喬智灝， 李嘉瑩， 劉昶

(1.南方醫(yī)科大學(xué) 第七附屬醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科, 廣東 佛山 528300； 2.廣東同江醫(yī)院 藥劑科， 廣東 佛山 528300； 3.廣東同江醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科， 廣東 佛山 528300)

真菌感染不斷增加，對生命和健康構(gòu)成巨大威脅[1].侵襲性念珠菌感染(invasive candida infection，ICI)是臨床上常見的感染類型[2].統(tǒng)計(jì)顯示ICI是血液感染的第4大原因之一，并且每年有超過25萬人因ICI致病，并且致死率高達(dá)40%[3].作為共生微生物，白色念珠菌主要定植于多個黏膜部位，包括口腔、胃腸道和泌尿生殖道，在健康個體中無癥狀[4].但是在易感染人群中，白色念珠菌可進(jìn)入血液并引起經(jīng)常致命的播散性感染[5].然而ICI后無明顯的臨床特征，并且常規(guī)的檢測方法靈敏度不高[6],這就導(dǎo)致臨床上易出現(xiàn)漏診，延誤最佳治療時機(jī).因此亟需尋找一種有效、準(zhǔn)確的ICI診斷標(biāo)志物來提升診斷水平.

microRNA(miR)是一種長度約18～24nt的非編碼RNA，是非編碼RNA家族重要成員[7-8].miR可通過與下游靶向mRNA互補(bǔ)序列配對，起到調(diào)節(jié)下游mRNA表達(dá)的作用[9].研究顯示，miR參與了人類多種急性與慢性病、炎癥、癌癥、感染及器官損傷[10-11].miR-140-3p是人們早期發(fā)現(xiàn)的一種miR，位于人16q22.1染色體上[12].目前關(guān)于miR-140-3p的研究主要以腫瘤為主.例如miR-140-3p靶向PD-L1抑制大腸癌細(xì)胞生長和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，miR-140-3p靶向FOXQ1抑制膀胱癌細(xì)胞增殖和侵襲[13].但是，近年來研究發(fā)現(xiàn)miR-140-3p可通過調(diào)節(jié)下游基因參與細(xì)菌感染，并具有抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用[14].miR-140-3p在ICI中是否具有同樣作用仍不明確.Muhammad等[15]在miR表達(dá)譜分析中發(fā)現(xiàn)ICI患者中miR-140-3p表達(dá)降低，這說明miR-140-3p可能參與了ICI的發(fā)生.

本研究旨在探究miR-140-3p在ICI患者中的診斷意義以及預(yù)后價(jià)值，為臨床診斷與預(yù)后觀察提供潛在觀察標(biāo)志物.

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2021年1月至2021年6月在廣東同江醫(yī)院確診治療的60例侵襲性念珠菌感染患者作為本研究實(shí)驗(yàn)組，另收集同期在廣東同江醫(yī)院進(jìn)行體檢的正常人50例作為對照組.本研究獲得該院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn).

1.2 納入排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)

患者符合2020年制定的《中國成人念珠菌病診斷與治療專家共識》[16].患者血培養(yǎng)白念珠菌均為陽性，臨床癥狀符合真菌感染.患者在本研究前并未進(jìn)行過針對性治療.

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)

單純口腔、泌尿系統(tǒng)、陰道念珠菌感染患者，器官移植患者、粒細(xì)胞缺乏患者、免疫抑制患者、合并腫瘤患者及對本次藥物不耐受患者.

1.3 治療方案

實(shí)驗(yàn)組患者采用卡泊芬凈降階梯治療，具體方案如下：注射用醋酸卡泊芬凈(正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；國藥準(zhǔn)字H20193172)每日400 mg靜脈滴注，共5 d，隨后改用氟康唑膠囊(上海健坤制藥有限公司；國藥準(zhǔn)字H20073022)每日200 mg口服，根據(jù)患者的臨床癥狀、影像學(xué)表現(xiàn)，血、痰和肺灌洗液等真菌連續(xù)培養(yǎng)陰性>1周，作為停藥指標(biāo).

1.4 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測

使用TRIzol試劑對收集到的血清進(jìn)行總RNA提取，采用PrimeScriptTMRT試劑盒對總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，收集cDNA為擴(kuò)增準(zhǔn)備.采用PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix試劑盒與ABI 7500 PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增.反應(yīng)體系與反應(yīng)條件按照試劑盒說明書進(jìn)行配置.miR-140-3p采用U6作為內(nèi)參，使用2-ΔΔ的Ct方法用于計(jì)算相對mRNA表達(dá)[17].每個實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次.miR-140-3p上游引物5’-GCGCGTACCACAGGGTAGAA-3’，下游引物5’AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’，U6上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’.

1.5 觀察指標(biāo)

觀察實(shí)驗(yàn)組與對照組血清中miR-140-3p表達(dá)水平和診斷價(jià)值.觀察患者治療前與治療后(2周)miR-140-3p表達(dá)變化水平.分析影響ICI預(yù)后的危險(xiǎn)因素.收集患者治療前血清1-3-β-D葡聚糖數(shù)據(jù)，采用logistic回歸對miR-140-3p與血清1-3-β-D葡聚糖進(jìn)行預(yù)測得到聯(lián)合診斷數(shù)據(jù)，采用ROC曲線分析聯(lián)合檢測價(jià)值.

觀察治療前后miR-140-3p與患者臨床療效之間的關(guān)系.

1.6 療效評估

按衛(wèi)生部頒發(fā)的抗感染藥物臨床研究指導(dǎo)原則[18]進(jìn)行評價(jià)，療效分為痊愈、顯效、進(jìn)步、無效 4個級別.(1)痊愈：侵襲性真菌感染的相關(guān)癥狀、體征、實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)檢查及病原學(xué)檢查全部恢復(fù)正常; (2)顯效：病情明顯好轉(zhuǎn)，但上述癥狀、體征、實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)檢查及病原學(xué)檢查中有1項(xiàng)未完全恢復(fù)正常;(3)進(jìn)步：用藥后病情有好轉(zhuǎn)，但不明顯;(4)無效：用藥后病情大改善或加重者.

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，采用Graphpad 8繪制結(jié)果圖形；計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對t檢驗(yàn)；采用Logistic回歸分析對患者預(yù)后進(jìn)行評估；采用受試者工作曲線(ROC)分析miR-140-3p在ICI患者中的診斷價(jià)值；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)用四分位數(shù)表示，采用非參數(shù)檢驗(yàn)；對多因素Logistic回歸有意義指標(biāo)進(jìn)行ROC曲線繪制；分析這些指標(biāo)在預(yù)測臨床療效中的價(jià)值.P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 基線資料比較

兩組的臨床基線資料顯示，實(shí)驗(yàn)組與對照組患者年齡，性別，體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)，既往病史，吸煙史，均不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見表1.

2.2 miR-140-3p在ICI中的表達(dá)與診斷價(jià)值

本研究通過qRT-PCR檢測了ICI患者中血清中miR-140-3p相對表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組患者血清中miR-140-3p表達(dá)水平明顯降低，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)；與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組患者血清中1-3-β-D葡聚糖濃度水平明顯上升，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001).此外，繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn)，miR-140-3p在診斷ICI的曲線下面積為0.834，特異度為73.46%，靈敏度78.33%，約登指數(shù)51.08%，Cut-off值為0.938.1-3-β-D葡聚糖在診斷ICI的曲線下面積為0.755，特異度為100.00%，靈敏度68.33%，約登指數(shù)68.33%，Cut-off值為65.34.而兩者聯(lián)合檢測曲線下面積為0.924，特異度為83.33%，靈敏度91.83%，約登指數(shù)75.17%，Cut-off值為0.437，見圖1.

表1 兩組臨床資料比較Table 1 Comparison of patient clinical data n(%)

1)P<0.001

2.3 治療前后miR-140-3p在ICI中的表達(dá)

與治療前相比治療后患者血清中miR-140-3p表達(dá)水平出現(xiàn)上升，兩組間比較存在顯著差異(P<0.01)，見圖2.

2.4 miR-140-3p在ICI預(yù)后良好組中的表達(dá)

本研究進(jìn)一步分析了治療前后患者血清中miR-140-3p表達(dá)與臨床療效的關(guān)系.患者通過治療后痊愈26例、顯效10例、進(jìn)步13例、無效11例.比較4組人群治療前后血清中miR-140-3p表達(dá)發(fā)現(xiàn)，治療前miR-140-3p表達(dá)隨著療效程度惡化表達(dá)逐漸升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，而治療后miR-140-3p表達(dá)隨著患者臨床療效的改善逐步降低，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，此外，根據(jù)療效分組發(fā)現(xiàn)，預(yù)后良好組患者治療前血清中miR-140-3p的表達(dá)明顯低于預(yù)后一般組，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，見圖3.

1)P<0.05

1)P<0.05;2)P<0.01

2.5 ICI預(yù)后危險(xiǎn)因素分析

用單因素Logistic回歸分析判斷影響ICI預(yù)后的危險(xiǎn)因素，以預(yù)后良好作為自變量(Y)，收集到的因素作為因變量(X)，見表2.結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-140-3p、年齡、糖尿病是ICI患者預(yù)后危險(xiǎn)因素(P<0.05).隨后，對單因素分析存在差異的指標(biāo)進(jìn)行多因素向后LR回歸分析，發(fā)現(xiàn)miR-140-3p、年齡、糖尿病是ICI患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表3.為了驗(yàn)證這些因素對ICI患者預(yù)后的預(yù)測價(jià)值繪制了ROC曲線,表明miR-140-3p在ICI患者預(yù)后的預(yù)測價(jià)值較高，見圖4，表4.

表2 ICI預(yù)后因素的賦值表Table 2 Assignment table for prognostic factors

表3 ICI預(yù)后危險(xiǎn)的多因素Logistic回歸分析Table 3 Logistic regression analysis of prognostic risk of ICI

A:年齡因素;B:糖尿病因素;C:miR-140-3p因素.A:Age factor; B:Diabetes factor; C:miR-140-3p factor.

表4 預(yù)后因素的ROC參數(shù)Table 4 ROC parameters for prognostic factors

3 討論

在美國的流行病調(diào)查中顯示ICI是美國第4大血行感染疾病[19].并且近年來的研究發(fā)現(xiàn)，ICI在發(fā)展中國家的感染趨勢逐漸嚴(yán)重[20].由于實(shí)驗(yàn)室真菌培養(yǎng)時間較長，確診后患者可能錯過了最佳的治療時間[21].而病理檢測作為有創(chuàng)檢測可能會增加患者感染的可能[22].這就導(dǎo)致ICI患者早期診斷非常困難.因此，尋找檢測時間短，檢出率高的生物標(biāo)志物就顯得尤為重要.

miR是一種內(nèi)源性小型RNA分子，可以調(diào)節(jié)信使RNA(mRNA)的豐度以及蛋白質(zhì)的表達(dá)，還可以有多個甚至上百個mRNA靶標(biāo)來結(jié)合，對于各種生物學(xué)過程可能均具有一定參與性[23].據(jù)報(bào)道有許多致病物種通過miR改變宿主的細(xì)胞反應(yīng)，miR現(xiàn)在被認(rèn)為是細(xì)胞機(jī)制的主要調(diào)節(jié)因子[24].miR-140-3p與miR-140-5p同屬于miR-140家族.早期的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-140-3p在腫瘤、炎癥和免疫調(diào)節(jié)中起到了重要作用[25].Muhammad等[15]的研究中發(fā)現(xiàn)miR-140-3p在ICI患者血液分離出的白色念珠菌中低表達(dá)，這說明miR-140-3p可能參與了ICI的發(fā)生.研究表明真菌細(xì)胞壁中含有大量1-3-β-D葡聚糖成分，1-3-β-D葡聚糖濃度的上升可反應(yīng)ICI病情的嚴(yán)重程度，是診斷ICI的重要手段[26].本研究通過對ICI患者血清中miR-140-3p與1-3-β-D葡聚糖的表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-140-3p在ICI患者中的表達(dá)要遠(yuǎn)低于正常人群，而ICI患者中1-3-β-D葡聚糖表達(dá)遠(yuǎn)高于正常人群.ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)miR-140-3p在診斷ICI中的曲線下面積>0.8，而1-3-β-D葡聚糖在診斷ICI中的曲線下面積<0.8，但是兩者聯(lián)合檢測ICI的曲線下面積為0.924，這說明miR-140-3p低表達(dá)可以提升1-3-β-D葡聚糖在診斷ICI中診斷價(jià)值，提高其靈敏度.提示miR-140-3p可能是ICI的潛在的生物診斷標(biāo)志物.

卡泊芬凈作為抗真菌藥物，通過抑制1-3-β-D葡萄糖合成破壞真菌細(xì)胞壁[27].1-3-β-D葡萄糖作為真菌細(xì)胞壁的抗原成分，在真菌結(jié)構(gòu)完整中起到重要作用，一定程度上可以促進(jìn)宿主體內(nèi)炎癥反應(yīng)發(fā)生[28].研究發(fā)現(xiàn)卡泊芬凈在體外和體內(nèi)對念珠菌表現(xiàn)出極好的活性，它們具有殺滅活性、低耐藥性和更高的安全性[29]，因而其迅速成為治療念珠菌血癥和其他形式的侵襲性念珠菌感染的首選藥物.本研究觀察卡泊芬凈治療后患者血清中miR-140-3p的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)血清中miR-140-3p的表達(dá)明顯上升.早期研究發(fā)現(xiàn)miR-140-3p在PC12細(xì)胞的氧糖剝奪再灌注模型中表達(dá)明顯降低，而通過上調(diào)減輕炎癥的發(fā)生[30]，這說明miR-140-3p可能參與了機(jī)體炎癥反應(yīng).真菌感染會引起患者出現(xiàn)感染性休克，內(nèi)毒素入侵使機(jī)體中炎癥細(xì)胞釋放大量炎癥因子[31].因此推測患者采用卡泊芬凈治療后，念珠菌中1-3-β-D葡萄糖合成受到抑制，細(xì)胞壁受到破壞，導(dǎo)致患者體內(nèi)炎癥減輕，從而使得患者體內(nèi)的miR-140-3p表達(dá)降低.

最后，本研究小組對患者治療后的療效進(jìn)行了評估，根據(jù)臨床療效不同，比較了患者治療前后血清中miR-140-3p表達(dá)與臨床療效的關(guān)系，結(jié)果顯示患者血清中miR-140-3p隨著患者臨床療效的惡化逐漸降低.進(jìn)一步分組比較發(fā)現(xiàn)治療前miR-140-3p表達(dá)水平在預(yù)后良好組中表達(dá)高于預(yù)后一般組.這說明miR-140-3p可能是ICI患者的預(yù)后預(yù)測指標(biāo).為了驗(yàn)證此項(xiàng)推測，我們進(jìn)行了Logistic回歸分析，結(jié)果證明，治療前miR-140-3p，低表達(dá)是影響ICI患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，并通過ROC曲線分析驗(yàn)證其價(jià)值.

綜上所述，本研究初步確定了miR-140-3p在ICI中的診斷與預(yù)后價(jià)值.miR-140-3p在侵襲性念珠菌患者中低表達(dá)，可提升1-3-β-D葡聚糖對ICI的靈敏度，并且與患者預(yù)后密切相關(guān)，有望成為潛在的預(yù)后觀察指標(biāo).但是本研究還存在一定的局限.首先，樣本收集時間較短，患者人數(shù)較少，并且并未對患者進(jìn)行長期的隨訪；其次，關(guān)于卡泊芬凈具體是通過何種機(jī)制調(diào)節(jié)miR-140-3p改善ICI進(jìn)程仍不明確；最后，本研究樣本單一，僅對患者血清中miR-140-3p的表達(dá)進(jìn)行檢測，miR-140-3p在ICI患者外泌體、外周血單個核細(xì)胞是否同樣存在表達(dá)，還需進(jìn)一步驗(yàn)證，望在后續(xù)的研究中開展更多的臨床與基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，來完善研究結(jié)論.

作者貢獻(xiàn)聲明

喬智灝:提出研究思路和框架，實(shí)驗(yàn)操作，撰寫并修改論文；李嘉瑩:指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，指導(dǎo)數(shù)據(jù)分析；劉昶:數(shù)據(jù)收集及分析.

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突.