何菲,段佳文,蔣英麗,沈毅,李賀賀*,孫寶國(guó)

1(北京工商大學(xué) 食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室,北京,100048) 2(北京工商大學(xué) 中國(guó)輕工業(yè)釀酒分子 工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京,100048) 3(四川郎酒股份有限公司,四川 瀘州,646000)

白酒是由谷物發(fā)酵、蒸餾得到的高度飲料酒,含有種類(lèi)眾多、組成復(fù)雜的風(fēng)味物質(zhì),如醛、酸、酯和高級(jí)醇類(lèi)等,這些微量成分決定了酒體的風(fēng)格和特點(diǎn)[1]。醬香型白酒因其生產(chǎn)周期長(zhǎng)、工藝復(fù)雜,風(fēng)味成分非常豐富。貯存時(shí)間是保證醬香風(fēng)格的重要工藝措施,通過(guò)貯存老熟能夠使新酒的異雜味減少,口感變得醇厚、柔和,香氣也得到改善[2-4]。

由于白酒常用的儀器設(shè)備,如氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等,精密性較高,樣品大部分需要通過(guò)復(fù)雜的前處理才可進(jìn)樣分析[5-8],這不僅造成風(fēng)味成分的損失,而且耗時(shí)耗力。因此,開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、無(wú)損的白酒分析方法是十分必要的。離子遷移色譜(ion mobility spectrometry,IMS)技術(shù)起源于20世紀(jì)60年代末70年代初,它是基于不同的氣相離子在電場(chǎng)中遷移速度的差異來(lái)對(duì)物質(zhì)進(jìn)行表征的一項(xiàng)分析技術(shù)[9-10]。作為一種化學(xué)物質(zhì)檢測(cè)方法,IMS具有前處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、靈敏度高、體積小、成本低且無(wú)需真空系統(tǒng),在常壓下就可進(jìn)行分析檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[11-14],早期常用于防化偵察、應(yīng)急反恐和緝毒緝私等[15]。近年來(lái),隨著氣相色譜和離子遷移色譜的逐漸發(fā)展,將二者串聯(lián)的儀器應(yīng)運(yùn)而生,氣相色譜-離子遷移譜(gas chromatography-ion mobility spectrometry,GC-IMS)結(jié)合了氣相色譜和離子遷移色譜技術(shù)的特點(diǎn),具有雙重分離及檢測(cè)能力,已廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域,如肉蛋類(lèi)制品、油脂類(lèi)、水產(chǎn)品、面包等[16-20]。

由于受乙醇的影響,IMS技術(shù)在酒類(lèi)方面的研究多局限于低度酒,如葡萄酒、韓國(guó)真露燒酒、黃酒、荔枝酒、青梅酒等[21-25]。最早將其應(yīng)用于白酒等高度酒的研究始于2014年,彭麗英等[26]利用實(shí)驗(yàn)室自制的離子遷移譜儀器建立了快速檢測(cè)白酒中痕量鄰苯二甲酸酯的方法。文獻(xiàn)調(diào)研顯示,GC-IMS應(yīng)用于白酒等高度酒類(lèi)的研究尚處于初步階段,且相關(guān)實(shí)驗(yàn)條件并未優(yōu)化。因此,本文利用模擬酒樣探究了鹽離子、酒精度、平衡體積、平衡溫度和平衡時(shí)間對(duì)儀器分析效果的影響,選出了最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件,并將其應(yīng)用于不同貯存年限的醬香型白酒物質(zhì)變化的研究,為GC-IMS更好地應(yīng)用于白酒提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

酒樣：同一輪次不同貯存時(shí)間的郎酒樣品各10 mL,詳見(jiàn)表1。

乙醇,色譜級(jí),美國(guó)Sigma-Aldrich公司；超純水,德國(guó)Milli-Q公司；乙酸乙酯、乙酸丁酯、異丁酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、異戊醇、正己醇、乙酸、糠醛均為色譜純95%以上,Sigma-Aldrich公司；2-丁酮、2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、2-辛酮、2-壬酮均為分析純,北京國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,用于校準(zhǔn)保留指數(shù)；NaCl,分析純,薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司。

表1 不同貯存時(shí)間郎酒樣品信息表Table 1 Information of Langjiu Baijiu samples with different storage time

LAL 1T型酒精濃度計(jì),廣州市速為電子科技有限公司；Agilent 7890B氣相色譜儀、DB-FFAP毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),美國(guó)Agilent 科技有限公司；FlavourSpec?離子遷移色譜,德國(guó) G.A.S Dortmund公司；Acrichi自動(dòng)頂空進(jìn)樣器、20 mL頂空進(jìn)樣瓶,北京聚芯追風(fēng)科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模擬酒樣配制

考慮到白酒在蒸餾過(guò)程中餾酒前段基酒乙醇含量較高,約為70%～80%[27-28],因此,用色譜級(jí)乙醇和超純水配制80%模擬酒樣,添加化合物及濃度如表2所示。

表2 模擬酒樣中揮發(fā)性化合物信息表Table 2 Information of volatile compounds in simulated Baijiu samples

這些物質(zhì)均為白酒中含量較高的重要風(fēng)味物質(zhì),其中乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯為構(gòu)成酒體的四大酯類(lèi),約占白酒總酯含量的 90%～95%,戊酸乙酯,乙酸丁酯、異丁酸乙酯為白酒貢獻(xiàn)了重要的花果香及甜香；異戊醇和正己醇為白酒中重要的醇類(lèi)物質(zhì),其中異戊醇對(duì)維持白酒風(fēng)格具有重要作用,含量過(guò)低,會(huì)失去白酒固有風(fēng)格；乙酸為白酒主要的揮發(fā)性酸,主要起呈味作用；糠醛在各類(lèi)白酒中含量均較高,為白酒帶來(lái)了焦糊風(fēng)味[29-30]。因此,選擇以上物質(zhì)作為模擬酒樣的添加物質(zhì)。

1.2.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

首先考慮鹽離子對(duì)酒樣中物質(zhì)檢測(cè)的影響,以30%模擬酒樣作為樣品,對(duì)不加鹽與加鹽至飽和樣品進(jìn)樣分析,確定酒樣的檢測(cè)是否需要加鹽處理。其次,對(duì)酒精度進(jìn)行優(yōu)化,以80%模擬酒樣作為母液,分別用超純水稀釋配制成酒精度為80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%和10%的一系列模擬酒樣,分別取1 mL于潔凈頂空瓶中,在60 ℃下平衡10 min進(jìn)樣分析,探究酒精度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響；其次,以30%作為節(jié)點(diǎn),配制相同物質(zhì)含量、不同酒精度(30%、20%、10%、7%、5%)的模擬酒樣,采用同上相同的分析方法,找出最適合GC-IMS分析的酒精度。最后,以最優(yōu)酒精度配制模擬酒樣作為樣品,對(duì)平衡體積(0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mL)、平衡溫度(20、30、40、50、60、65 ℃)、平衡時(shí)間(0、2、4、6、8、10 min)進(jìn)行優(yōu)化,以上實(shí)驗(yàn)均平行3次。

1.2.3 真實(shí)酒樣制備

取適量樣品于10 mL離心管中,用超純水對(duì)酒樣進(jìn)行稀釋處理。

1.2.4 GC-IMS條件

自動(dòng)進(jìn)樣器條件：爐溫設(shè)定(平衡溫度)依實(shí)驗(yàn)情況而定,管溫設(shè)定為90 ℃,閥溫設(shè)定為85 ℃；取樣時(shí)間20 s,進(jìn)樣時(shí)間20 s,加壓時(shí)間30 s,反吹時(shí)間1 min,分析周期50 min。

GC條件：DB-FFAP色譜柱,分析時(shí)間50 min；載氣為N2(純度≥99.999%)；升溫程序：初始溫度40 ℃,保持5 min；以2 ℃/min升溫至80 ℃,保持3 min；最后以10 ℃/min升溫至230 ℃,不保持；以240 ℃后運(yùn)行3 min。

IMS條件：β射線,3H為放射源；漂移氣為N2(純度≥99.999%)；漂移氣流速150 mL/min；漂移管溫度45 ℃；正離子化模式。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)儀器自帶分析軟件LAV(Laboratory Analytical Viewer)、定性軟件GC×IMS Library Search(NIST-2014、IMS數(shù)據(jù)庫(kù)) 進(jìn)行化合物定性。運(yùn)用LAV中插件Reporter進(jìn)行樣品GC-IMS譜圖對(duì)比,用插件Gallery Plot進(jìn)行GC-IMS指紋圖譜的對(duì)比。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽離子

圖1為GC-IMS分析鹽離子對(duì)模擬酒樣檢測(cè)影響的結(jié)果圖,所有圖均經(jīng)過(guò)歸一化處理。其中圖1-a為二維譜圖,遷移時(shí)間1.0處的垂直紅線表示反應(yīng)離子峰(reaction ion peak,RIP),RIP兩側(cè)的每個(gè)點(diǎn)代表一種化合物,點(diǎn)的顏色深淺及面積表示物質(zhì)含量大小,紅色越深、面積越大表示含量越高。圖1-b為差譜圖,以不加鹽的模擬酒樣作為參照樣品,若其他酒樣中的物質(zhì)含量高于參照樣品,則顯示為紅點(diǎn),反之為藍(lán)點(diǎn)。

a-二維譜圖；b-差譜圖圖1 鹽離子對(duì)模擬酒樣影響的GC-IMS分析譜圖Fig.1 GC-IMS spectrum showing the effect of salt ions on simulated liquor samples

從圖1-a對(duì)比可知,樣品中不加鹽與加鹽至飽和,物質(zhì)的出峰情況基本相同,即物質(zhì)含量基本相同。圖1-b對(duì)比可知,加鹽至飽和的模擬酒樣中物質(zhì)的含量較不加鹽稍低,因此,確定對(duì)于酒樣的分析采取不加鹽的措施,直接取樣分析。

2.2 酒精度

圖2為GC-IMS分析不同酒精度的模擬酒樣結(jié)果圖。其中,圖2-a二維譜圖上方紅色曲線表示化合物峰體積之和變化情況,圖2-b、圖2-d和圖2-f差譜圖分別以酒精度為30%、30%和10%的模擬酒樣作為參照樣品。

a-10%～80%模擬酒樣二維譜圖；b-10%～80%差譜圖；c-10%～30%模擬酒樣二維譜圖； d-10%～30%差譜圖；e-5%～10%模擬酒樣二維譜圖；f-5%～10%差譜圖圖2 不同酒精度模擬酒樣GC-IMS分析譜圖Fig.2 GC-IMS spectrum of simulated liquor samples with different alcohol contents

從圖2-a對(duì)比可知,隨著酒精度的上升,即稀釋倍數(shù)的減小,多數(shù)化合物的含量呈先上升后下降的變化趨勢(shì),當(dāng)酒樣酒精度為30%時(shí)化合物含量達(dá)到最大值,說(shuō)明酒精度為30%是GC-IMS正常工作所能承受的最大酒精度,當(dāng)酒樣酒精度≥40%時(shí),一些物質(zhì)的峰強(qiáng)度明顯減小,物質(zhì)總含量顯著下降。同理,圖2-b中酒精度<30%的模擬酒樣,隨酒精度的升高,藍(lán)色面積逐漸減小,即物質(zhì)含量逐漸增加；酒精度>30%的樣品,隨酒精度的升高,藍(lán)色逐漸加深且面積逐漸增大,即物質(zhì)含量逐漸降低。分析顯示主要有以下2個(gè)原因:首先,在有限空間的頂空瓶中,高濃度的乙醇揮發(fā)至頂空,占據(jù)了大量空間,當(dāng)蒸氣壓達(dá)到飽和時(shí),便抑制了其他化合物的揮發(fā),因此,乙醇含量越高,對(duì)其他物質(zhì)的揮發(fā)抑制作用越大；其次,酒精度過(guò)高也會(huì)對(duì)IMS檢測(cè)造成影響,此時(shí)乙醇含量對(duì)儀器的影響不可忽略。所以,為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,需將樣品稀釋后再進(jìn)樣分析。

最后,以酒精度30%作為節(jié)點(diǎn),分析酒精度<30%時(shí)不同酒精度、相同物質(zhì)含量下物質(zhì)的出峰情況,以期找到最優(yōu)的酒樣稀釋度數(shù)。結(jié)果如圖2-c～圖2-f所示,當(dāng)酒精度>10%時(shí),隨酒精度的升高,物質(zhì)的含量呈逐漸減小的趨勢(shì)；當(dāng)酒精度<10%時(shí),隨酒精度的降低,物質(zhì)含量稍有降低,后幾乎不變,說(shuō)明酒精度10%為最佳稀釋度數(shù)。

2.3 平衡體積

圖3為GC-IMS分析不同平衡體積的模擬酒樣結(jié)果。

a-二維譜圖；b-三維譜圖圖3 不同平衡體積GC-IMS 分析譜圖Fig.3 GC-IMS spectrum of simulated liquor samples with different equilibrium volumes

從圖3-a和圖3-b對(duì)比可知,隨樣品平衡體積的增加,物質(zhì)的總含量呈現(xiàn)先上升后緩慢波動(dòng)下降的趨勢(shì),到1和2 mL時(shí)達(dá)到最大值。從圖3-b也可知,當(dāng)平衡體積為1和2 mL時(shí),酒樣中被檢測(cè)到的化合物最多,含量最高。由于1和2 mL樣品中被檢測(cè)到的物質(zhì)濃度相近,根據(jù)綠色、節(jié)約原則,選則1 mL作為最優(yōu)平衡體積。

2.4 平衡溫度

圖4為GC-IMS分析不同平衡溫度的模擬酒樣的結(jié)果圖,其中圖4-b和圖4-d差譜圖均以平衡溫度為60 ℃的模擬酒樣作為參照樣品。

a-10～60 ℃二維譜圖；b-10～60 ℃差譜圖；c-60和65 ℃二維譜圖； d-60和65 ℃差譜圖圖4 不同平衡溫度GC-IMS分析譜圖Fig.4 GC-IMS spectrum of simulated liquor samples with different equilibrium temperatures

圖4-a和圖4-b對(duì)比可知,隨平衡溫度的增加,物質(zhì)的總含量呈逐漸增加的趨勢(shì),到60 ℃時(shí)達(dá)到最大值。其次,補(bǔ)充了平衡溫度60和65 ℃的物質(zhì)出峰情況對(duì)比(圖4-c和圖4-d),當(dāng)平衡溫度為65 ℃時(shí),物質(zhì)的總含量明顯低于60 ℃,因此,60 ℃為平衡溫度的拐點(diǎn),低于或高于此溫度,物質(zhì)的出峰均有減弱的趨勢(shì)。綜合來(lái)看,當(dāng)平衡溫度為60 ℃時(shí),總的物質(zhì)濃度最高,因此確定最優(yōu)的平衡溫度為60 ℃。

2.5 平衡時(shí)間

圖5為GC-IMS分析不同平衡時(shí)間的模擬酒樣結(jié)果圖。其中,圖5-b差譜圖以平衡時(shí)間為0 min的模擬酒樣作為參照樣品。從圖5-a和圖5-b對(duì)比可知,隨樣品平衡時(shí)間的增加,物質(zhì)的總含量呈現(xiàn)逐漸上升的變化趨勢(shì),到10 min時(shí)達(dá)到最大值?？傮w來(lái)說(shuō),平衡時(shí)間為10 min時(shí)物質(zhì)的總含量最高。

a-二維譜圖；b-差譜圖圖5 不同平衡時(shí)間GC-IMS分析譜圖Fig.5 GC-IMS spectrum of simulated liquor samples with different equilibrium times

2.6 同一輪次不同貯存時(shí)間的醬香型白酒分析

利用上述最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件,對(duì)同一輪次不同貯存時(shí)間的醬香型白酒樣品進(jìn)行分析,包括單體和二聚體共積分了143個(gè)峰,其中通過(guò)譜庫(kù)檢索共定性出65個(gè)峰,45種化合物,如表3所示,包括15種酯類(lèi)、8種醇類(lèi)、1種酸類(lèi)、9種醛類(lèi)、8種酮類(lèi)、2種含氮化合物、1種含硫化合物和1種其他。

利用LAV軟件對(duì)樣品及物質(zhì)進(jìn)行對(duì)比分析,結(jié)果如圖6所示,其中圖6-a為不同貯存時(shí)間酒樣的二維遷移譜圖,圖6-b為指紋圖譜,圖中每一行代表1個(gè)樣品,每個(gè)樣品列出了平行2次的結(jié)果,每一列代表1個(gè)物質(zhì),后綴“M(Monomer)”表示物質(zhì)的單體,“D(Dimer)”表示物質(zhì)的二聚體,當(dāng)物質(zhì)濃度較高時(shí),會(huì)出現(xiàn)2個(gè)化合物共用1個(gè)水合離子(或電子)的情況。二維譜圖對(duì)比了不同酒樣間物質(zhì)數(shù)量及含量的差異情況,從圖中可以發(fā)現(xiàn)15及20年的酒樣中物質(zhì)濃度顯著高于其他酒樣,結(jié)合指紋圖譜可以發(fā)現(xiàn),位于綠色框中的物質(zhì)乙酸丁酯、己酸丙酯等在15及20年酒樣中含量顯著升高,可能與這2個(gè)樣品貯存后期酸和醇的酯化反應(yīng)有關(guān)。橘色框中2-庚酮、2-甲基丁酸乙酯等在不同貯存時(shí)間的酒樣中隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸增長(zhǎng)的趨勢(shì),說(shuō)明這些化合物在貯存較久的酒樣中有一定的積累,且年份越長(zhǎng)的酒樣中含量越高,其中酯類(lèi)物質(zhì)的增長(zhǎng)與酯化反應(yīng)及貯存過(guò)程酒體中金屬離子形成膠體有關(guān),減少了酯的揮發(fā)和水解；丁醇、糠硫醇、2-丙酮、2-庚酮等沸點(diǎn)高、極性大、不易揮發(fā),隨貯存時(shí)間延長(zhǎng)逐漸積累；醛類(lèi)物質(zhì)的升高與醇類(lèi)物質(zhì)的氧化有關(guān)。紅色框中乳酸乙酯、乙酸乙酯等隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)呈降低的趨勢(shì),這與其在貯存過(guò)程中逐漸水解有關(guān)；芳樟醇和2-丙醇沸點(diǎn)低、易揮發(fā)；辛醛的減少與酒中的溶解氧氧化有關(guān)。黑色框中2-甲基丙醇、異戊醇等隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降的變化趨勢(shì),這類(lèi)物質(zhì)可能是內(nèi)部物質(zhì)合成或者是分解的產(chǎn)物,后期的降低可能與其參與氧化反應(yīng)有關(guān)。此外,除了已定性的化合物剩余未知化合物有待于進(jìn)一步鑒定研究。

表3 通過(guò)GC-IMC對(duì)同一輪次不同貯存時(shí)間醬香型白酒 揮發(fā)性化合物的定性結(jié)果Table 3 Volatile compounds of sauce flavor Baijiu with different storage times by GC-IMS

續(xù)表3

續(xù)表3

a-二維譜圖；b-指紋圖譜圖6 同一輪次不同貯存時(shí)間醬香型白酒GC-IMS分析譜圖Fig.6 GC-IMS spectrum of sauce-flavor Baijiu in the same round and different storage time

3 結(jié)論與討論

實(shí)驗(yàn)利用模擬酒樣探究了GC-IMS應(yīng)用于白酒研究的最優(yōu)條件。首先,確定了酒樣不需要加鹽處理；其次,確定了GC-IMS正常工作所能檢測(cè)酒樣的最高酒精度為30%,最優(yōu)酒樣稀釋度數(shù)為10%；最后,確定了最優(yōu)平衡體積、平衡溫度和平衡時(shí)間,分別為1 mL、60 ℃和10 min。在最優(yōu)條件下,對(duì)同一輪次不同貯存時(shí)間的郎酒樣品進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)貯存時(shí)間不超過(guò)10年的樣品中,物質(zhì)含量緩慢變化,多數(shù)物質(zhì)在不同貯存時(shí)間的樣品中隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì),其中乙酸丁酯、己酸甲酯、戊醇、戊酸乙酯、庚酸乙酯、異己酸乙酯、己酸丙酯、己醇、辛酸乙酯、2-戊酮、戊醛在貯存時(shí)間為15及20年的酒樣中含量顯著高于其他貯存時(shí)間的酒樣。

通過(guò)對(duì)酒精度、平衡體積及平衡溫度等條件的優(yōu)化建立了快速、無(wú)損、痕量的白酒檢測(cè)新方法,為GC-IMS應(yīng)用于白酒等高度酒領(lǐng)域提供理論與方法借鑒。但是,由于儀器自帶數(shù)據(jù)庫(kù)中化合物數(shù)量有限,定性方面還存在一定的不足,因此,建立完整成熟的數(shù)據(jù)庫(kù)和實(shí)驗(yàn)方法是GC-IMS應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域的必要基礎(chǔ)。