路 蘊(yùn) ,曹春梅 ,王安寧 ,鄒曉川

(1.重慶化工職業(yè)學(xué)院,長壽 401228;2.重慶第二師范學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院,重慶 400020)

近年來,因大量使用農(nóng)藥而造成的食品安全事件頻發(fā)[1-2]。農(nóng)藥雖然帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)效益,但也造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染[3-4]。研究表明,農(nóng)藥代謝物對人體也有一定的毒性[5-6],并且檢測到農(nóng)藥代謝物的幾率要遠(yuǎn)高于其母體化合物[7-8]。丁氟螨酯作為一種新型殺螨劑,主要用于防治果樹、蔬菜、茶葉等植物的害螨[9],與現(xiàn)有殺蟲劑無交互抗性[10],對葉螨、全葉螨和植食性螨具有很強(qiáng)的殺滅作用,而對非目標(biāo)生物和捕食性螨是安全的[11]。鄰三氟甲基苯甲酸是丁氟螨酯的主要代謝產(chǎn)物,由硫代磷酸酯分解而成,具有一定的毒性,因此日本厚生勞動(dòng)省對農(nóng)產(chǎn)品中丁氟螨酯的限量要求包含其代謝物鄰三氟甲基苯甲酸,需將鄰三氟甲基苯甲酸的測定結(jié)果折算成丁氟螨酯的含量[12]。國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763－2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定丁氟螨酯在水果、蔬菜以及堅(jiān)果中的殘留限量為0.01～5.0 mg·kg－1。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因靈敏度高、選擇性好而被廣泛應(yīng)用于食品中農(nóng)藥殘留的檢測[13-15]。另外,食品中含有大量的色素、生物堿、多酚、親脂物等雜質(zhì),在測定過程中這些雜質(zhì)會(huì)影響儀器的靈敏度,進(jìn)而影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性[16-18],因此如何有效地去除雜質(zhì)并提取目標(biāo)物是樣品前處理的關(guān)鍵。固相萃取法(SPE)具有快速、穩(wěn)定、方便、脂肪去除率高等優(yōu)點(diǎn),是一種高效、靈敏的多殘留分析預(yù)處理技術(shù),常用于去除樣品中的多種雜質(zhì)[19]。文獻(xiàn)[20]報(bào)道以納米材料為基質(zhì)分散固相萃取劑,采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測丁氟螨酯及其代謝物,但所用的納米材料(如碳納米管)價(jià)格昂貴,不適合推廣使用。本工作采用普通石墨化碳黑固相萃取小柱,建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLCMS/MS)測定丁氟螨酯及其代謝物含量的方法,以期為食品安全監(jiān)管提供可靠的技術(shù)參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Priemer型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀;Milli-Q 型超純水器;XH-B 型旋渦混勻器;4001 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;3-30k 型離心機(jī);Organomation N-EVAP 111型氮吹儀;石墨化碳黑固相萃取小柱(0.5 g/6 mL)。

丁氟螨酯、鄰三氟甲基苯甲酸單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:100 mg·L－1,分別稱取0.01 g的丁氟螨酯、鄰三氟甲基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于一組100 mL 容量瓶中,用40%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙腈溶液稀釋至刻度,配制成質(zhì)量濃度為100 mg·L－1的丁氟螨酯、鄰三氟甲基苯甲酸單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,于0～4 ℃保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:分別移取丁氟螨酯、鄰三氟甲基苯甲酸單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各10 mL 于50 mL 容量瓶中,用40%乙腈溶液稀釋至刻度,配制成丁氟螨酯和鄰三氟甲基苯甲酸質(zhì)量濃度均為20 mg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。使用時(shí),用40%乙腈溶液稀釋至所需質(zhì)量濃度。

丁氟螨酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度不小于99.5%,鄰三氟甲基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度不小于98.5%;乙腈、甲醇、丙酮、正己烷、乙酸乙酯、甲酸均為色譜純;鹽酸為優(yōu)級純;乙酸銨、無水硫酸鈉均為分析純;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm);柱溫35℃;流量0.2 mL·min－1;進(jìn)樣量10μL;流動(dòng)相A 為乙腈,B為含0.2%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸的5 mmol·L－1乙酸銨溶液。梯度洗脫程序:0～2.7 min時(shí),A 由40%升至80%;2.7～5.2 min 時(shí),A 由80%升 至100%;5.2～6.0 min時(shí),A 由100%降至40%。

2)質(zhì)譜條件 電噴霧離子(ESI)源,正、負(fù)離子掃描模式(ESI＋、ESI－);多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;毛細(xì)管電壓2.2 kV;離子源溫度110 ℃,脫溶劑氣溫度350 ℃;錐孔氣(氮?dú)?流量50 L·h－1,脫溶劑氣(氮?dú)?流量600 L·h－1,碰撞氣(氬氣)流量0.35 mL·min－1;碰撞室壓力0.53 Pa。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品提取

稱取樣品4 g(茶葉1 g,加適量水浸泡0.5 h以上)置于50 mL具塞離心管中,依次加入90%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙腈溶液10 mL、1 mol·L－1鹽酸溶液1.0 mL、無水硫酸鈉3 g和氯化鈉2 g,用旋渦混勻器振蕩提取2 min,以轉(zhuǎn)速8 000 r·min－1離心3 min,取上層乙腈相(提取液)待凈化。

1.3.2 樣品凈化

將提取液注入經(jīng)5 mL 體積比為2∶3的丙酮-甲醇的混合液活化的石墨化碳黑固相萃取小柱中,立即收集流出液,再用6 mL體積比為2∶3的丙酮-甲醇的混合液洗脫,收集洗脫液,合并流出液和洗脫液,于40 ℃氮吹至近干,用2 mL 40%乙腈溶液溶解殘?jiān)?經(jīng)0.22μm 有機(jī)系微孔濾膜過濾,濾液供UHPLC-MS/MS測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按照儀器工作條件對20μg·L－1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定,所得提取離子色譜圖見圖1。

圖1 提取離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms

2.2 提取條件的優(yōu)化

丁氟螨酯和鄰三氟甲基苯甲酸均能夠溶于甲醇、丙酮、乙腈、乙酸乙酯、正己烷等大部分有機(jī)溶劑,但由于鄰三氟甲基苯甲酸在植物體內(nèi)會(huì)與糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)結(jié)合,形成水溶性的糖配體復(fù)合物[21],因此提取劑須是一種能與水互溶的有機(jī)溶劑。綜合考慮,試驗(yàn)選擇提取劑為90%乙腈溶液。

由于鄰三氟甲基苯甲酸的糖配體復(fù)合物在酸性條件下能夠水解[22],因此在提取過程中需要加入鹽酸。試驗(yàn)考察了不同體積(0.2,0.5,1.0,1.5,2.0 mL)的1 mol·L－1鹽酸溶液對鄰三氟甲基苯甲酸回收率的影響。結(jié)果顯示,鄰三氟甲基苯甲酸的回收率依次為67.0%,75.0%,89.0%,87.0%,90.0%;當(dāng)鹽酸溶液用量1.0 mL 時(shí),鄰三氟甲基苯甲酸可達(dá)到較高的回收率。因此,試驗(yàn)選擇1 mol·L－1鹽酸溶液用量為1.0 mL。

2.3 凈化條件的優(yōu)化

研究表明,石墨化碳黑、弗羅里硅土、C18對去除農(nóng)藥殘留中的雜質(zhì)具有較好的效果[19]。采用固相萃取柱,考察了石墨化碳黑、弗羅里硅土、C18等不同吸附劑對樣品溶液凈化效果的影響。結(jié)果表明,以弗羅里硅土和C18為吸附劑時(shí),目標(biāo)物的回收率在52.0%～75.0%內(nèi);以石墨化碳黑為吸附劑時(shí),丁氟螨酯和鄰三氟甲基苯甲酸的回收率達(dá)75.0%以上,樣品凈化效果較好。

以石墨化碳黑固相萃取小柱(0.5 g/6 mL)為凈化柱,以體積比為2∶3的丙酮-甲醇的混合液為洗脫劑,考察了不同體積(2,4,6,8,10 mL)洗脫劑對丁氟螨酯和鄰三氟甲基苯甲酸回收率的影響,結(jié)果見圖2。由圖2可知,當(dāng)洗脫劑用量為6 mL 時(shí),丁氟螨酯和鄰三氟甲基苯甲酸回收率較高,因此試驗(yàn)選擇洗脫劑用量為6 mL。

圖2 洗脫劑體積對丁氟螨酯和鄰三氟甲基苯甲酸回收率的影響Fig.2 Effect of volume of eluant on recovery of cyflumetofen and o-trifluoromethyl benzoic acid

2.4 色譜條件的優(yōu)化

試驗(yàn)考察了不同流動(dòng)相體系(甲醇-含0.2%甲酸的5 mmol·L－1乙酸銨溶液、乙腈-含0.2%甲酸的5 mmol·L－1乙酸銨溶液)對丁氟螨酯和鄰三氟甲基苯甲酸分離效果的影響。結(jié)果顯示:當(dāng)以甲酸-含0.2%甲酸的5 mmol·L－1乙酸銨溶液體系為流動(dòng)相時(shí),在梯度洗脫程序下,目標(biāo)物無法完全分離;當(dāng)以乙腈-含0.2%甲酸的5 mmol·L－1乙酸銨溶液體系為流動(dòng)相時(shí),在梯度洗脫程序下,丁氟螨酯和鄰三氟甲基苯甲酸均能夠較好的分離,且峰形較好,因此試驗(yàn)選擇流動(dòng)相為乙腈-含0.2% 甲酸的5 mmol·L－1乙酸銨溶液的混合液。

2.5 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用注射泵直接進(jìn)樣的方式,在ESI＋和ESI－電離模式下進(jìn)行一級質(zhì)譜分析。結(jié)果表明,丁氟螨酯在ESI＋電離模式下的母離子豐度較大,鄰三氟甲基苯甲酸在ESI－電離模式下的母離子豐度較大。在確定目標(biāo)物的母離子后,采用子離子掃描方式進(jìn)行二級質(zhì)譜分析,對子離子進(jìn)行優(yōu)化選擇,確定定量離子和輔助定性離子,通過優(yōu)化毛細(xì)管電壓、一級錐孔電壓、二級錐孔電壓、射頻透鏡電壓、碰撞能量、質(zhì)譜分辨率等參數(shù),兩種目標(biāo)物的準(zhǔn)分子離子與特征碎片離子產(chǎn)生的離子對強(qiáng)度達(dá)到最大。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.6 基質(zhì)效應(yīng)

按照試驗(yàn)方法對不同基質(zhì)樣品進(jìn)行提取和凈化,得到相應(yīng)的空白樣品溶液。分別用空白樣品溶液(S1)和40%乙腈溶液(S2)配制50μg·L－1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按儀器工作條件進(jìn)行測定,以兩者峰面積比值來評估基質(zhì)效應(yīng)(ME)[23],結(jié)果見表2。

表2 基質(zhì)效應(yīng)Tab.2 Matrix effect

結(jié)果表明:丁氟螨酯在6種樣品基質(zhì)中均表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)(ME＜100%);鄰三氟甲基苯甲酸在大豆、甘藍(lán)、蘋果、綠茶中表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng),在茄子、西紅柿中表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)(ME ＞100%)。為避免基質(zhì)效應(yīng)的不利影響,試驗(yàn)采用基質(zhì)匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列來繪制工作曲線。

2.7 工作曲線、檢出限和測定下限

分別移取0.5,1.0,2.5,10.0,25.0μL 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,用不同基質(zhì)的空白樣品溶液稀釋至1 mL,配制成丁氟螨酯和鄰三氟甲基苯甲酸質(zhì)量濃度均為10,20,50,200,500μg·L－1的基質(zhì)匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,按照儀器工作條件,對上述基質(zhì)匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測定。以各目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。結(jié)果顯示,丁氟螨酯和鄰三氟甲基苯甲酸的質(zhì)量濃度在10～500μg·L－1內(nèi)與其對應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系,線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表3。

以3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比計(jì)算檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N),結(jié)果見表3。

表3 線性參數(shù)、檢出限和測定下限Tab.3 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.8 精密度和回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對不同陰性樣品進(jìn)行低、中、高等3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)濃度水平平行測定10次(高濃度水平稀釋至線性范圍后測定),計(jì)算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),并將中濃度水平的加標(biāo)樣品分別送至5家檢測單位進(jìn)行測定,計(jì)算測定值的RSD,以驗(yàn)證方法的再現(xiàn)性,結(jié)果見表4。

表4 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of tests for precision and recovery

表4 (續(xù))

結(jié)果顯示,不同陰性樣品中丁氟螨酯和鄰三氟甲基苯甲酸的回收率為78.2%～93.0%,測定值的RSD 為2.8%～14%,再現(xiàn)性RSD 均不大于15%。

本工作建立了UHPLC-MS/MS測定植物源性食品中丁氟螨酯及其代謝物鄰三氟甲基苯甲酸殘留量的方法,該方法準(zhǔn)確度高、精密度好,檢出限和測定下限均小于法律法規(guī)對食品中丁氟螨酯及其代謝物的限量值。