青島立見診斷技術發(fā)展中心；待檢雞血清樣本1837份，由省動物疫病預防控制中心采自全省9個市(州)養(yǎng)雞場。

1.2 主要試劑和儀器設備

DNA連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶、RNA提取試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、BCA Protein Assay Kit、BSA、胎牛血清等，購自寶生物(大連)工程有限公司；PCRMix、DL2 000Marker、瓊脂糖等，購自天根生化科技(北京)有限公司；純化Ni柱，購自北京韋氏博慧色譜科技有限公司；脫脂奶粉、HRP標記山羊抗雞IgG、Tween-20、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒等，購自北京索萊寶科技有限公司；其他試劑，均為分析純。

1.3 目的蛋白表達、純化與鑒定

..目的基因獲取與表達質(zhì)粒構建

參考GenBank上禽流感病毒H6基因序列(登錄號KJ484613)，利用Primer5.0軟件設計H6基因特異性引物(H6-F:5′-GAATTCGAAGATGATTGCCATCATTATAATAACG-3′[含EcoR I酶切位點]/H6-R:5′-CGGATCCTATACATCATACATTGCATTGA GC-3′ [含Hind III酶切位點]，預期擴增長度1714 bp，由上海英淮捷基有限公司合成)。雞胚增殖病毒，收集尿囊液，以RNA提取試劑盒提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以上述引物擴增目的基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，回收目的基因，酶切并與同樣處理的pET-32α(+)連接，轉(zhuǎn)化EcoliDH5α，提取重組質(zhì)粒進行PCR、酶切和測定鑒定。

..目的蛋白表達、純化與鑒定

取鑒定含H6基因的陽性重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌進行IPTG誘導表達，取4.5 h表達的細菌菌液，經(jīng)超聲波處理后收集離心沉淀物，適量PBS溶液懸浮，Ni柱純化，收集純化產(chǎn)物，透析袋反透析濃縮，以BCA Protein Assay Kit進行蛋白質(zhì)含量測定和Western blotting鑒定。

1.4 基于H6蛋白禽流感抗體間接ELISA檢測方法的建立

..間接ELISA操作步驟

以上述純化并濃縮的表達蛋白溶液，以PBS稀釋為10 μg/mL，取96孔酶標板，加入100 μL/孔，4 ℃孵育過夜，PBST液洗滌5次；加入5%脫脂奶粉200 μL/孔，37 ℃溫箱封閉l h，洗滌5次；加入稀釋待檢血清100 μL/孔，37 ℃溫箱孵育30 min，洗滌5次；加入HRP-羊抗雞抗體100 μL/孔，37 ℃溫箱孵育30 min，加入顯色液100 μL/孔，避光顯色10 min，加入終止液50 μL/孔，酶標儀測定OD值，判斷和分析結果。

..間接ELISA反應條件優(yōu)化

采用方陣滴定法，即取表達蛋白稀釋成不同濃度后包被酶標板，以H6亞型標準陽性血清和陰性血清不同稀釋度進行方陣滴定試驗，測定OD值，計算P/N值確定最佳抗原包被濃度和血清稀釋度；以最佳抗原包被濃度進行包被，以不同溫度和不同時間進行孵育，按照上述步驟進行ELISA檢測，測定OD值，計算P/N值確定最佳包被條件；以最佳抗原包被濃度和包被條件進行包被，以不同封閉液進行封閉2 h，按照上述步驟進行ELISA檢測，測定OD值，計算P/N值確定最佳封閉液；以上述最佳條件進行包被和封閉，開展酶標二抗?jié)舛扰c最佳顯色時間優(yōu)化，確定間接ELISA檢測方法的反應條件。

..間接ELISA臨界值確定

按照上述優(yōu)化的ELISA反應條件對已知H6亞型禽流感陰性血清15份進行檢測，計算OD值的平均值X和標準差SD，根據(jù)統(tǒng)計學計算方法，以OD值≥X+3SD判為陽性，OD值

..間接ELISA重復性、特異性和敏感性試驗

取已知H6亞型禽流感陰性血清15份，每個樣本作5個重復進行ELISA檢測，測定其OD值，計算其變異系數(shù)；取H6亞型AIV陽性血清和陰性血清、H5亞型AIV陽性血清、H7亞型AIV陽性血清和新城疫陽性血清進行適當稀釋后進行ELISA檢測，測定其OD值，確定其反應特異性；以H6亞型AIV陽性血清作系列梯度稀釋后進行ELISA檢測，測定其OD值，確定其反應靈敏度。

1.5 基于H6蛋白禽流感抗體間接ELISA檢測方法初步應用

取本實驗室近三年收集得到的全省各地部分規(guī)模養(yǎng)雞場血清樣本1837份(其中2017年505份、2018年608份和2019年724份)，按照上述優(yōu)化條件的ELISA進行禽流感H6亞型禽流感抗體檢測，計算待檢樣本的H6亞型禽流感抗體陽性率。

2 結果與分析

2.1 重組H6亞型蛋白的表達與純化鑒定

..重組H6亞型蛋白的表達

如圖1所示，在預期位置出現(xiàn)明顯的蛋白條帶，重組目的蛋白分子量約為65 ku，說明目的蛋白能成功地得到表達，且表達產(chǎn)物主要存在于細菌的包涵體沉淀中。

注：M.蛋白Marker；1.含空載體菌上清；2.含空載體菌沉淀；3.空白細菌對照；4.重組菌沉淀產(chǎn)物；5.重組菌上清產(chǎn)物；6.純化上清蛋白；7.純化沉淀蛋白。圖1 重組蛋白表達產(chǎn)物SDS-PAGE分析結果Fig.1 SDS-PAGE analysis of recombinant protein expression product

..重組H6亞型蛋白的純化鑒定

如圖2所示，經(jīng)鎳柱純化后Western blotting檢測，重組蛋白能與His單抗產(chǎn)生特異性反應，說明表達的重組蛋白具有良好的抗體結合能力，可用于下一步間接ELISA檢測方法的建立。

注：M.蛋白Marker；1.表達蛋白樣本1；2.表達蛋白樣本2。圖2 重組蛋白表達產(chǎn)物SDS-PAGE分析結果Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant protein expression product

2.2 基于H6蛋白禽流感抗體間接ELISA檢測方法建立

..間接ELISA反應條件優(yōu)化

最佳包被抗原濃度與血清稀釋度確定：如表1所示，當重組H6蛋白包被濃度為10.0 μg/mL、血清稀釋度為 1∶20 時， P/N值為8.64最大。因此，確定最佳抗原包被濃度為10.0 μg/mL，血清稀釋度為1∶20。

表1 間接ELISA最佳包被抗原濃度與血清稀釋度選擇Tab.1 Selection of optimal concentration and serum dilution of coated antigen for indirect ELISA

最佳抗原包被條件確定：如表2所示，當采用 4 ℃包被過夜時，P/N值為8.67最大。因此，確定最佳包被條件為 4 ℃過夜。

表2 間接ELISA最佳包被條件選擇Tab.2 Selection of optimum encapsulation conditions for indirect ELISA

最佳封閉液確定：如表3所示，當采用 5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h時，P/N值為9.28最大。因此，確定最佳封閉液為5%脫脂奶粉。

表3 間接ELISA最佳封閉液選擇Tab.3 Selection of optimum encapsulation conditions for indirect ELISA

最佳血清作用時間確定：如表4所示，當血清于37 ℃作用30 min 時，P/N值最大。因此，確定最佳血清作用時間為 37 ℃條件下30 min。

表4 間接ELISA最佳血清作用時間選擇Tab.4 Time selection of the best serum for indirect ELISA

最佳酶標二抗?jié)舛却_定：如表5所示，當酶標二抗以 1∶5000稀釋、37 ℃作用30 min時，P/N 值為9.11最大。因此，確定最佳酶標二抗稀釋度為 1∶5000。

表5 間接ELISA最佳酶標二抗?jié)舛冗x擇Tab.5 Selection of optimal concentration of indirect ELISA conjugate secondary antibody

最佳顯色時間確定：表6結果顯示，當37 ℃避光顯色10 min 時，P/N 值為8.81最大。因此，確定最佳顯色時間為 37 ℃作用10 min。

表6 間接ELISA最佳顯色時間選擇Tab.6 Indirect ELISA optimal color time selection

..間接ELISA方法臨界值確定

取已知H6亞型AIV陰性血清15份進行間接 ELISA檢測，測定OD值，計算得到平均值X和標準差SD分別為0.152和0.018，計算出基于H6蛋白間接ELISA方法的判定標準為：樣本OD值≥0.206判為陽性；樣本OD值<0.206判為陰性。

..間接ELISA方法重復性、特異性和敏感性分析

間接ELISA方法重復性分析：如表7所示，建立的間接 ELISA 方法對同一樣本檢測的變異系數(shù)均小于10%(2.69%～7.26%)，說明建立的間接 ELISA 有良好的重復性。

間接ELISA方法特異性分析：表8結果顯示，用建立的間接ELISA進行檢測，H5亞型、H7亞型禽流感和新城疫陽性血清的OD值均小于0.206，且H6亞型禽流感陰性、陽性血清對照均成立，表明該ELISA方法與常見病原陽性血清無交叉反應，具有良好的特異性。

間接ELISA方法敏感性分析：如表9所示，建立的間接ELISA方法能檢測到最高稀釋度為 1∶320的 H6亞型禽流感陽性血清，說明建立的間接 ELISA 有良好的敏感性。

表7 間接ELISA重復性試驗結果 (OD630值)Tab.7 Indirect ELISA repeatability test results (OD630)

表8 間接ELISA特異性試驗結果Tab.8 Indirect ELISA specific test results

表9 間接ELISA敏感性試驗結果Tab.9 Indirect ELISA sensitivity test results

2.3 基于H6蛋白禽流感抗體間接ELISA檢測方法初步應用

使用建立的間接 ELISA方法對2017-2019年采自貴州省部分地區(qū)家禽養(yǎng)殖場1837份臨床血清樣品進行H6亞型禽流感抗體檢測(表10)，樣本陽性率平均為10.45%，說明本試驗建立的間接 ELISA 方法能用于臨床血清樣本H6亞型禽流感抗體檢測。

表10 間接ELISA方法臨床樣品檢測結果Tab.10 Results of clinical samples detected by indirect ELISA

3 結論與討論

H6亞型禽流感病毒屬于低致病性禽流感病毒，1965年首次在美國馬薩諸塞州一個養(yǎng)殖場火雞體內(nèi)分離得到，隨后在水禽、陸禽和家禽中發(fā)現(xiàn)。H6亞型禽流感病毒在我國家禽中呈現(xiàn)快速增長趨勢：1975-2000年，從我國香港地區(qū)家禽中先后分離得到H6N1、H6N2、H6N7和H6N9亞型禽流感病毒；2000-2010年，從我國南部和東部地區(qū)活禽交易市場家禽中分離出H6N1、H6N2和H6N6亞型禽流感病毒；2011年以后，在華南、華東和華中地區(qū)活禽交易市場先后分離到H6N6、H6N2和H6N6亞型禽流感病毒。這些調(diào)查結果說明，H6亞型禽流感病毒已在我國飼養(yǎng)家禽中普遍存在，因此必須加強H6亞型禽流感流行病學調(diào)查。

目前，動物疫病流行病學調(diào)查方法主要有描述流行病學調(diào)查方法、血清流行病學調(diào)查方法、分子流行病學調(diào)查方法等，其中血清流行病學調(diào)查方法具有敏感特異、簡便經(jīng)濟、可靠安全等優(yōu)點，廣泛應用到獸醫(yī)流行病學調(diào)查各個領域中。在血清流行病學調(diào)查方法中，最常采用的是血凝抑制試驗(HI)和酶聯(lián)免疫吸附試驗技術(ELISA)，其中ELISA是目前運用最廣泛的的一種病毒抗原與抗體檢測技術，非常適合于大批量樣品的血清學調(diào)查，結果易于分析，在禽流感的檢疫、控制和撲滅中起著不可替代的作用，如針對H9亞型禽流感抗體、H7亞型抗體和H5亞型抗體建立的ELISA檢測方法等，但目前尚未見到有關針對H6亞型禽流感抗體檢測的ELISA方法。

本試驗從H6N6亞型禽流感病毒毒株得到H6基因后，連接到原核表達載體pET-32α并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌進行表達，經(jīng)Western-blotting檢測顯示，表達的H6重組蛋白具有良好的反應原性，為建立檢測H6亞型禽流感抗體的間接 ELISA 方法奠定了基礎；以原核表達的H6重組蛋白為包被抗原，通過對抗原濃度、血清、酶標二抗稀釋度與反應時間等條件進行優(yōu)化，建立檢測H6亞型禽流感抗體的間接 ELISA 方法；該方法能特異性檢測禽流感H6亞型抗體，陽性血清稀釋至 1∶320仍可檢出，與其他病原陽性血清均無交叉反應，批內(nèi)檢測變異系數(shù)均小于10.00%，表明該方法具有敏感性高、特異性強、重復性好等優(yōu)點，可應用于臨床禽流感H6亞型抗體的檢測。應用該ELISA方法對2017-2019年1837份雞血清樣本檢測顯示，H6亞型禽流感抗體陽性率從2017年的8.12%上升到2018年的10.85%，再上升至2019年的11.74%，說明H6亞型禽流感感染在飼養(yǎng)雞群中呈現(xiàn)逐步上升趨勢，應引起足夠的重視。綜上所述，本試驗成功建立了可檢測H6亞型禽流感抗體的間接ELISA方法，為臨床H6亞型禽流感的血清流行病學調(diào)查提供了技術支撐。