龍瑩瑩,劉 婷,王慶偉,魯 彥,許 旭

(上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,上海 201418)

牛磺酸是成熟視網(wǎng)膜中不可缺少的一種含硫氨基酸[1-3]。?；撬岬窝垡褐饕糜谟膳；撬岽x失調(diào)引起的白內(nèi)障治療,也可用于急性結(jié)膜炎、皰疹性結(jié)膜炎、病毒性結(jié)膜炎的輔助治療。由于滴眼液一般為多劑量包裝,通常需要添加抑菌劑來抑制微生物生長[4],常用的抑菌劑為羥苯酯類化合物,如羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯等?！吨腥A人民共和國藥典》(2015年版)(簡稱ChP 2015)中規(guī)定眼用制劑中可以加入適量的抑菌劑,但是沒有對添加量做具體限度。長時間過量使用抑菌劑,會對眼部帶來上皮細胞損傷、免疫反應(yīng)等安全隱患,因此需要對其含量進行控制。

由于牛磺酸的紫外吸收較弱,ChP 2015中其含量的測定方法為氨基酸分析法和柱后衍生高效液相色譜法,但柱后衍生步驟繁瑣,且衍生反應(yīng)要在聚四氟乙烯反應(yīng)管中進行,對儀器的配置要求較高;除此之外,測定?；撬岬姆椒ㄟ€有高效液相色譜法[4-6]、自動電位滴定法[7]、分光光度法[8]等。另外文獻中報道的滴眼液中抑菌劑的測定方法有高效液相色譜法[9-12]、氣相色譜-質(zhì)譜法[13]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14]等。膠束毛細管電動色譜法可以同時分離分析帶電荷的離子成分與不帶電荷的中性成分,可用于同時測定牛磺酸滴眼液中?；撬岷鸵志鷦┝u苯乙酯的含量。

本工作利用高精度定量毛細管電泳儀,通過優(yōu)化電泳分離、緩沖試劑等條件,建立了膠束毛細管電動色譜法同時測定?；撬岬窝垡褐信；撬岷鸵志鷦┝u苯乙酯含量的方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

qCETM-3010型高精度定量毛細管電泳儀,配紫外檢測器、高壓電源、注射泵、四通手動納升級定量閥進樣器及色譜工作站;TU-1901型紫外-可見分光光度計;Milli-Q 型純水機。

混合標準儲備溶液:稱取適量的?；撬針藴势泛土u苯乙酯標準品,置于10 mL 容量瓶中,加入適量甲醇溶解,再用水稀釋至刻度,經(jīng)0.22μm 微孔濾膜過濾,配制成牛磺酸質(zhì)量濃度為50 g·L－1、羥苯乙酯質(zhì)量濃度為1 g·L－1的混合標準儲備溶液。使用時,用水稀釋5倍左右,需要時可加入適量硫脲(電滲流標志物)。

硼砂-硼酸緩沖液(pH 9.0):稱取適量的十水合四硼酸鈉和硼酸,用水溶解并定容至100 mL,配制成硼酸鹽濃度為15 mmol·L－1的硼砂-硼酸緩沖液(pH 9.0)。

含20 mmol·L－1十二烷基硫酸鈉(SDS)的硼砂-硼酸緩沖液(pH 9.0)的混合液:稱取適量的SDS標準品,用硼砂-硼酸緩沖液(pH 9.0)溶解,配制成含20 mmol·L－1SDS 的硼砂-硼酸緩沖液(pH 9.0)的混合液。

?；撬針藴势返馁|(zhì)量分數(shù)為99%,羥苯乙酯標準品的質(zhì)量分數(shù)為99%,SDS標準品的質(zhì)量分數(shù)為99%;乙腈、甲醇均為色譜純;十水合四硼酸鈉、硼酸、硫脲均為分析純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

帶隔離槽的石英毛細管柱(內(nèi)徑75μm,總長度65 cm,有效長度45 cm);緩沖液為含20 mmol·L－1SDS的硼砂-硼酸緩沖液(pH 9.0)的混合液;分離電壓－15 kV;檢測波長210 nm;進樣量10 nL。

使用新的毛細管柱之前,先用甲醇、0.1 mol·L－1氫氧化鈉溶液、水、0.1 mol·L－1鹽酸溶液等淋洗液依次沖洗毛細管柱各5 min,每次換淋洗液前需要用水進行過渡;活化結(jié)束后,再用緩沖液平衡毛細管柱10 min。

1.3 試驗方法

移取?；撬岬窝垡簶悠?.0 mL,加水定容至10 mL容量瓶中,超聲混勻,經(jīng)0.22μm 微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,得到待測樣品溶液。

儀器開機后依次用0.1 mol·L－1氫氧化鈉溶液、水、緩沖液沖洗毛細管柱,以保證系統(tǒng)的重復(fù)性和穩(wěn)定性,再按照儀器工作條件進樣分析,兩次進樣之間用緩沖液沖洗毛細管柱。測定結(jié)束后,用10%(體積分數(shù))甲醇溶液對毛細管柱進行清洗。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜分離行為

按照儀器工作條件對混合標準溶液、樣品溶液和空白溶液進行測定,所得電泳圖見圖1。

圖1 電泳圖Fig.1 Electrophoretogram

結(jié)果顯示,在該電泳條件下,各組分均能達到基線分離,且與電滲流分離效果良好。其中硫脲是一種不電離且不易進入膠束的中性物質(zhì),可作為電滲流標志物直觀地表征電滲流的出峰位置,通過考察硫脲與待測組分的分離情況,有助于避免可能存在的中性雜質(zhì)的干擾。

2.2 檢測波長的選擇

牛磺酸和羥苯乙酯在波長190～300 nm 內(nèi)的紫外-可見吸收光譜圖見圖2。

圖2 紫外-可見吸收光譜圖Fig.2 UV-Vis absorption spectrum

結(jié)果顯示:羥苯乙酯在210,254 nm 處均有紫外吸收;而?；撬岬淖贤馕蛰^弱,僅在200 nm 附近存在末端吸收。為保證?；撬岷土u苯乙酯均有較好的信噪比,試驗選擇檢測波長為210 nm。

2.3 緩沖液體系的選擇

試驗考察了磷酸鹽緩沖液體系和硼砂緩沖液體系(硼砂、硼砂-硼酸、硼砂-SDS、硼砂-硼酸-SDS)對硫脲、牛磺酸和羥苯乙酯分離效果的影響。

結(jié)果顯示:含有硼砂的緩沖液更適用于硫脲、牛磺酸和羥苯乙酯的分離,且基線穩(wěn)定,但單獨的硼砂體系中?；撬岷土u苯乙酯的分離度難以達到要求;而當以硼砂-硼酸-SDS為緩沖液體系時,硫脲、牛磺酸和羥苯乙酯之間的分離度均能達到要求。因此,試驗選擇以硼砂-硼酸-SDS為緩沖液體系。

2.4 緩沖液濃度的選擇

試驗考察了硼砂-硼酸緩沖液中硼酸鹽濃度分別為10,15,20,25 mmol·L－1時對硫脲、?；撬?、羥苯乙酯遷移時間和分離度的影響,結(jié)果見圖3。

圖3 緩沖液濃度對硫脲、?；撬帷⒘u苯乙酯遷移時間和分離度的影響Fig.3 Effect of concentration of buffer on migration time and resolution of thiourea,taurine and ethylparaben

結(jié)果表明:隨著緩沖液濃度的增大,硫脲與?；撬岬姆蛛x度越來越好,而牛磺酸與羥苯乙酯的分離度呈下降趨勢,原因可能是當緩沖液濃度較高時,電流增大,引起焦耳熱增加而降低柱效、增大基線噪聲;當緩沖液濃度為15 mmol·L－1時,各待測組分的分離度、基線和峰形均能滿足測定要求。因此,試驗選擇緩沖液濃度為15 mmol·L－1。

2.5 緩沖液酸度的選擇

試驗考察了緩沖液酸度(pH 分別為8.4,8.7,9.0,9.3)對硫脲、?；撬?、羥苯乙酯的遷移時間和分離度的影響,結(jié)果見圖4。

圖4 緩沖液酸度對硫脲、?；撬帷⒘u苯乙酯遷移時間和分離度的影響Fig.4 Effect of acidity of buffer on migration time and resolution of thiourea,taurine and ethylparaben

結(jié)果表明:隨著緩沖液pH的增大,硫脲與?；撬岬姆蛛x度逐漸增大,而?；撬崤c羥苯乙酯的分離度逐漸下降;并且在試驗過程中發(fā)現(xiàn),當緩沖液pH較低時,牛磺酸的峰形不對稱,有明顯的拖尾現(xiàn)象,柱效較低;當緩沖液pH 較高時,電流大,焦耳熱現(xiàn)象明顯;當緩沖液pH 為9.0時,硫脲、?；撬帷⒘u苯乙酯之間的分離度較好,峰形較好,且基線平穩(wěn)。因此,試驗選擇緩沖液pH 為9.0。

2.6 SDS濃度的選擇

試驗考察了含有不同濃度(10,20,30,40 mmol·L－1)SDS的硼砂-硼酸緩沖液(pH 9.0)對硫脲、?；撬帷⒘u苯乙酯遷移時間和分離度的影響,結(jié)果見圖5。

圖5 SDS濃度對硫脲、?；撬?、羥苯乙酯遷移時間和分離度的影響Fig.5 Effect of concentration of SDS on migration time and resolution of thiourea,taurine and ethylparaben

結(jié)果顯示:當SDS濃度較低時,硫脲與牛磺酸的分離度較好,但?；撬崤c羥苯乙酯的分離度較低;隨著SDS濃度的增加,牛磺酸與羥苯乙酯的分離度逐漸增大,但較高濃度的SDS 會使電流增大;當SDS濃度為20 mmol·L－1時,硫脲、牛磺酸、羥苯乙酯之間的分離效果較好,分析時間和電流大小合適。因此,試驗選擇SDS的濃度為20 mmol·L－1。

2.7 分離電壓的選擇

試驗考察了分離電壓為－8,－12,－15,－18 kV 時對硫脲、?；撬?、羥苯乙酯的遷移時間和分離度的影響,結(jié)果見圖6。

圖6 分離電壓對硫脲、?；撬?、羥苯乙酯遷移時間和分離度的影響Fig.6 Effect of separation voltage on migration time and resolution of thiourea,taurine and ethylparaben

結(jié)果表明:當分離電壓絕對值較低時,硫脲、?；撬?、羥苯乙酯之間分離度較小,分析時間較長;當分離電壓絕對值較高時,電流較大,產(chǎn)生的焦耳熱影響柱效,且基線不穩(wěn),影響測定結(jié)果的精密度。綜合考慮,試驗選擇分離電壓為－15 kV。

2.8 標準曲線、檢出限和測定下限

配制牛磺酸質(zhì)量濃度為5.02,7.46,10.90,15.80,31.60,40.80 g·L－1,羥苯乙酯質(zhì)量濃度為50,100,167,200,250,333 mg·L－1的標準溶液系列。按照儀器工作條件對上述標準溶液系列進行測定,以各目標物的質(zhì)量濃度為橫坐標,其對應(yīng)的峰面積為縱坐標繪制標準曲線,線性參數(shù)見表1。

對標準溶液進行稀釋,以信噪比(S/N)為3時的質(zhì)量濃度作為檢出限,以信噪比(S/N)為10時的質(zhì)量濃度作為測定下限,結(jié)果見表1。

表1 線性參數(shù)、檢出限和測定下限Tab.1 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.9 精密度試驗

按照儀器工作條件對混合標準溶液連續(xù)測定6次,計算各目標物遷移時間和峰面積的相對標準偏差(RSD),以考查方法的日內(nèi)精密度。結(jié)果顯示,牛磺酸和羥苯乙酯遷移時間的RSD 分別為0.30%,0.30%,峰面積的RSD分別為1.5%,1.7%,表明本方法有較好的精密度。

按照儀器工作條件對同一溶液連續(xù)測定6 d,計算各目標物遷移時間和峰面積的RSD,以考查方法的日間精密度。結(jié)果顯示,6 d內(nèi),?；撬岷土u苯乙酯遷移時間的RSD 分別為1.2%,1.6%,峰面積的RSD 分別為3.5%,3.6%。

本工作在高精度定量毛細管電泳儀上配置納升級定量閥進樣器,改善了進樣體積精度,配合使用毛細管溫控系統(tǒng),峰面積重復(fù)性RSD 通常小于2.0%[15-17],與普通的毛細管電泳儀(RSD 約3.0%或更大)相比,顯著改善了定量的重復(fù)性。

2.10 回收試驗

按照試驗方法對實際牛磺酸滴眼液樣品進行加標回收試驗,每個濃度水平制備3個平行樣(?；撬嵬ㄟ^稱重加標,羥苯乙酯通過標準溶液加標),計算回收率,結(jié)果見表2。

表2 回收試驗結(jié)果Tab.2 Results of test for recovery

2.11 樣品分析

按照試驗方法對某制藥廠生產(chǎn)的不同批次的?；撬岬窝垡??；撬針耸玖繛?0 g·L－1,羥苯乙酯標示量為0.25 g·L－1)進行測定,每個樣品平行測定3次,結(jié)果見表3。

表3 樣品分析結(jié)果Tab.3 Analytical results of samples

本工作采用高精度定量毛細管電泳儀,建立了膠束毛細管電動色譜法同時測定?；撬岬窝垡褐信；撬岷土u苯乙酯含量的方法。該方法操作簡單、分離效果好、精密度高,可用于?；撬岬窝垡簶悠分信；撬岷土u苯乙酯的同時測定。