徐德峰，吳嘉鑫，孫力軍，秦小明，范秀萍

急冷與空氣暴露聯(lián)合脅迫對凡納濱對蝦生理代謝影響

徐德峰，吳嘉鑫，孫力軍，秦小明，范秀萍

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院 // 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室 // 廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524088; 大連工業(yè)大學(xué)海洋食品精深加工協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034）

【目的】探明無水?；盍魍ㄟ^程中凡納濱對蝦（）響應(yīng)急冷（acute cold，AC）與空氣暴露（waterless duration，WD）聯(lián)合脅迫的生理代謝調(diào)節(jié)規(guī)律?！痉椒ā垦芯磕M產(chǎn)業(yè)運輸實際，分析聯(lián)合脅迫（AC+WD）進程中凡納濱對蝦血液和肝胰腺典型生化指標(biāo)，以及肝胰腺組織病理變化。【結(jié)果】AC脅迫后，凡納濱對蝦生理應(yīng)激指標(biāo)血清皮質(zhì)醇含量由正常組（normal control，NC）的（326.90±4.61）pg/mL顯著增加到AC組的（427.16±7.92）pg/mL（< 0.05），AC+WD組則隨時間延長而逐漸降低。血清葡萄糖含量在聯(lián)合脅迫6 h后達到最大值（26.31±1.05）mg/dL，乳酸在9 h達到峰值（7.90±0.11）mmol/L。AC及AC+WD組中血藍蛋白、尿素氮和肌酐含量較NC組均發(fā)生不同程度的增加，而總蛋白含量先升后降，總膽固醇和甘油三酯含量呈脅迫時間依賴性下降。血清谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、酸性和堿性磷酸酶活力呈上升趨勢，并在9 h達到峰值。以上生化指標(biāo)在脅迫復(fù)蘇組有所恢復(fù)，表明AC+WD雙重脅迫引起凡納濱對蝦物質(zhì)代謝紊亂，復(fù)蘇后機體生理應(yīng)激和代謝系統(tǒng)發(fā)生一系列代償性調(diào)節(jié)，且脅迫進程中肝胰腺組織病理損傷特征進一步解釋了凡納濱對蝦響應(yīng)環(huán)境聯(lián)合脅迫的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)?！窘Y(jié)論】無水保活流通過程中雙重脅迫時間依賴性改變凡納濱對蝦生理應(yīng)激水平和物質(zhì)代謝，在9 h時可明顯造成肝胰腺組織結(jié)構(gòu)損傷，進而影響機體存活。

凡納濱對蝦；無水?；盍魍ǎ簧響?yīng)激；代謝響應(yīng)；肝胰腺

水產(chǎn)品無水?；盍魍ㄟ\載量大，結(jié)合航空運輸可實現(xiàn)快速長途運輸，綜合成本較低，近年來得到了快速發(fā)展[1,2]。凡納濱對蝦（）是世界養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大優(yōu)良蝦種之一，對外界環(huán)境刺激極其敏感，保活流通過程中環(huán)境脅迫對其造成的應(yīng)激性傷殘時常發(fā)生，綜合運輸成本偏高。通常機體應(yīng)激水平與血液生理生化指標(biāo)密切相關(guān)，動物的生理病理變化可引起血液成分發(fā)生改變，因此檢測凡納濱對蝦無水保活流通過程中血液生化指標(biāo)可間接反映機體響應(yīng)環(huán)境脅迫的生理調(diào)節(jié)規(guī)律，為改善保活流通條件提供理論依據(jù)。

受環(huán)境脅迫時，機體血液生理生化指標(biāo)波動是反映體內(nèi)代謝失衡的重要特征，與動物存活質(zhì)量密切相關(guān)。Selye[3]研究表明，當(dāng)動物受到不良環(huán)境脅迫時，其生理變化會在血液指標(biāo)中體現(xiàn)出來。雖然蝦類有水?；钸^程中血液生化指標(biāo)的變化特征目前已有相關(guān)報道[4]，且徐子涵[5]模擬凡納濱對蝦無水?；钸\輸，探究了蝦在無水低溫脅迫環(huán)境中發(fā)生的氧化應(yīng)激和抗氧化反應(yīng)、免疫反應(yīng)、糖代謝及相關(guān)神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)，并設(shè)計了無水?；钸\輸技術(shù)裝置，但其過程中蛋白質(zhì)、脂質(zhì)代謝規(guī)律尚不清楚，且反應(yīng)臟器損傷程度的相關(guān)生化指標(biāo)也有待進一步闡明。脅迫環(huán)境下，為維持正常生理狀態(tài)，水產(chǎn)動物會從神經(jīng)內(nèi)分泌、生理生化、免疫調(diào)節(jié)等層面進行協(xié)同調(diào)節(jié)以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[6]，其中生理應(yīng)激與代謝調(diào)節(jié)是經(jīng)典途徑。目前從物質(zhì)和能量代謝途徑解析長時間低溫?zé)o水?；盍魍▽Υ罂诤邝|（）[7]、蝦夷扇貝（）[8]、縊蟶（）[9]等水產(chǎn)動物影響的研究已有相關(guān)報道，廣溫性魚類在低溫環(huán)境中可調(diào)節(jié)生理應(yīng)激和代謝途徑相關(guān)酶活力，從而使代謝和生理功能逐漸適應(yīng)環(huán)境變化[10, 11]。整體而言，凡納濱對蝦無水保活流通過程中急冷（acute cold exposure，AC）及空氣暴露（waterless duration，WD）聯(lián)合脅迫（AC+WD）誘導(dǎo)的生理應(yīng)激及代謝相關(guān)途徑變化研究報道鮮見，機體響應(yīng)雙重環(huán)境脅迫的生理應(yīng)激和代謝調(diào)節(jié)規(guī)律亟待揭示。因此，本研究通過模擬無水?；盍魍ㄟ\輸環(huán)境，評價AC+WD對凡納濱對蝦血液生化指標(biāo)的影響，分析肝胰腺組織響應(yīng)聯(lián)合脅迫的特征性病理變化，探明生理應(yīng)激、代謝響應(yīng)和組織損傷相關(guān)參數(shù)變化的內(nèi)在聯(lián)系，揭示無水?；盍魍ㄟ^程中凡納濱對蝦響應(yīng)急冷聯(lián)合無水暴露雙重脅迫的生理應(yīng)激與代謝調(diào)節(jié)規(guī)律，以期為后續(xù)存活質(zhì)量預(yù)測和改善?；盍魍l件提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

約300尾體質(zhì)量（16.23±1.12）g、體長（7.36±0.42）cm的凡納濱對蝦購自廣東省湛江市霞山水產(chǎn)品批發(fā)市場。用空氣壓縮泵充分打入壓縮空氣后將對蝦于2 h內(nèi)運送至廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院?；盍魍▽嶒炇?，新鮮海水適應(yīng)性暫養(yǎng)6 h（溫度25 ℃，鹽度35），暫養(yǎng)期間不投放餌料，氧泵連續(xù)供氧，挑選無明顯傷殘、大小基本一致、活動正常、狀態(tài)良好的180尾對蝦進行分組實驗。

氯化鈉、葡萄糖、檸檬酸三鈉、檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉等均為分析純，購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；皮質(zhì)醇測定試劑盒（貨號MM-9000501）購于江蘇酶免實業(yè)有限公司；葡萄糖測定試劑盒（貨號F006-1-1）購于上海榮盛生物藥業(yè)有限公司；總蛋白測定試劑盒（貨號BC3185）購于上海索萊寶生物科技有限公司；乳酸測定試劑盒（貨號A084-2-1）、甘油三酯測定試劑盒（貨號A110-1-1）、總膽固醇測定試劑盒（貨號A111-1-1）、尿素氮測定試劑盒（貨號C013-1-1）、肌酐測定試劑盒（貨號C011-1-1）、酸性磷酸酶測定試劑盒（批號A060-2-1）、堿性磷酸酶測定試劑盒（批號A059-2-2）、谷草轉(zhuǎn)氨酶測定試劑盒（貨號C010-2-1）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶測定試劑盒（貨號C009-2-1）均購于南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

HX-1508低溫冷卻循環(huán)泵，江蘇天翔儀器有限公司；S-20氧泵，中國浙江寧波塞爾電氣公司；25 cm ×20 cm塑料自封袋，天津永業(yè)塑料制品有限公司；PYX-CXG250電腦恒溫層析柜，四川科力儀器技術(shù)有限公司；5810R臺式高速冷凍離心機，德國艾本德有限公司；Varioskan全自動酶標(biāo)儀，塞默飛世爾科技中國有限公司；

1.3 方法

1.3.1 凡納濱對蝦分組與實驗設(shè)計 本實驗以正常對照組（Normal control，NC）和急冷休眠組（Acute cold，AC）為對照，考察AC+WD對血液主要生化指標(biāo)的影響。根據(jù)目前凡納濱對蝦?；盍魍▽嶋H，參照本團隊前期實驗方法[12]，取暫養(yǎng)后的30尾凡納濱對蝦放于裝有30 L自然海水中的塑料周轉(zhuǎn)筐中（490 mm ×345 mm ×285 mm），室溫25 ℃下放置，設(shè)為NC組。脅迫組采用低溫冷卻循環(huán)泵將海水溫度降至12 ℃，然后將暫養(yǎng)后的凡納濱對蝦轉(zhuǎn)移到該冷水進行急性低溫誘導(dǎo)休眠，觀察其活動狀態(tài)，待對蝦對外界刺激反應(yīng)微弱時，隨機選取其中30尾放于裝有30 L自然海水并冷卻至12 ℃的塑料周轉(zhuǎn)筐（490 mm × 345 mm × 285 mm）中，實驗期間一直存放于此環(huán)境，設(shè)為AC組。其余急冷脅迫休眠后的凡納濱對蝦隨機放入塑料自封袋中并充氧密封（氧氣體積分?jǐn)?shù)95%），每袋10尾，每組3袋，共4組，然后參照Xu等[13]方法將對蝦儲存在12 ℃的層析柜中，模擬水產(chǎn)品無水?；钸\輸環(huán)境作為AC+WD組，取雙重脅迫開始3、6、9 h，以及9 h后放入自然水（水溫25 ℃）復(fù)蘇2 h的對蝦樣品，分別記為AC+WD(3 h)、AC+WD(6 h)、AC+WD(9 h)、AC+WD(9 h)+R組。筆者前期預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，NC組在12 h的實驗期間內(nèi)其行為正常，且生化指標(biāo)基本無變化；而AC組在12 ℃的海水中30 min即可進入完全休眠狀態(tài)，之后可能是代謝速率顯著下降，各生化指標(biāo)也保持基本一致。因而在滿足代表性的前提下為減少實驗數(shù)量，NC和AC組僅在30 min時取樣，而AC+WD組結(jié)合表觀和皮質(zhì)醇含量變化則分別在3、6、9 h，以及復(fù)蘇2 h后取血淋巴和肝胰腺組織，檢測相關(guān)生化指標(biāo)，并行肝胰腺常規(guī)組織化學(xué)分析，綜合闡明凡納濱對蝦響應(yīng)AC+WD的生理應(yīng)激與代謝調(diào)節(jié)。

1.3.2 樣品采集 參照文獻[14]預(yù)先配制無菌抗凝劑（140 mmol/L氯化鈉，100 mmol/L葡萄糖，30 mmol/L檸檬酸三鈉，26 mmol/L檸檬酸，10 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉，pH 4.6），用1 mL一次性無菌注射器預(yù)先吸取0.2 mL上述抗凝劑，再按照血液與抗凝劑體積比1∶1從凡納濱對蝦圍心腔內(nèi)抽取血淋巴，將同一處理組對蝦血液進行合并（約0.2 mL），放入1.5 mL離心管，4 ℃冰箱中低溫靜置2 h，迅速經(jīng)3 000 r/min、4 ℃離心10 min，得上清液，液氮速凍后分裝保存于-80 ℃用于各生化指標(biāo)測定。通常血淋巴只在存活對蝦體內(nèi)才能抽取，如實驗期間對蝦個體死亡則血淋巴因凝血而無法抽取，因此本實驗血清各指標(biāo)測定均取自存活個體。

1.3.3 生化指標(biāo)測定 皮質(zhì)醇、葡萄糖、總蛋白、乳酸、甘油三酯、總膽固醇、尿素氮、肌酐含量，酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力的測定均嚴(yán)格按照相關(guān)試劑盒說明書進行。血藍蛋白含量測定參照潘魯青等[15]方法稍作修改。取血液樣品10 μL與990 μL磷酸鹽緩沖液（PBS，pH = 7.0）混勻，充分震蕩，避免產(chǎn)生氣泡，在波長334 nm處測量光密度值，以PBS為對照。血藍蛋白質(zhì)量濃度（mg/mL）= 2.30 ×(334 nm) × 100。

1.3.4 肝胰腺組織結(jié)構(gòu)分析 按照本團隊前期實驗方法[16]，對各組對蝦肝胰腺組織進行石蠟組織切片化學(xué)制樣和結(jié)構(gòu)觀察。

1.4 統(tǒng)計分析

實驗設(shè)計3個平行組，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0軟件進行差異分析，顯著性水平= 0.05。采用Origin Pro 8.5軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 AC+WD對凡納濱對蝦行為及生理應(yīng)激影響

由圖1(A)可以明顯看出，NC組對蝦呼吸正常，自由游動；AC組對蝦側(cè)倒，游泳足擺動無規(guī)律，而后進入休眠狀態(tài)，機械刺激無反應(yīng)；而AC+WD組表現(xiàn)出更弱的行為反應(yīng)；AC+WD(9 h)+R組對蝦身體重新正立，恢復(fù)平衡性。

由圖1(B)可以看出，AC組對蝦血液中皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度為（427.16±7.92）pg/mL，相比NC組的（326.90±4.61）pg/mL顯著升高（< 0.05），提示AC脅迫對凡納濱對蝦產(chǎn)生了強烈的環(huán)境應(yīng)激。在AC+WD組隨脅迫時間的延長，皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度呈下降趨勢，復(fù)蘇后進一步下降至（356.45±3.56）pg/mL，表明生理應(yīng)激在復(fù)蘇后有明顯降低。

凡含一個相同字母，表示差異不具統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）

2.2 AC+WD對凡納濱對蝦糖、脂類底物代謝水平的影響

葡萄糖和乳酸是反映機體糖代謝速率的重要指標(biāo)。本研究中，凡納濱對蝦血清葡萄糖的質(zhì)量濃度在AC和AC+WD脅迫后逐漸升高，至AC+WD(6 h)組達到峰值（26.31±1.05）mg/dL，與NC組的（20.38±0.95）mg/dL相比差異顯著（< 0.05）；AC+WD9 h組有所下降，AC+WD(9 h)+R組進一步下降至（23.92±0.60）mg/dL，但未能恢復(fù)至NC組水平（圖2(A)）。此外，AC組與AC+WD(3 h)組之間血清乳酸水平變化不大（圖2(B)），而AC+WD(3 h)組乳酸濃度較NC組顯著增加，且在AC+WD(9 h)組達到最大值（7.90±0.11）mmol/L，復(fù)蘇后雖有所下降但仍顯著高于NC組（< 0.05），提示在?；詈笃诩?xì)胞以無氧呼吸為主。

除了糖代謝有顯著改變外，血液中脂類物質(zhì)代謝也經(jīng)歷了明顯改變。由圖2(C-D)可以看出，AC脅迫處理后總膽固醇和甘油三酯均較NC組略微下降，且隨AC+WD脅迫時間的延長而進一步下降?？偰懝檀紳舛仍贏C+WD(6 h)組較NC組顯著降低（< 0.05），而甘油三酯濃度在AC+WD(3 h)組就顯著下降（< 0.05）。之后兩者均小幅下降，且在AC+WD(9 h)組達到最小值，分別為（8.51±0.30）mmol/L和（1.78±0.08）mmol/L，復(fù)蘇后有所上升，但無法恢復(fù)至NC組水平。

凡含一個相同字母，表示差異不具統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）

2.3 AC+WD對凡納濱對蝦蛋白質(zhì)代謝和氧運輸能力的影響

無水?；钸^程中凡納濱對蝦血液總蛋白含量變化由圖3(A)所示，與NC組相比，血液總蛋白質(zhì)量濃度在經(jīng)歷單獨AC或AC+WD脅迫時均顯著增加（< 0.05），且AC+WD(3 h)組達到最大值（11.96±0.21）g/dL，隨后在AC+WD(6 h)和AC+WD(9 h)組進一步下降，但在AC+WD(9 h)+R復(fù)蘇又略微上升。血藍蛋白質(zhì)量濃度在AC組變化不大，聯(lián)合脅迫后隨時間的延長逐漸升高，AC+WD(9 h)組達到最大值（30.59±1.16）mg/mL，與NC組（19.59±0.84）mg/mL相比差異顯著（< 0.05）（圖3(B)）。血藍蛋白是氧運輸主要蛋白，結(jié)合上述血液乳酸含量的變化規(guī)律，可以推測，凡納濱對蝦在應(yīng)對雙重環(huán)境脅迫后期供能方式發(fā)生顯著改變。

另外，血液中尿素氮和肌酐濃度是反映腎臟功能的重要標(biāo)志物。由圖3(C)可以看出，AC組尿素氮濃度達到（19.61±0.22）mmol/L，相比NC組的（9.45±0.62）mmol/L顯著增加（< 0.05），在隨后的AC+WD脅迫過程中呈時間依賴性增加，AC+WD(9 h)組達到最大值（19.61±0.22）mmol/L，復(fù)蘇后（AC+WD(9 h)+R組）雖有所恢復(fù)但仍舊顯著高于NC組水平（< 0.05），上述改變可能是因為急冷脅迫刺激皮質(zhì)醇的大量釋放，進而帶動尿素氮的釋放，復(fù)蘇后隨著皮質(zhì)醇濃度降低而逐漸恢復(fù)到正常水平。同時，與NC組相比，血液中肌酐含量在經(jīng)歷AC和AC+WD脅迫后均顯著增加（圖3(D)，< 0.05），復(fù)蘇后雖有所下降，但無法恢復(fù)至對照組水平，這可能與腎臟濾過功能受損有關(guān)。

2.4 AC+WD對凡納濱對蝦肝胰腺代謝功能酶活力的影響

由圖4(A、B)可知，AC+WD脅迫過程中，凡納濱對蝦肝胰腺谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力整體呈現(xiàn)上升趨勢。AC脅迫后谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力開始上升，AC+WD(3 h)組活力顯著高于NC組（< 0.05），AC+WD(9 h)組谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力達到峰值，分別為（6.11±0.32）和（6.19±0.24）U/L，提示凡納濱對蝦在AC+WD脅迫下肝臟損傷逐漸加重；復(fù)蘇后二者分別顯著下降至（4.05±0.19）和（3.84±0.21）U/L，但仍顯著高于NC組（1.61±0.19）和（1.48±0.27）U/L（< 0.05），說明水產(chǎn)動物在應(yīng)答強烈環(huán)境脅迫時會伴隨重要臟器的不同程度結(jié)構(gòu)損傷。另外，酸性磷酸酶和堿性磷酸酶均是通過肝臟向外表達的酶類，直接參與磷酸基團的代謝，同時與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA等代謝相關(guān)[17]。由圖4(C、D)可知，與NC組相比，AC組凡納濱對蝦酸性磷酸酶活力有所下降，而堿性磷酸酶活力略微上升；AC+WD脅迫后酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活力均基本呈時間依賴性增加，且AC+WD(9 h)組二者達到最大值，分別為（9.14±1.24）和（17.07±0.21）U/100 mL；復(fù)蘇后兩者基本恢復(fù)至NC組水平，可能是因為脅迫環(huán)境下凡納濱對蝦提高代謝速率，調(diào)節(jié)自身免疫能力以抵抗不良環(huán)境脅迫，維持生命活動正常進行。

凡含一個相同字母，表示差異不具統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）

2.5 AC+WD對凡納濱對蝦肝胰腺組織結(jié)構(gòu)的影響

甲殼動物肝胰腺中通常含分泌細(xì)胞（B細(xì)胞）、吸收細(xì)胞（F細(xì)胞）、儲存細(xì)胞（R細(xì)胞）和胚細(xì)胞（E細(xì)胞)，環(huán)境變化會對B、R細(xì)胞的比例造成影響。從圖5可知，NC組細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常且分布均勻；AC脅迫時轉(zhuǎn)運泡體積減小，基膜收縮；AC+WD聯(lián)合脅迫3 h時轉(zhuǎn)運泡體積變小，空泡數(shù)量相較NC組明顯增加，B細(xì)胞數(shù)量減少，肝小管變形；AC+WD聯(lián)合脅迫6 h時管腔變形嚴(yán)重，空泡數(shù)量明顯減少，體積變大，R細(xì)胞數(shù)量減少；AC+WD聯(lián)合脅迫9 h時管腔中可看到破碎的細(xì)胞組織，轉(zhuǎn)運泡體積變大導(dǎo)致管腔被明顯擠壓變形；AC+WD聯(lián)合脅迫9 h后復(fù)蘇組中肝小管破裂，空泡數(shù)量明顯減少，管腔和肝小管組織間隙的細(xì)胞破碎得到明顯改善。說明凡納濱對蝦在應(yīng)答AC+WD聯(lián)合脅迫時，肝胰腺組織結(jié)構(gòu)受到一定程度的損傷，與上述酶活力變化一致，指明了物質(zhì)代謝變化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

凡含一個相同字母，表示差異不具統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）

B，B細(xì)胞B-cells；L，管腔Lumen；R，儲存細(xì)胞Restore-cells；TV，轉(zhuǎn)運泡Transport vesicle；BM，基膜Basement membrane

3 討論

動物受不良環(huán)境脅迫時，首先進行由神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)介導(dǎo)的初級反應(yīng)，促使皮質(zhì)醇的合成與釋放，實現(xiàn)機體的自我保護[18]。本研究中，凡納濱對蝦在單獨AC脅迫后血清皮質(zhì)醇含量迅速增加，在隨后的AC+WD脅迫過程中逐漸下降，但均高于NC組（圖1(B)），推測是在急性低溫脅迫時，生存溫度的驟變對機體產(chǎn)生強烈應(yīng)激，使得皮質(zhì)醇含量迅速升高。另外，皮質(zhì)醇作為一種應(yīng)激激素，同時具有調(diào)節(jié)糖、脂肪生物合成的作用[19,20]。本研究發(fā)現(xiàn)，AC+WD脅迫下機體血糖含量有所增加，很可能是因為皮質(zhì)醇的釋放調(diào)節(jié)了體內(nèi)糖代謝速率所致，且皮質(zhì)醇具有對抗胰島素的作用，可抑制外周組織對葡萄糖的利用，從而使血糖升高，出現(xiàn)高血糖癥。另外，葡萄糖含量在AC+WD(6 h)組內(nèi)增加，后期略微下降，而乳酸含量在雙重脅迫前期變化不大，6 h后顯著增加（圖2(A、B)），提示凡納濱對蝦在無水保活后期有氧代謝減弱，而無氧代謝相對增強。梁敏等[21]發(fā)現(xiàn)將凡納濱對蝦用CO2麻醉后進行低溫?zé)o水運輸，血清乳酸含量隨運輸時間延長而隨之積累，其結(jié)果與本研究相符，證實乳酸含量是機體應(yīng)答環(huán)境脅迫的敏感指標(biāo)。膽固醇是類固醇激素合成的重要原料，甘油三酯是機體儲存及氧化供能的重要形式[22]，本研究中凡納濱對蝦在AC+WD雙重脅迫下，總膽固醇和甘油三酯含量均有不同程度的下降（圖2(C、D)）。常玉梅等[23]發(fā)現(xiàn)，低溫會使鯉（）肝臟受損，總膽固醇和甘油三酯無法通過腸肝循環(huán)途徑進入肝臟被重吸收，致使血液總膽固醇和甘油三酯含量升高，這與本研究結(jié)果基本一致，推測是在低溫環(huán)境下，為維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)的相對恒定，水產(chǎn)動物通過啟動代謝補償途徑以加強自身產(chǎn)能來適應(yīng)不良環(huán)境脅迫。

本研究發(fā)現(xiàn)，AC+WD脅迫進程中凡納濱對蝦血液總蛋白含量呈先升后降（圖3(A)），與冀德偉等[24]對大黃魚（）響應(yīng)8.5 ℃低溫脅迫血液生化變化規(guī)律一致。同時，尿素氮和肌酐含量在AC及AC+WD脅迫組中均高于NC組，且呈時間依賴性上升（圖3(C、D)），提示雙重脅迫對肝腎功能損傷較大。黃建盛等[25]發(fā)現(xiàn)急性低氧脅迫下，軍曹魚（）幼魚血液總蛋白含量比脅迫前略有降低，而肌酐含量上升，這些研究結(jié)果均說明，環(huán)境脅迫影響水產(chǎn)動物物質(zhì)代謝，并對腎組織造成一定的損傷，使其機能出現(xiàn)紊亂。同時，本研究中AC+WD脅迫過程中血漿谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力有所上升而復(fù)蘇后則明顯下降（圖4(A、B)），可能是因為急冷脅迫使得凡納濱對蝦肝胰腺組織受損，細(xì)胞膜通透性增加，使肝胰腺中的谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶外流至血液中，這與CO2麻醉低溫?；钸\輸羅氏沼蝦（）血液生化指標(biāo)變化結(jié)果一致[26]。酸性和堿性磷酸酶活力同樣隨著脅迫時間的延長而上升（圖4(C、D)），史文竟等[27]研究環(huán)境水溫對克氏原螯蝦（）血液相關(guān)酶活力的影響也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果。因此，鑒于酸性和堿性磷酸酶在免疫防御系統(tǒng)中起重要作用，雙重脅迫下血漿ACP和AKP規(guī)律性變化有利于對蝦適應(yīng)環(huán)境脅迫。同時，肝胰腺組織結(jié)構(gòu)變化進一步在組織化學(xué)層面證明，AC+WD雙重脅迫對機體臟器結(jié)構(gòu)造成了一定的損傷（圖5）。綜合上述血液生化指標(biāo)中生理應(yīng)激、物質(zhì)代謝、肝胰腺相關(guān)酶活力水平和結(jié)構(gòu)損傷情況，可以初步闡明無水保活流通過程中凡納濱對蝦響應(yīng)AC+WD雙重環(huán)境脅迫的生理應(yīng)激和代謝調(diào)節(jié)規(guī)律（圖6）。

圖6 AC+WD雙重脅迫下凡納濱對蝦生理應(yīng)激與代謝調(diào)節(jié)規(guī)律

4 結(jié)論

無水?；钸^程中AC+WD雙重脅迫會對凡納濱對蝦造成明顯的行為和生理應(yīng)激，使糖、脂和蛋白質(zhì)代謝加強，同時血液尿素氮和肌酐含量，以及谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力顯著上升，且肝胰腺組織出現(xiàn)規(guī)律性損傷。本研究整體揭示了無水?；盍魍ōh(huán)境下機體響應(yīng)AC+WD脅迫的生理應(yīng)激和代謝調(diào)節(jié)規(guī)律，為后續(xù)?；钸^程中的存活質(zhì)量監(jiān)控和保活流通參數(shù)調(diào)整提供了理論參考和實驗依據(jù)。

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Physiological Response and Metabolic Regulation ofExposed to Combination Stress of Acute Cold Exposure and Chronic Waterless Duration

XU De-feng, WU Jia-xin, SUN Li-jun, QIN Xiao-ming, FAN Xiu-ping

（////,524088,;,,116034,）

【Objective】To elucidate the physiological modulation mechanism ofin responseto a combination stress of acute cold exposure and chronic waterless duration during water-free transportation. 【Methods】Based on the simulation of transport practice, the changing profiles of typical biochemical indicators in hemolymph and hepatopancreas tissues were determined, and the histopathology injury was characterized. 【Results】The serum cortisol concentration significantly increased from the value of (326.90±4.61) pg/mL at AC group to (427.16±7.92) pg/mL at NC group (< 0.05), and the gradual decrease was observed at AC+WD groups. With the prolongation of combined stress of AC+WD, the glucose concentration reached the maximum of (26.31±1.05) mg/dL at 6 h in AC+WD group, while the maximum of lactic acid concentration (7.90±0.11) mmol/L was detected at 9 h (< 0.05). The concentrations of hemocyanin, urea nitrogen and creatinine in serum increased to some different degrees at AC and AC+WD groups. Although the concentration of total cholesterol and triglyceride decreased in a duration-dependent manner, the total protein concentration in serum elevated before 3 h and descend afterwards. The activities of aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase, acid phosphatase and alkaline phosphatase in serum of shrimps elevated with the prolongation of combined stress and reached the maximum at 9 h. The above-detected at revived group exhibited regression towards the values at NC group. In addition, histopathological result suggested the impairment of hepatopancreas tissue during combined stress. Overall, these variations of biochemical indicators and histopathological impairment indicated that combined stress caused the disorder of substrate metabolism and induced the cytostructural degradation. 【Conclusion】Combined stress altered the physiology and substrate metabolism ofin a time dependent manner during waterless live transport and the obvious pathology injures in hepatopancreas tissue was observed, which consequently induced the mortality.

; waterless live transport; physiological stress; metabolic response; hepatopancreas

TS254.1

A

1673-9159（2022）01-0020-09

10.3969/j.issn.1673-9159.2022.01.004

徐德峰，吳嘉鑫，孫力軍，等. 急冷與空氣暴露聯(lián)合脅迫對凡納濱對蝦生理代謝影響[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2022，42（1）：20-28.

2021-10-05

“十三五”國家重點研發(fā)計劃重點專項（2019YFD0901601）；國家自然科學(xué)基金面上項目（31772048）；廣東海洋大學(xué)自然科學(xué)基金項目（C16396）

徐德峰（1978―），男，教授，博士，研究方向為水產(chǎn)品保鮮?；钆c高值化利用。E-mail: 13827198525@163.com；

吳嘉鑫（1996―），女，碩士研究生，研究方向為對蝦保活流通冷應(yīng)激生理響應(yīng)機制。E-mail：3336138343@qq.com

（責(zé)任編輯：劉朏）