余如剛，張 迪，余心悅，唐 鋼，楊嬌嬌，趙有弟，吳 嬋

（淮北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 淮北 235000）

土壤鹽漬化是被廣泛關(guān)注的全球性問題[1]。土壤中過高的鹽離子，如鈉離子（Na+）和氯離子（Cl-），易引發(fā)離子毒害，抑制作物生長(zhǎng)和發(fā)育，降低作物產(chǎn)量和品質(zhì)[1-2]。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織統(tǒng)計(jì)，全球有各種鹽漬土約8 億hm2[3]。中國(guó)鹽漬土面積約為0.36 億hm2，隨著化肥過量使用和管理措施落后等原因，鹽漬土面積呈逐年增加的趨勢(shì)[4]。隨著人口壓力不斷增大，開發(fā)利用鹽漬化土壤成為緩解土地危機(jī)的有效措施[5-7]。因此，篩選和培育優(yōu)異耐鹽作物種質(zhì)資源對(duì)鹽漬土壤利用和保障糧食安全具有重要意義[6,8]。

小白菜（Brassica rapaL.ssp.chinensis）隸屬十字花科蕓薹屬，是中國(guó)重要的葉菜類蔬菜作物。其具有葉表面積大、含水量高、組織脆嫩、易黃化和腐爛等特點(diǎn)，不易長(zhǎng)距離運(yùn)輸，宜在消費(fèi)地周邊種植[9]。因此，研究小白菜在鹽脅迫下的生長(zhǎng)規(guī)律，篩選與培育耐鹽小白菜種質(zhì)資源，明確其耐鹽機(jī)制，不僅能有效利用鹽漬化土地，而且有利于周邊地區(qū)市場(chǎng)供應(yīng)。MEMON 等[10]發(fā)現(xiàn)：50 mmol/L NaCl 條件下，小白菜種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)良好，超過該濃度則生長(zhǎng)受到抑制。作物對(duì)鹽的耐受性是一個(gè)復(fù)雜的綜合性狀，因此，近年來耐鹽種質(zhì)資源篩選的方法多以主成分分析法、隸屬函數(shù)法、回歸分析和聚類分析法等多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)方法為主[11-15]。本研究以13 份不同小白菜種質(zhì)的苗期為研究對(duì)象，以形態(tài)和生理生化指標(biāo)的耐鹽系數(shù)為基礎(chǔ)，采用主成分分析、隸屬函數(shù)值法、聚類分析和逐步回歸分析等多元分析方法，綜合評(píng)價(jià)不同品種小白菜的耐鹽性，篩選耐鹽鑒定指標(biāo)，建立苗期耐鹽性篩選評(píng)價(jià)體系，為小白菜耐鹽性種質(zhì)資源的挖掘和快速、準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

13 份供試小白菜品種為淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院園藝系收集的商用品種（表1）。

表1 供試小白菜品種及來源Tab.1 The origins of Brassica rapa L.ssp.chinensis varieties in test

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料培養(yǎng)與處理

試驗(yàn)于2019 年9—11 月在淮北師范大學(xué)園藝實(shí)訓(xùn)基地進(jìn)行。采用盆栽（口徑13 cm，高12 cm）試驗(yàn)，以洗凈的河沙為基質(zhì)，挑選均勻一致的小白菜種子直接播種。出現(xiàn)真葉時(shí)，間隔1 d 澆100 mL 霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液；幼苗長(zhǎng)到2～3 片真葉時(shí)疏苗，每盆留長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗6 株。播種14 d 后設(shè)置第1 次鹽脅迫，共3 個(gè)處理：無NaCl 的霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液（對(duì)照）以及添加NaCl 后濃度分別為100 和200 mmol/L[10]的霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液處理，每盆各添加100 mL 處理液；之后，每間隔1 d 澆100 mL無NaCl 的霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液。播種21 d 后，進(jìn)行第2 次鹽脅迫（同第1 次鹽脅迫處理），每間隔1 d添加含不同濃度NaCl（0、100 和200 mmol/L）的霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液100 mL。試驗(yàn)期間每盆添加營(yíng)養(yǎng)液均為上午和下午各50 mL。播種28 d 后統(tǒng)計(jì)成活率，并分別取根和葉樣品進(jìn)行形態(tài)和生理指標(biāo)測(cè)定。每品種各處理設(shè)3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

根據(jù)觀察不同濃度NaCl 處理下小白菜形態(tài)特征，發(fā)現(xiàn)四季高腳甜白菜、四季小白菜和矮萁蘇州青在200 mmol/L NaCl 處理14 d 后植株幾乎全部死亡。因此，本研究?jī)H以100 mmol/L NaCl 處理下16 個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)的耐鹽系數(shù)為評(píng)價(jià)依據(jù)，利用多元分析法對(duì)13 份小白菜種質(zhì)的耐鹽性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.2.2 形態(tài)指標(biāo)測(cè)定

播種28 d 后從每盆隨機(jī)選取3 株長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，用直尺測(cè)量基質(zhì)表面到植株最頂部的距離作為株高（PH）；選取植株的第3 片真葉，用直尺測(cè)量葉寬（LW）；取樣時(shí)將根、葉分開，分別稱量根鮮質(zhì)量（RFW）和葉鮮質(zhì)量（LFW）；然后放于105 ℃烘箱中殺青1 h，再在70 ℃條件下烘干至恒質(zhì)量，分別稱量根干質(zhì)量（RDW）和葉干質(zhì)量（LDW）。

1.2.3 生理指標(biāo)的測(cè)定

以葉片為研究對(duì)象，分別測(cè)定0（對(duì)照）和100 mmol/L NaCl 處理下各項(xiàng)生理指標(biāo)。Na+和K+含量的測(cè)定在山東省農(nóng)科院可持續(xù)發(fā)展研究所利用火焰光度計(jì)（FP-640，中國(guó)上海）進(jìn)行；葉綠素a（Chla）、葉綠素b（Chlb）、總?cè)~綠素（TChl）、丙二醛（MDA）和可溶性蛋白（SP）含量的測(cè)定參照張志良等[16]的方法；過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性的測(cè)定采用紫外分光光度法，具體操作按照試劑盒說明書（POD-2-Y 和CAT-2-Y，科銘生物，蘇州）進(jìn)行；植株電導(dǎo)率（EC）的測(cè)定利用DDSJ-308F 電導(dǎo)率儀（上海雷磁有限公司）[17]進(jìn)行。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與綜合評(píng)價(jià)

采用Microsoft Excel 2010 處理原始數(shù)據(jù)；采用IBM SPSS 25.0 軟件進(jìn)行多元分析。具體指標(biāo)計(jì)算如下[11,17]。

（1）計(jì)算各單項(xiàng)指標(biāo)的耐鹽系數(shù)（salinity tolerance coefficient，STC）

為了分析各單項(xiàng)指標(biāo)之間的關(guān)系，將各指標(biāo)的耐鹽系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。

（2）計(jì)算各小白菜品種綜合指標(biāo)（comprehensive index，CI）的隸屬函數(shù)值[U（Xi）]

式中：Xi表示主成分分析所得的第i個(gè)綜合指標(biāo)值；Xmax和Xmin分別為各種質(zhì)在第i個(gè)綜合指標(biāo)值中的最大值和最小值。

在第i個(gè)綜合指標(biāo)中，當(dāng)某種質(zhì)的隸屬函數(shù)值U（Xi）最大為1.00 時(shí)，表示該種質(zhì)在第i個(gè)綜合指標(biāo)上評(píng)價(jià)為耐鹽性最強(qiáng)；而當(dāng)U（Xi）最小為0.00 時(shí)，表示該種質(zhì)在第i個(gè)綜合指標(biāo)上評(píng)價(jià)為耐鹽性最弱。利用SPSS 25.0 軟件對(duì)6 個(gè)形態(tài)指標(biāo)和10 個(gè)生理生化指標(biāo)的耐鹽系數(shù)進(jìn)行主成分分析，計(jì)算各主成分的特征向量和貢獻(xiàn)率，并根據(jù)各特征向量的絕對(duì)值將不同指標(biāo)劃分到不同的主成分中。同一指標(biāo)在各因子中的最大絕對(duì)值所在位置即為其所屬主成分。

（3）計(jì)算各小白菜品種綜合指標(biāo)的權(quán)重（Wi）

式中：Wi表示第i個(gè)綜合指標(biāo)在所有綜合指標(biāo)中的重要程度；Pi為主成分分析第i個(gè)綜合指標(biāo)對(duì)全部綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率。

（4）計(jì)算各小白菜品種的耐鹽性綜合評(píng)價(jià)值（D）

為了相對(duì)客觀和科學(xué)合理地評(píng)價(jià)各小白菜品種的耐鹽性，利用最小距離準(zhǔn)則對(duì)D值進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。同時(shí)，為了分析各單項(xiàng)指標(biāo)與耐鹽性之間的關(guān)系，篩選準(zhǔn)確的耐鹽鑒定指標(biāo)，探討可用于預(yù)測(cè)小白菜耐鹽性評(píng)價(jià)的數(shù)學(xué)模型，將各指標(biāo)的耐鹽系數(shù)（STC 值）作為自變量，回歸預(yù)測(cè)綜合評(píng)價(jià)值（D′）作為因變量進(jìn)行逐步回歸分析，建立最佳回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同小白菜品種各指標(biāo)的耐鹽系數(shù)及其相關(guān)關(guān)系分析

由表2 可知：各單項(xiàng)指標(biāo)的耐鹽系數(shù)在13份小白菜品種間變化顯著。變異范圍為5.43%～69.27%；其中，Na+含量的變異系數(shù)最大，變異系數(shù)較大的為K+、SP、RDW、LFW、CAT、LDW、RFW、Chlb、POD 和TChl 指標(biāo)，說明鹽脅迫對(duì)這些指標(biāo)的影響較大。不同小白菜品種經(jīng)鹽處理后，LW、RFW、LFW、RDW 和LDW 指標(biāo)值與對(duì)照相比有所下降（STC＜1），Na+含量指標(biāo)值與對(duì)照相比有所上升（STC＞1），其他指標(biāo)值與對(duì)照相比則在不同品種中呈不同的變化（STC＜1或STC＜1）。說明單項(xiàng)指標(biāo)的耐鹽系數(shù)只能反映小白菜耐鹽性的局部數(shù)據(jù)，難以直接決定各品種的耐鹽性。

由表3 可知：PH 與Chla、Chlb、TChl、SP、EC 顯著相關(guān)；LW 與K+、LFW 與K+、SP 與POD、EC 與CAT 均顯著相關(guān)；RFW 與RDW、MDA與K+、POD 與Na+極顯著相關(guān)。說明各指標(biāo)提供的評(píng)價(jià)信息存在重疊，即小白菜耐鹽性是一種綜合性狀的表現(xiàn)；同時(shí)，各指標(biāo)在小白菜耐鹽性評(píng)價(jià)中發(fā)揮的作用也不盡相同。因此，需要進(jìn)一步鑒定才能夠評(píng)價(jià)鹽脅迫下小白菜品種的耐鹽指標(biāo)。

表3 各單項(xiàng)指標(biāo)耐鹽系數(shù)的相關(guān)系數(shù)矩陣Tab.3 Correlation coefficient matrix of salinity tolerance coefficient of every single index

2.2 不同小白菜品種耐鹽性評(píng)價(jià)指標(biāo)的主成分分析

主成分分析結(jié)果（表4）顯示：前6 個(gè)綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)（CI）的貢獻(xiàn)率分別為28.13%、19.40%、16.18%、12.82%、7.32% 和4.41%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為88.25%，因此，可將16 個(gè)初始測(cè)定指標(biāo)轉(zhuǎn)換為6 個(gè)綜合指標(biāo)，分別定義為第1（CI1）～第6（CI6）主成分，能代表16 個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)攜帶的絕大部分信息，可以用這6 個(gè)主成分指標(biāo)對(duì)13 份小白菜品種的耐鹽性進(jìn)行概括。分析顯示：CI1中主要與TChl、Chla 和Chlb 指標(biāo)相關(guān)；CI2中主要與Na+、PH、EC、RDW 和SP 指標(biāo)相關(guān)；CI3中主要與RFW 指標(biāo)相關(guān)；CI4中主要與LFW、POD 和LDW 指標(biāo)相關(guān)；CI5中主要與LW 和Na+指標(biāo)相關(guān)；CI6中主要與CAT 和MDA指標(biāo)相關(guān)。

表4 主成分分析各綜合指標(biāo)系數(shù)及貢獻(xiàn)率Tab.4 Coefficients and contribution ratio of comprehensive indicators of principal component

2.3 不同品種小白菜苗期耐鹽性綜合評(píng)價(jià)

依據(jù)綜合指標(biāo)值，通過公式（2）得出13 份小白菜種質(zhì)的隸屬函數(shù)值；通過公式（3）計(jì)算各綜合指標(biāo)在主成分貢獻(xiàn)率中的權(quán)重，得出6 個(gè)綜合指標(biāo)的權(quán)重分別為0.31、0.22、0.18、0.14、0.08和0.05；利用公式（4）計(jì)算13 份小白菜的綜合耐鹽評(píng)價(jià)值（D）（表5）。依據(jù)D值對(duì)13 份小白菜種質(zhì)的耐鹽性強(qiáng)弱進(jìn)行排序，D值最高的為特種上海青（0.77），表明其耐鹽性最強(qiáng)；D值最低的為綠領(lǐng)火白菜和耐熱四季甜白菜（均為0.27），表明其耐鹽性最弱。對(duì)D值進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，可將13 份小白菜種質(zhì)劃分為4 類（圖1）：特種上海青為第Ⅰ類，為高度耐鹽型；上海四月慢、綠領(lǐng)矮腳黃、矮萁蘇州青、黃金小白菜、四季小白菜、四季高腳甜白菜和黑美人為第Ⅱ類，為耐鹽型；兔子腿矮腳黃、四倍體矮腳黃和白葉四月慢為第Ⅲ類，為中度耐鹽型；耐熱四季甜白菜和綠領(lǐng)火白菜為第Ⅳ類，為鹽敏感型。

圖1 13 份小白菜品種耐鹽性聚類分析Fig.1 Classified cluster diagram on salt tolerance of thirteen Brassica rapa L.ssp. chinensis varieties

表5 13 份小白菜品種綜合指標(biāo)隸屬函數(shù)分析Tab.5 Subordinate function analysis of comprehensive index in thirteen B.rapa L.ssp.chinensis varieties

2.4 回歸分析及小白菜耐鹽鑒定指標(biāo)的選擇

以D值為因變量，16 個(gè)指標(biāo)的耐鹽系數(shù)為自變量進(jìn)行逐步線性回歸分析，建立回歸方程：D′=-0.206+0.632 PH+0.275 RDW（P＜0.05，R2=0.589），利用該回歸方程對(duì)13 份種質(zhì)進(jìn)行回歸預(yù)測(cè)綜合評(píng)價(jià)，平均估算精度為85.06%，表明鹽處理?xiàng)l件下，耐鹽性較高的品種其根干質(zhì)量（RDW）和株高（PH）增加趨勢(shì)明顯。因此，根干質(zhì)量和株高可用于預(yù)測(cè)相同條件下不同小白菜品種的耐鹽性。

3 討論

區(qū)域性土壤鹽漬化已成為蔬菜生產(chǎn)中最難控制的環(huán)境污染之一。研究顯示：鹽脅迫影響小白菜的生長(zhǎng)和產(chǎn)量，且不同小白菜種質(zhì)間的耐鹽性存在顯著差異[10,18-19]。因此，如何通過高效的方法篩選和鑒定小白菜耐鹽種質(zhì)顯得尤為重要。幼苗期和萌發(fā)期是作物耐鹽性篩選的主要生育階段[20]，并且幼苗期的耐鹽性與成株的耐鹽性存在相關(guān)性[21]。鹽脅迫對(duì)幼苗期的影響主要表現(xiàn)在形態(tài)、生理、生化和產(chǎn)量等指標(biāo)上[22]，且各指標(biāo)在耐鹽性評(píng)價(jià)中所起作用不同[11-12,15,17]，因此，在作物耐鹽性評(píng)價(jià)過程中應(yīng)結(jié)合多種指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)，包括耐鹽評(píng)價(jià)指標(biāo)體系和綜合評(píng)價(jià)數(shù)學(xué)模型的選擇[23]。對(duì)于小白菜耐鹽性的評(píng)價(jià)已有少量報(bào)道，徐芬芬等[18]以30 份小白菜萌發(fā)期的相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)胚芽長(zhǎng)、相對(duì)胚鮮質(zhì)量、相對(duì)胚根長(zhǎng)和相對(duì)根毛區(qū)寬度等5 個(gè)指標(biāo)為基礎(chǔ)，利用隸屬函數(shù)值累加求平均值法進(jìn)行耐鹽性評(píng)價(jià)。盡管該方法是利用隸屬函數(shù)法對(duì)小白菜多個(gè)性狀指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，但是評(píng)價(jià)結(jié)果不能判斷各指標(biāo)對(duì)耐鹽性評(píng)價(jià)所起的作用大小。

利用主成分分析、隸屬函數(shù)法和逐步回歸分析法等多元分析法，不僅可以結(jié)合多個(gè)指標(biāo)對(duì)作物的耐鹽性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，而且還能建立可靠的評(píng)價(jià)體系。該方法已用于綠豆[11]、南瓜[12]和大豆[15]等作物的耐鹽性評(píng)價(jià)及預(yù)測(cè)模型建立。于崧等[11]測(cè)定鹽脅迫下綠豆苗期的20 個(gè)形態(tài)和生理指標(biāo)，通過多元分析方法評(píng)價(jià)30 個(gè)綠豆品種的耐鹽堿性，并建立評(píng)價(jià)模型，篩選出7 個(gè)耐鹽堿鑒定單項(xiàng)指標(biāo)?？梢姡嘣治龇ㄊ窃u(píng)價(jià)作物耐鹽性和建立耐鹽性評(píng)價(jià)體系的有效方法之一，但利用多元分析法對(duì)小白菜種質(zhì)耐鹽性篩選的研究鮮有報(bào)道。本研究選擇6 個(gè)形態(tài)指標(biāo)和10 個(gè)生理生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，并運(yùn)用多元分析方法對(duì)13 份小白菜苗期耐鹽性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，這是本研究的創(chuàng)新點(diǎn)。

耐鹽系數(shù)通常被用作評(píng)價(jià)耐鹽性的標(biāo)準(zhǔn)[11-13,15,18]。本研究以16 個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)的耐鹽系數(shù)為基礎(chǔ)，利用主成分分析將16 個(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)換為6 個(gè)綜合指標(biāo)，并得到不同品種小白菜幼苗的耐鹽性綜合評(píng)價(jià)值（D），依據(jù)D值聚類分析結(jié)果，較為客觀地將13 份小白菜種質(zhì)分為高度耐鹽、耐鹽、中度耐鹽和鹽敏感4 種類型。其中，四倍體矮腳黃（中度耐鹽）評(píng)價(jià)結(jié)果與徐芬芬等[18]的研究結(jié)果稍有差異，其評(píng)價(jià)為高度耐鹽，這可能是由于評(píng)價(jià)方法的差異造成，具體需要進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，本研究通過逐步回歸法建立了小白菜苗期耐鹽性預(yù)測(cè)模型，該模型平均估算精度為85.06%，可用于在幼苗階段篩選小白菜耐鹽種質(zhì)。

4 結(jié)論

本研究將供試的13 份小白菜種質(zhì)分為高度耐鹽（1 個(gè)）、耐鹽（7 個(gè)）、中度耐鹽（3 個(gè)）和鹽敏感（2 個(gè)）4 個(gè)類型，其中特種上海青為高度耐鹽型小白菜，耐熱四季甜白菜和綠領(lǐng)火白菜為鹽敏感型小白菜。研究建立了小白菜幼苗耐鹽性預(yù)測(cè)模型D′=-0.206+0.632PH+0.275RDW，篩選出根干質(zhì)量（RDW）和株高（PH）為小白菜耐鹽性鑒定指標(biāo)。研究結(jié)果將為小白菜耐鹽種質(zhì)資源篩選及良種選育提供科學(xué)支持。