潘小軍,陳媛,江和棟

(江西中醫(yī)藥大學 藥學院,江西 南昌,330004)

柑橘營養(yǎng)價值高,種植面積大。根據國際糧農組織(International Food and Agriculture Organization,FAO)顯示,中國柑橘類水果的種植面積約占全世界的1/3,年產量大于100萬t[1]。柑橘內含有豐富的糖分與水分,腐爛率通常在10%～30%[2],造成的經濟損失非常大,研究柑橘保鮮技術對降低釆后損失具有重要意義。在中國的柑橘貯藏中,常用具有抑菌或殺菌作用的化學藥物、涂蠟、浸泡保鮮劑、包裹保鮮袋等方法來防止由機械損傷而帶來的霉菌感染,這些傳統的保鮮方法對于消費者安全食用果蔬和高效攝入營養(yǎng)物質而言,依然存在較大差距[3]。因此尋找安全高效、低毒、低殘留的保鮮劑已成為一種趨勢。天然資源植物精油慢慢地成為柑橘貯藏中病害防治的有效方式[4]。

植物精油是從草本植物的花、樹皮、種子和果實中萃取得到的芳香物質,分子小,揮發(fā)性高,是一種難溶于水的油狀液體。據已有報道,多種植物內含有酚類、類黃酮素和抗毒素等物質,這些物質有一定的抗菌活性。趙恭文等[5]發(fā)現植物提取液對某些植物病原真菌有較強的抑菌作用,并分析這些藥用植物活性成分很可能在植物精油中。精油這類天然物質具有安全環(huán)保、低毒低殘留、不易產生抗藥性等特點,常用于鮮切水果、果蔬保鮮以及作物腐敗菌和致病菌的控制,但某些精油本身的特性會對果蔬的感官評價產生影響。為解決此問題,在食品保鮮時最好用涂層保鮮配方[6]。柑橘貯藏期間,果實pH通常在2.2～4.0,呈酸性,多數果實的腐爛由真菌引起[7],其中主要的病菌是意大利青霉和指狀青霉[8],在釆后保鮮和運輸過程中,造成的損失約為柑橘類水果總損失的90%[9]。目前很多研究表明,植物精油對多種作物腐敗菌和致病菌有明顯抑制作用,但很多試驗只針對單一或少數幾種植物精油進行研究,且效果不一。

本試驗研究預選的13種植物精油對柑橘主要致病菌意大利青霉(Penicilliumitalicum)和指狀青霉(Penicilliumdigitatum)的抑制作用,并測得強抑制作用精油的最低抑菌濃度(minimal inhibit concentration,MIC)和最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration,MBC),對柑橘進行打孔貯藏試驗,探究其實際的保鮮效果,為植物精油用于柑橘的貯藏保鮮提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

市售“紐荷爾”臍橙,選取大小均勻、無機械損傷、無病蟲害、成熟度一致的臍橙進行試驗；意大利青霉(PenicilliumitalicumGDMCC 3.489)、指狀青霉(PenicilliumdigitatumGDMCC 3.490),廣東省微生物菌種保藏中心；丁香、牛至、桂皮、八角、鼠尾草、百里香、迷迭香、檸檬桉,肉豆蔻、廣藿香、生姜、雪松以及甘草精油,美國諾奧(Now Foods)公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基,青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司；無水乙醇,AR,天津市永大化學試劑有限公司；吐溫80,CP,國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

YP電子天平,上海律平科學儀器有限公司；DW-9微生物試劑分液器,杭州大微生物技術有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器、GR-240型熱空氣消毒箱、HHS-21-6型電熱恒溫水浴鍋,上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備；JP-100B型超聲波清洗機、BCD-275TMBC型冰箱,青海海爾股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 十三種植物精油抑菌圈的測定

(1)菌懸液的制備：活化后的供試菌被接種到PDA平板培養(yǎng)基上,放于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1周；用無菌蒸餾水將培養(yǎng)菌邊過濾邊洗入試管中,采用2倍稀釋法將供試病原菌稀釋至孢子濃度為108CFU/mL。

(2)濾紙圓片的制備：用直徑為6 mm的打孔器于約3 mm厚的紙板打孔,獲取的濾紙圓片放于玻璃培養(yǎng)皿濕熱滅菌,放于干燥箱24 h,無菌條件保存,備用。

(3)制作含菌平板：菌懸液吸取1 mL于提前準備好的PDA平皿培養(yǎng)基涂抹均勻,將在植物精油原液中充分浸泡(30 s)后瀝干的濾紙圓片放入上述已含意大利青霉、指狀青霉的平皿中,25 ℃培養(yǎng)72 h,觀察菌的生長情況。試驗重復3次,最后結果取其平均值。

(4)抑菌圈直徑的測量：用十字交叉法量取平皿抑菌圈直徑,平均直徑=(最大抑菌圈直徑-濾紙片直徑)/2

1.3.2 MIC和MBC的測定

根據抑菌圈試驗選取上述幾種強效植物精油,2倍稀釋法將PDA培養(yǎng)基配制成最終質量分數分別為0.012 5%、0.025%、0.05%、0.1%、0.2%、0.4%的含植物精油的培養(yǎng)基,同時設置對照(不含植物精油)。用平板涂布的方法,用無菌接種環(huán)將菌液在已經凝固且混合均勻的精油的PDA培養(yǎng)基中劃一條菌液線。重復試驗3次,置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h,待對照組培養(yǎng)皿中菌絲體充分生長后,與對照相比,觀察植物精油各濃度對菌的抑制效果,無菌生長的最低濃度即為MIC。將無菌生長的培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)至7 d后觀察,以無菌生長的最低濃度即為MBC。

1.3.3 菌絲生長抑制試驗

參考楊紅等[10]用固體稀釋法設置0.006 3%～0.40% 7個濃度梯度的分別含丁香、牛至、桂皮的PDA培養(yǎng)基,無菌水做空白對照,倒入平板冷凝。用6 mm打孔器取菌塊,將菌塊放入含植物精油的培養(yǎng)基中央,各濃度重復2次試驗,置于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱,培養(yǎng)24 h后將平皿倒置,待空白對照的菌絲長滿培養(yǎng)皿后開始測量。運用十字交叉法測量各平皿菌落直徑,計算各組試驗結果的平均值,抑菌率計算如公式(1)所示：

(1)

1.3.4 柑橘打孔貯藏試驗

參照孫思明[11]的方法,用2倍稀釋法,設置0.012 5%～1% 7個濃度的丁香、牛至、桂皮處理液,選用無病害的果實,于200 mg/L的NaClO溶液浸泡10 min,再用流水清洗,晾干。將直徑為5 mm的打孔器于柑橘表面刺一個小孔,加入25 μL不同濃度的處理液,對照分別加入等量蒸餾水和吐溫80作為普通對照和吐溫對照,最后加入菌液15 μL,用保鮮袋包裝置于25 ℃條件下貯藏,于貯藏第4天用十字交叉法測得其菌孔大小,腐爛面積計算如公式(2)所示：

(2)

式中：∑πr2,創(chuàng)傷口面積總和,cm2;n,創(chuàng)傷口總數;r,創(chuàng)傷口的腐爛半徑,cm。

1.3.5 數據處理與分析

采用 Excel 2010 進行數據處理和作圖,采用SPSS 19.0中 Duncan 新復極差法進行差異顯著性分析,顯著性水平設置P<0.05。

2 結果與分析

2.1 十三種植物精油對意大利青霉和指狀青霉的抑菌效果

不同植物源精油,對意大利青霉和指狀青霉的抑菌效果也有顯著的差別。各植物精油對供試菌的抑菌圈大小如表1所示。在13種植物精油中桂皮精油對意大利青霉和指狀青霉的抑菌效果最佳,其抑菌圈直徑分別為43.11、39.03 mm；其次是牛至和丁香精油,其對意大利青霉抑菌直徑分別為39.32、35.81 mm,對指狀青霉抑菌直徑分別為27.89、21.50 mm。八角、鼠尾草和迷迭香精油均對意大利青霉和指狀青霉具有抑制效果,但顯著低于桂皮、牛至和丁香精油(P<0.05),百里香精油具有與桂皮、牛至和丁香精油同等的抑菌作用。檸檬胺精油僅對指狀青霉菌起抑制作用,肉豆蔻僅對意大利青霉菌有抑制作用,而廣藿香、生姜和雪松、甘草精油等對2種供試菌均無抑菌作用。如表2所示,桂皮對意大利青霉和指狀青霉的MIC和MBC值均較小,濃度都為0.012 5%；牛至精油對意大利青霉的MIC和MBC值均為0.05%,對指狀青霉的MIC和 MBC值均0.1%；而丁香精油對意大利青霉的MIC和 MBC值分別為0.05%、0.1%,對指狀青霉的MIC和 MBC值分別為0.1%、0.2%。另外3種精油對2種菌的MIC和 MBC值均大于0.4%。在已有報道中,桂皮和丁香精油的主要成分肉桂醛和丁香酚對意大利青霉菌有較好的抑制效果[12]。牛至精油的主要成分酚類化合物有較強的天然抗菌作用[13],因為百里香精油含有和牛至精油同樣的成分百里香酚,所以百里香精油對意大利青霉和指狀青霉的抑菌效果表現較好。吳克剛等[14]發(fā)現牛至和百里香組合表現出明顯的協同效果,SOHYUN等[15]研究發(fā)現肉桂皮,牛至和百里香組合也有協同抗菌活性。董路路等[16]也表明對青霉菌的抑菌效果從大到小依次為牛至精油、肉桂精油和丁香精油。

表1 植物精油對供試菌的抑菌作用Table 1 Antibacterial effect of plant essential oils on tested bacterias

表2 植物精油對供試菌的MIC、MBC 單位：%

2.2 丁香、牛至和桂皮精油對菌絲生長抑制效果

由圖1可知,在設置的7個濃度中,牛至、桂皮和丁香精油對意大利青霉菌的抑制作用普遍強于對指狀青霉的抑制作用。這3種精油對意大利青霉菌和指狀青霉菌在濃度≥0.1%時,抑菌率達到100%。0.01%的牛至精油對意大利青霉和指狀青霉的抑菌率分別為95.4%和73.0%；當濃度升高至0.03%,牛至精油對意大利青霉和指狀青霉的抑菌率分別為100%、90.3%。0.01%的桂皮精油對意大利青霉和指狀青霉的抑菌率分別為47.0%、14.4%；濃度為0.03%時,對2種菌的抑菌率分別為64.8%、31.6%；濃度為0.05%時,抑菌率分別為90.9%、75.8%。0.01%的丁香精油對意大利青霉和指狀青霉的抑菌率分別為53.4%、44.9%；濃度為0.03%時,對2種菌的抑菌率分別為97.0%、76.6%；濃度為0.05%時,抑菌率分別為100%、90.4%。有學者[17-19]認為丁香對青霉菌抑菌效果好,抑菌譜較寬。蔣志國等[20]也認為丁香抑菌效果好于肉桂,除了對青霉菌有較好的抑菌作用外,丁香精油還能激發(fā)宿主防御反應,抑制丙二醛(malonaldehyde,MDA)積累,有效地控制由青霉菌而引發(fā)的柑橘類水果藍霉病的發(fā)病率[21]。

2.3 柑橘打孔貯藏

牛至、桂皮和丁香精油對意大利青霉接種柑橘在打孔貯藏第4天時的腐爛面積見圖2。與對照組相比,采用精油處理能抑制柑橘的腐爛,其腐爛面積均顯著低于對照組(P<0.05)。精油濃度在0.012 5%時,各處理組的小孔周圍均出現了腐爛,腐爛面積最大的是牛至(1.04 cm2),其次是丁香(0.71 cm2)、桂皮(0.36 cm2),3種精油處理效果存在顯著性差異(P<0.05)。濃度在0.025%～0.2%時,丁香和牛至樣品的處理孔徑未發(fā)生變化(5 mm),無腐爛現象。桂皮精油在濃度0.2%以上時,丁香、牛至精油在濃度分別為0.25%、0.5%以上時,出現了不同程度的腐爛(P<0.05)。ELCOCKS等[22]的研究表明肉桂皮精油在濃度>0.5%的情況下,會在≤6 min發(fā)揮殺菌活性,作用時間延長會影響處理樣品的品質。造成這種現象的原因可能是外源處理物引起角質層的變化[23],高濃度的桂皮精油對柑橘果實果皮角質層造成的破壞更嚴重,導致果皮角質層本身的防止水分流失和抵御微生物侵害等功能喪失,而且張靜等[24]證明角質基質的含量減少,指狀青霉的菌絲生長或者是孢子的萌發(fā)會被促進。

a-牛至;b-桂皮;c-丁香圖1 牛至、桂皮和丁香精油對意大利青霉和指狀青霉的抑菌率Fig.1 Inhibition rate of oregano,cinnamon and clove ssential oil against Penicillium italicum and Penicillium digitatum 注：不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05),大寫字母表示的是意大利青霉,小寫字母表示的是指狀青霉

圖2 植物精油對柑橘貯藏過程中腐爛面積的影響Fig.2 Effect of plant essential oils on rotten area of citrus during storage 注：不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)

在貯藏期間,指狀青霉組普通對照第4天的腐爛面積高達10.19 cm2,第6天為29.96 cm2。桂皮處理的指狀青霉組的腐爛面積高于其他處理組,這與楊文俠等[25]在實際貯藏中發(fā)現肉桂提取液導致臍橙失重率和腐爛率升高的現象一致,但具體原因不詳。如圖3-b,意大利青霉+牛至精油處理組的腐爛面積最小,但牛至精油的味道較重,致使處理樣品的品質較其他組稍差,目前膠囊包埋技術的應用可以降低該精油對食品品質的破壞[26],有學者[27-29]應用植物精油制作保鮮紙或涂膜瓦楞紙箱實現對水果的保鮮。在同樣的貯藏時間內,指狀青霉組的腐爛面積以及菌絲的生長速率顯著大于意大利青霉組,這與丁仁慧等[30]的試驗貯藏效果相似。指狀青霉的處理腐爛情況如圖3-c,在其打孔部位及菌孔周圍3～4 mm處未出現明顯的菌絲,且菌絲主要生長部位是柑橘最先變軟的組織。

a-指狀青霉(上-處理組；下-對照組);b-意大利青霉;c-指狀青霉圖3 牛至處理樣品Fig.3 Oregano treatment samples

3 結論

結果表明,在打孔保鮮貯藏期間,指狀青霉菌和意大利青霉菌會破壞柑橘品質導致腐爛加劇。牛至、桂皮、丁香、百里香、鼠尾草和迷迭香等精油對供試菌有抑制作用,其中抑制作用最強的是桂皮,其次是牛至和丁香。0.1%的牛至、桂皮和丁香精油處理可有效抑制青霉菌在果實上的生長,經過該濃度處理的柑橘的腐爛速度明顯降低,可以延長柑橘的貯藏時間。

植物精油成分復雜,不同植物精油內可能有相同作用成分,同種植物通過不同提取方式所得到的精油作用強度也有差異。目前對于植物精油成分之間的相互作用的研究,植物精油對于多種菌的共同作用效果的研究較少。在現研究中,植物精油的潛在植物毒性以及強烈的感官特性的研究還不夠深入,所以植物精油保鮮的商業(yè)實施存在一定的局限性。但人們依舊渴望天然物資資源的利用,植物精油較其他防腐保鮮試劑還是更加有優(yōu)勢,值得更加深入的研究。