紀文君，王 鑫，張?zhí)鹛?，周銘?/p>

（江蘇省蘇州高新區(qū)人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，蘇州 215000）

喉鱗狀細胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC）是最常見的頭頸部腫瘤之一，每年發(fā)病率約占全球新發(fā)惡性腫瘤的2.4%[1-2]。盡管LSCC的診斷和治療取得了進步，但在過去20年中患者的預(yù)后并未得到改善。尤其對中晚期LSCC 患者而言，即使進行了有效的外科手術(shù)切除，5年生存率仍較低。已經(jīng)有眾多的研究探討LSCC的發(fā)病機制和轉(zhuǎn)移途徑，但目前LSCC的確切發(fā)病機制還不清楚。

有研究顯示細胞因子、機體免疫應(yīng)答和相關(guān)的炎性及免疫介質(zhì)參與腫瘤的發(fā)病過程[3-4]。白細胞介素22（interleukin-22,IL-22）是近年來發(fā)現(xiàn)的IL-10 細胞因子家族中的一員,主要由固有淋巴細胞、Th17 細胞及Th22 細胞等分泌。IL-22 參與多種腫瘤的發(fā)病機制包括增殖和轉(zhuǎn)移，如結(jié)腸癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、甲狀腺癌和淋巴瘤等[5]。但是IL-22在LSCC發(fā)病中的作用尚未見相關(guān)報道，因此本研究通過檢測LSCC 和癌旁組織中IL-22 及受體的表達，初步探討IL-22 在LSCC 中與其預(yù)后的關(guān)系，從而為今后探討LSCC 發(fā)病機制中是否有IL-22的參與，做出基礎(chǔ)鋪墊。

1 資料和方法

1.1 一般資料

收集2013 年4—10 月哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科經(jīng)過全喉切除或部分半喉切除術(shù)的LSCC 患者標本30 例，其中男25 例，女5 例，年齡43～76 歲。所有患者均為首次接受手術(shù)治療，術(shù)前均未進行化療、放療以及其他生物治療，且全身檢查未發(fā)現(xiàn)存在腫瘤遠處轉(zhuǎn)移，全部手術(shù)切除標本經(jīng)病理確診為LSCC。選取LSCC組中23例全喉切除術(shù)的患者距離腫瘤＞2.0 cm以上的癌旁黏膜組織作為對照組，并經(jīng)蘇木精—伊紅（HE）染色病理檢查證實為喉正常組織。按照國際抗癌協(xié)會（UICC）TNM分類標準（2002）方案進行TNM分期，所有病例術(shù)后隨訪5 年，記錄患者轉(zhuǎn)移及死亡時間。本實驗所有入選的LSCC組織和癌旁對照組織的標本均征得患者知情同意。

1.2 方法

手術(shù)切除后隨即將符合標準的LSCC標本及其相應(yīng)的癌旁組織分成兩份，一份放入液氮中，轉(zhuǎn)送至實驗室-80 ℃冰箱保存。一份經(jīng)4%多聚甲醛固定，進行石蠟包埋，然后再連續(xù)切取5 μm 厚度的石蠟切片待用。

1.2.1 HE 染色 石蠟切片經(jīng)乙醇脫蠟，放入蘇木精中染色5 min，自來水沖洗并充分浸泡5 min。伊紅染液中2 min 然后常規(guī)脫水、透明、封片并烤干（HE 染色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司，中國）。在顯微鏡下觀察喉癌組織和癌旁對照組織，證實所有喉癌組織切片為喉鱗狀細胞癌，癌旁對照組織為無癌細胞正常組織。

1.2.2 免疫組織化學染色 石蠟切片在64 ℃烤箱脫蠟15 min，檸檬酸修復液置于微波爐中高火3 min煮沸，將石蠟切片放入修復液中，中火15 min，室溫冷卻。室溫下3% H2O2濕盒中孵育10 min，PBS 緩沖液沖洗。滴加正常山羊血清封閉，加入相應(yīng)濃度的一抗（Abcam，美國）（抗IL-22 抗體1∶300，抗IL-22R1抗體1∶300），放入4 ℃冰箱過夜16 h。PBS液清洗干凈加入相應(yīng)的兔抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中國），放入保濕盒中，IL-22、IL-22R1 分別放入37 ℃烤箱中和靜止于室溫下30 min。DAB試劑盒顯影，蘇木精復染、脫水然后封片。

顯微鏡下觀察黃色或棕黃色染色為陽性表達。每張切片隨機觀察10個高倍（×400）視野，每個高倍視野中計數(shù)100 個細胞，取其中陽性細胞數(shù)均數(shù)，計算百分比。判斷標準[6-7]：將陽性腫瘤細胞所占的百分比評分，0 分為陰性，1 分為陽性細胞百分比≤10%，2 分為11%～50%，3 分為51%～75%，4 分為＞75%；染色強度評分，0 分為無色，1 分為淡黃色，2 分為棕黃色，3 分為棕褐色。總免疫染色評分為強度評分乘以陽性細胞百分數(shù)評分，范圍為0～12。將分數(shù)≤6定義為低表達，＞6定義為高表達。

1.2.3 實時熒光定量PCR 反應(yīng)（RT-qPCR）將冰凍新鮮喉癌及癌旁對照組織標本，采用Trizol 試劑提取總RNA，紫外吸收測定法檢測抽提RNA 純度及濃度檢測。按照PrimeScript RT reagent Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書上的操作步驟進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)并制備cDNA。按照SYBR Green Realtime PCR Master Mix 試劑盒說明書進行PCR 擴增反應(yīng)。引物序列：IL-22，上游引物5’-GCAGGCTTGACAAGTCCAACT-3’，下游引物5’-GCCTCCTTAGCCAGCATGAA-3’；IL-22R1:上游引物5’-CTACATGTGCCGAGTGAAGA-3’，下游引物5’-ACATATCTGTAGCTCAGGTA-3’；β-actin：上游引物5’-GCAAGCAGGAGTATGACGAG-3’，下游引物5’-CAAATAAAGCCATGCCAATC-3’。每個標本設(shè)3 個復孔，取其CT 平均值，以β-actin 作為管家基因，采用2-△△Ct計算目的基因在LSCC及癌旁組織的差異。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用頻數(shù)或百分率（%）表示，率的比較采用χ2檢驗和Fisher 確切概率法。Kaplan—Meier 生存曲線分析LSCC 中IL-22 及IL-22R1 表達與患者總體生存期的關(guān)系，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-22及IL-22R1在LSCC中的表達

IL-22陽性染色主要分布在細胞質(zhì)，很少在細胞核中表達。在LSCC 組中IL-22 主要表達在腫瘤細胞及癌巢周圍的間質(zhì)或纖維組織中。在癌旁對照組織中IL-22陽性表達主要位于鱗狀上皮細胞和炎性細胞，尤其在CD4+T 細胞和巨噬細胞中表達（圖1）。IL-22在LSCC 中的表達明顯高于在對照組中的表達（P＜0.05）（圖2）。

IL-22R1也主要在細胞質(zhì)中表達，在LSCC組中主要表達在腫瘤細胞。在對照組織中，IL-22R1 的表達主要分布在上皮細胞、間質(zhì)、黏膜下腺體、血管上皮細胞和炎性細胞（圖1）。而且IL-22R1在LSCC組中的表達明顯高于對照組（P＜0.05）（圖2）。

圖2 IL-22及IL-22R1在LSCC組及對照組表達的比較

2.2 IL-22 mRNA、IL-22R1 mRNA 在LSCC 中的表達

IL-22 mRNA 及其IL-22R1 mRNA 在LSCC 組中明顯高于對照組（P＜0.05），見圖3。

2.3 IL-22 mRNA、IL-22R1 mRNA 表達與LSCC 臨床病理特征之間的關(guān)系

IL-22 mRNA 及IL22R1 mRNA 的表達與LSCC的臨床分期和區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)（均P＜0.05），而與患者年齡、性別、原發(fā)部位無關(guān)、T 分期和病理分化程度無明顯差異（均P＞0.05），見表1。

表1 IL-22 mRNA 和IL-22R1 mRNA 表達與喉癌臨床病理特征的關(guān)系 n

2.4 IL-22 mRNA、IL-22R1 mRNA 表達與LSCC 患者生存分析

高表達IL-22 mRNA的LSCC 患者平均生存期（39個月）明顯短于低表達IL-22 mRNA的LSCC 患者平均生存期（P＜0.05），見圖4。生存曲線同時也顯示高表達IL-22R1 mRNA的LSCC患者平均生存期（80 個月）明顯短于低表達IL-22R1 mRNA 的LSCC患者平均生存期（P＜0.05），見圖5。

圖4 IL-22 的表達與生存曲線的關(guān)系

圖5 IL-22R1 mRNA 的表達與生存曲線的關(guān)系

3 討論

LSCC是僅次于口腔癌的頭頸部常見的第二大惡性腫瘤，也是呼吸系統(tǒng)常見的第二大腫瘤[8]。LSCC 的主要病理類型為鱗狀細胞癌，約占總數(shù)的96%～98%。LSCC可發(fā)生于喉內(nèi)所有區(qū)域，以聲門區(qū)癌最為多見，其次為聲門上區(qū)，以聲門下區(qū)極少見。在我國北方地區(qū)發(fā)病率明顯高于南方地區(qū)，男性患者明顯多于女性患者。LSCC的發(fā)病原因十分復雜，至今仍不十分明確。

研究顯示在頭頸部鱗狀細胞癌基質(zhì)中，LSCC是一種與周圍腫瘤微環(huán)境具有廣泛相互作用的實體腫瘤[9-10]。腫瘤周圍的基質(zhì)和細胞浸潤構(gòu)成了腫瘤的微環(huán)境。先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫細胞以及其他細胞因子和信號分子參與了腫瘤微環(huán)境的形成[11]。例如，腫瘤壞死因子超家族成員13（tumor necrosis factor superfamily member 13）[9]、IL-33[8]、高水平的CXCL5[7]等多種細胞因子直接或者間接的導致喉癌細胞的發(fā)生和發(fā)展。

2000 年Dumoutier 等[12]用IL-9 刺激小鼠T 淋巴細胞發(fā)現(xiàn)了一種新型細胞因子，編碼一種α 螺旋狀的蛋白質(zhì)，由于其主要結(jié)構(gòu)與IL-10 極其相似具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，將其命名為IL-10相關(guān)的T細胞衍生誘導因子（iL-10-related T cell-derived inducible factor，IL-TIF）。隨后，由Xie 等[13]將其命名為IL-22，并將其歸屬于IL-10 家族中。IL-22 主要由Th22、Th1、Th17細胞、固有淋巴細胞（ILCs）、γδT細胞和NKT 細胞表達[13-14]。IL-22 受體為IL-22R1 和IL-10R2，其中IL-22R1是IL-22的特異性結(jié)合受體，主要作用于表達IL-22R1 的上皮細胞。IL-22 與表達IL-22R1的細胞結(jié)合而發(fā)揮生物學作用。

既往研究發(fā)現(xiàn)IL-22具有上調(diào)抗凋亡通路及促進細胞增殖的作用，因此，在一些急性炎癥或組織損傷的情況下，IL-22 主要起保護作用。在增殖及抗凋亡為促進因素的疾病中，IL-22也起著促進疾病發(fā)展的作用。Kobold等[15]的研究表明，IL-22可增加肺癌細胞株的耐藥性，Zhuang 等[16]發(fā)現(xiàn)IL-22＋CD4＋T 細胞及Th22 細胞是構(gòu)成胃癌腫瘤微環(huán)境的重要成分、增加瘤內(nèi)的IL-22＋CD4＋T細胞及Th22細胞可促進胃癌的發(fā)展且與胃癌患者的預(yù)后相關(guān)等研究相一致，IL-22 能夠通過活化某些致癌轉(zhuǎn)錄因子，從而激活某種或幾種信號通路（如STAT3 信號傳導通路[17-18]）促進癌癥細胞的增殖，抑制細胞凋亡，促進腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移。

本次IL-22 及IL-22R1 在LSCC 中的研究中，免疫組織化學實驗結(jié)果顯示IL-22 及IL-22R1 不僅在癌巢集中區(qū)表達豐富，還在癌巢間質(zhì)中散在分布。IL-22及IL-22R1在LSCC中的表達顯著高于癌旁對照組織。同時RT-qPCR 結(jié)果顯示LSCC 組IL-22 及IL-22R1 mRNA 表達明顯高于對照組，提示IL22 及IL-22R1 高表達與LSCC 的發(fā)病密切相關(guān)。通過分析與LSCC患者臨床病理特征的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)IL-22及IL-22R1的表達與LSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)。IL-22 及IL-22R1 在臨床Ⅲ/Ⅳ期中的表達明顯高于臨床Ⅰ/Ⅱ期，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。通過LSCC 患者5 年隨訪生存期，結(jié)果顯示IL-22 及IL-22R1 高表達患者預(yù)后較差，生存期明顯縮短。表明，IL-22 及IL-22R1 在LSCC 組織中表達增高，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)，其可能是LSCC的重要生物標志物。

綜上，IL-22 及IL-22R1 在LSCC 組織中表達增高，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。腫瘤微環(huán)境中免疫細胞介導的宿主反應(yīng)對腫瘤的發(fā)生有重要作用。識別細胞因子作為惡性轉(zhuǎn)化的生物標志物，有助于指導診斷和靶向治療。IL-22在LSCC發(fā)病中的具體機制還需要進一步的研究，IL-22可能是LSCC 治療的新靶點，為LSCC 的治療提供新的途徑。