劉海芳，王 凡，張思琪，李聰歌，馬雅雯

復(fù)方中草藥對虹鱒免疫保護力的影響

劉海芳1，王 凡2，張思琪2，李聰歌2，馬雅雯2

（1. 中原工學(xué)院，河南 鄭州 450007；2. 洛陽師范學(xué)院，河南 洛陽 471934）

【目的】研究復(fù)方中草藥對虹鱒（）肝臟免疫功能及腸道免疫相關(guān)基因的影響?！痉椒ā繉⒓t棗提取物、山藥提取物和黃芪提取物按照質(zhì)量比1∶1∶1混合，分別按質(zhì)量分?jǐn)?shù)0（對照）、0.3%、0.6%和1.2%添加到虹鱒基礎(chǔ)飼料中，飼喂體長7.6 ～ 8.9 cm 的虹鱒幼魚56 d。用副溶血弧菌（s）對幼魚進(jìn)行攻毒試驗(5.48×106cfu/尾)，4 d后，取其肝臟和腸道，測定肝臟的生理生化指標(biāo)，用半定量PCR及熒光定量PCR測定腸道免疫相關(guān)基因的表達(dá)。【結(jié)果】與對照組比較，肝臟的總抗氧化能力（T-AOC）顯著升高（< 0.05），溶菌酶（LZM）水平極顯著升高（< 0.01），酸性磷酸酶（ACP）、過氧化氫酶（CAT）活性顯著降低（< 0.05），堿性磷酸酶（ALP）活性極顯著降低（< 0.01），0.6%劑量組的丙二醛（MDA）極顯著降低（< 0.01），而SOD無顯著差異（> 0.05）；各復(fù)方中草藥組腸道的腫瘤壞死因子（TNF-α）及1.2%劑量組轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）轉(zhuǎn)錄水平極顯著降低（< 0.01），0.3%和0.6%劑量組的補體3（C3）轉(zhuǎn)錄水平顯著升高（< 0.05）?！窘Y(jié)論】復(fù)方中草藥(紅棗+山藥+黃芪) 可提高感染副溶血弧菌的虹鱒非特異性免疫功能。

虹鱒；免疫；中草藥；副溶血弧菌；肝臟；腸道；非特異性免疫

虹鱒（）是一種適應(yīng)性較廣的冷水性魚類，其肉質(zhì)鮮美，刺少肉多，無腥無鱗，高蛋白低脂肪，膽固醇含量極少，富含氨基酸、不飽和脂肪酸，有“水中人參”之稱[1]?，F(xiàn)階段虹鱒養(yǎng)殖較為廣泛，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大和集約化水平的不斷提高，虹鱒疾病頻發(fā)[2-3]。目前，常用化學(xué)治療劑或抗生素藥物治療虹鱒病害，但存在成本較高、使魚體質(zhì)減弱、污染養(yǎng)殖水體和周圍環(huán)境等諸多缺點，不僅降低了成品價值，影響?zhàn)B殖效益，還威脅人們健康。在養(yǎng)殖過程中，如何提升虹鱒自身免疫力，預(yù)防魚病是其健康養(yǎng)殖的關(guān)鍵。

中草藥飼料添加劑有天然、無害、低成本、作用廣泛及對養(yǎng)殖動物、環(huán)境幾無副作用等優(yōu)點[4-5]。目前，已有復(fù)方中草藥中功能性成分作用的體外評價和體內(nèi)實驗的報道，對其功能性作用機制研究也逐漸深入，表明中草藥可促進(jìn)水產(chǎn)動物生長，提高其抗病及免疫力[6-12]。

紅棗（）、山藥（L.）和黃芪（Schischkin）是我國常見的藥食兼用中藥材。紅棗中的多糖、維生素、礦物質(zhì)、皂苷和黃酮類等有豐富的生物學(xué)功能[13]。山藥的功能性活性成分包括多糖、皂苷、膽甾醇、麥角甾醇、膽堿等，有抗氧化作用[14]。黃芪多糖可促進(jìn)動物脾內(nèi)漿細(xì)胞增生以及抗體合成，在體液免疫中起促進(jìn)作用[15]。本課題組前期研究表明，飼喂該3種中草藥復(fù)合物8周后，虹鱒生長性能有增加趨勢，免疫力增強[16]。為研究該復(fù)方中草藥對虹鱒免疫保護力的影響，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，對虹鱒進(jìn)行副溶血弧菌（）攻毒實驗，分析虹鱒非特異性免疫功能相關(guān)指標(biāo)的變化情況，為虹鱒中草藥飼料添加劑的適宜添加量研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料

紅棗、山藥和黃芪提取物，為水提物，購自陜西森弗天然制品有限公司，為原料經(jīng)精選、粉碎、精細(xì)提取、過濾、濃縮、精制純化、干燥、精微粉碎后制成，每1 000 g原材料的提取物為50 g。

實驗用虹鱒購自四川省眉山市東坡區(qū)天貴水產(chǎn)養(yǎng)殖場，體長7.6 ～ 8.9 cm，于飼養(yǎng)缸（直徑×高= 1 m×1 m）中暫養(yǎng)14 d，每日定時投喂3次并及時清理缸內(nèi)殘餌和糞便。暫養(yǎng)期間水溫11 ～ 15 ℃，pH 6.9 ± 0.2，溶解氧8 mg/L以上。

副溶血弧菌菌種，中國微生物菌種保藏中心。將菌種接種到配方為蛋白胨20 g/L、氯化鈉40 g/L、結(jié)晶紫0.000 5 g/L，pH = 8.8的液體培養(yǎng)基中，于36℃條件下培養(yǎng)24 h，制備2.74×107cfu/mL的副溶血弧菌原液，備用。

1.2 實驗飼料

參考肉食性魚類飼料配方及虹鱒飼料配方[17]，制備虹鱒基礎(chǔ)飼料，配方見文獻(xiàn)[16]。將紅棗、山藥和黃芪提取物按質(zhì)量比1∶1∶1混合制成復(fù)方中草藥，分別按質(zhì)量比0.30%、0.60%、1.20%在虹鱒基礎(chǔ)飼料中依次加入復(fù)方中草藥，制成相應(yīng)的復(fù)合中草藥飼料。使用ZL-600顆粒機制得顆粒飼料，風(fēng)干24 h，裝入保鮮袋，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實驗設(shè)計

選取暫養(yǎng)的規(guī)格相似、狀態(tài)良好、無病無傷的虹鱒，停飼24 h，放入冷水魚養(yǎng)殖循環(huán)系統(tǒng)中的飼養(yǎng)缸（直徑1 m，水深0.8 m），每缸放入30尾，放入前稱量體質(zhì)量。設(shè)對照組和處理組，對照組投喂基礎(chǔ)飼料，處理組分別投喂含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%、0.6%和1.2%復(fù)方中草藥的飼料，每個實驗組設(shè)3個平行組，實驗期間的其他條件同暫養(yǎng)期，養(yǎng)殖周期為8周。養(yǎng)殖實驗結(jié)束后，進(jìn)行攻毒試驗，根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，每組隨機選取虹鱒10尾，對魚腹腔注射0.2 mL 2.74×107cfu/mL副溶血弧菌原液，放入新實驗缸觀察，記錄死亡情況，4 d后剖取存活的虹鱒肝臟和腸道，于液氮中速凍，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存，備用。

1.4 肝臟非特異性免疫指標(biāo)的測定

將肝臟組織樣品置于冰上解凍后，取0.4 g加入9倍 [質(zhì)量 (g) 體積 (mL) 比] 的冰冷生理鹽水，在冰浴中研磨60 s左右，制成勻漿，將勻漿液以4 ℃、2 500 r/min條件離心10 min，取上清液，按照南京建成生物工程公司的試劑盒詳細(xì)步驟測定總抗氧化能力（T-AOC）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、溶菌酶（LZM）、酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（ALP）水平。

1.5 腸道免疫相關(guān)基因的檢測

1.5.1 引物序列 腫瘤壞死因子（TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、補體3（C3）、LZM靶基因與內(nèi)參基因的引物序列（表1）來自文獻(xiàn)[18-19]。

表1 PCR引物序列

1.5.2 RNA 的提取與反轉(zhuǎn)錄 根據(jù)總RNA極速抽提試劑盒（上海飛捷生物技術(shù)有限公司）的詳細(xì)步驟，提取虹鱒中腸的RNA，用超微量分光光度計測定RNA濃度及(260 nm)/(280 nm)，同時用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，對質(zhì)量好、濃度適宜的RNA根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒（東洋紡生物科技有限公司）的步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.5.3 半定量PCR 根據(jù)普通PCR反應(yīng)步驟，把反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA和試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）中的上下游引物、2×Tap MasterMix和Nuclear-Free Water配制成25 μL的PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)。對擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，調(diào)整內(nèi)參基因在每個濃度組條帶亮度基本一致，觀察目的基因、、和的條帶亮度，判斷目的基因的表達(dá)量。

1.5.4 實時熒光定量PCR 經(jīng)半定量PCR及實時熒光定量PCR分析，各基因的引物特異性良好。

將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后的cDNA，各基因的上、下游引物，DBI實時熒光定量試劑盒（DBI ? Bioscience）中的BestarSybr Green qPCR master mix、Nuclear-Free Water制備實時熒光定量PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)。分析反應(yīng)后的q值，利用2-ΔΔCT法計算非特異性免疫基因的相對表達(dá)量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用SPSS13.0軟件中的One-Way ANOVA對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用Duncan法對各組間差異進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)方中草藥對虹鱒肝臟免疫保護力相關(guān)生化指標(biāo)的影響

復(fù)方中草藥飼料對虹鱒肝臟免疫保護力相關(guān)生化指標(biāo)的影響見表2。表2可見，復(fù)方中草藥組的T-AOC顯著高于對照組（< 0.05），LZM極顯著高于對照組（< 0.01），0.6%劑量組的T-AOC 顯著低于1.2%劑量組（< 0.05），0.3%劑量組的LZM顯著高于0.6%和1.2%劑量組（< 0.01）。復(fù)方中草藥組的CAT、ACP和ALP與對照組相比顯著降低（< 0.05），0.3%劑量組CAT顯著低于1.2%劑量組（< 0.05），隨復(fù)方中草藥添加劑量增加，ALP活性極顯著降低（< 0.01）。0.6%劑量組的MDA極顯著低于對照組（< 0.01），0.3%和1.2%劑量組與對照組之間差異不顯著（> 0.05）。各組間SOD差異不顯著（> 0.05）。

表2 不同中草藥添加劑量組虹鱒肝臟非特異性免疫指標(biāo)

注：同列凡含一個相同字母則表示差異不顯著（> 0.05）。

Note: Containing one same letter in the same column indicates no significant difference (> 0.05).

2.2 免疫保護力相關(guān)基因的半定量PCR分析

圖1顯示，與對照組相比，基因在各復(fù)方中草藥組的表達(dá)有升高的趨勢；基因在1.2%劑量組明顯降低，在0.3%和1.2%組無顯著變化；基因的表達(dá)調(diào)控與基因類似；基因在各復(fù)方中草藥組無明顯變化。

2.3 復(fù)方中草藥對虹鱒腸道免疫保護力相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖2可見，與對照組相比，0.6%和1.2%劑量組基因表達(dá)量顯著上升（< 0.05），分別依次上調(diào)38.8%和30.2%。復(fù)方中草藥組基因表達(dá)量無顯著差異（> 0.05）。復(fù)方中草藥組基因表達(dá)量顯著下調(diào)（< 0.01），分別依次下調(diào)44.4%、42.6%、32.3%。1.2%劑量組基因表達(dá)量顯著下調(diào)（< 0.01），下調(diào)92.9%。

圖1 不同實驗組虹鱒腸道的內(nèi)參及目的基因

凡含一個相同字母則表示差異不顯著（P > 0.05）。

3 討論

3.1 復(fù)方中草藥對虹鱒肝臟免疫相關(guān)生化指標(biāo)的影響

氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡且傾向于氧化的狀態(tài)。丙二醛（MDA）是氧化應(yīng)激過程產(chǎn)生的代表性毒性中間產(chǎn)物?？偪寡趸芰κ侵父鞣N抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶等構(gòu)成的總抗氧化水平。超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）是較為重要的兩種抗氧化酶?？寡趸镔|(zhì)可清除生物體內(nèi)多余的自由基來增強免疫力。本研究中，在副溶血弧菌刺激下，復(fù)方中草藥組虹鱒肝臟的T-AOC顯著提高，0.6%劑量組MDA顯著降低，表明復(fù)方中草藥提高了虹鱒肝臟的抗氧化能力，尤其在0.6%濃度組表現(xiàn)得更為突出。王得清等[20]指出，黃芪總黃酮具有清除自由基的作用，劉飛等[21]研究表明，紅棗提取物顯著提高虹鱒肝臟和腎臟SOD活性，降低腎臟MDA水平，WANG等[22]研究發(fā)現(xiàn)，山藥提取物提高虹鱒血清SOD活性。本課題組前期研究也表明，該復(fù)合中草藥在投喂虹鱒56 d后，虹鱒血清SOD顯著升高。但本研究發(fā)現(xiàn)，副溶血弧菌刺激下，復(fù)方中草藥組虹鱒肝臟CAT顯著降低，而SOD無顯著變化，由此推測，虹鱒肝臟在病原菌刺激下，復(fù)方中草藥組虹鱒構(gòu)成總抗氧化能力的其他抗氧化類物質(zhì)可能顯著提高，從而抑制了CAT活性[23]，同時復(fù)方中草藥成分和魚組織的不同也會導(dǎo)致各種抗氧化酶結(jié)果的不同。

ACP和ALP在動物免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，也是反映其肝功能的兩個重要指標(biāo)。ACP直接用于磷酸基團的轉(zhuǎn)移，參與能量轉(zhuǎn)化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，提高機體的非特異性免疫水平和營養(yǎng)代謝水平[8]。ALP在堿性介質(zhì)中可通過水解作用清除表面帶有磷酸酯的異物，其活性的高低與動物的生長性能關(guān)系密切[9]。本研究中發(fā)現(xiàn)，副溶血弧菌刺激下，復(fù)方中草藥組肝臟的ACP和ALP顯著性降低，表明對照組被病原菌攻擊，肝臟的ACP和ALP相對升高，免疫水平和肝臟代謝功能降低，而復(fù)方中草藥增加了虹鱒肝臟的非特異性免疫功能，保護肝臟。

LZM可溶解細(xì)菌細(xì)胞壁而使細(xì)菌溶解，也可與帶負(fù)電荷的病毒蛋白結(jié)合，與核酸、脫輔基蛋白形成復(fù)合體，使病毒失活。因此，其活性與動物的抗病性和免疫密切相關(guān)[10]。血清和肝胰臟在識別外來異物和免除異物侵害時發(fā)揮重要作用。本研究中，副溶血弧菌刺激下，復(fù)方中草藥組肝臟的LZM與對照組相比較顯著升高，表明復(fù)方中草藥提高了虹鱒肝臟抑菌能力，可能與復(fù)方中草藥提高了魚類的消化能力及營養(yǎng)成分的利用率有關(guān)[24]。這也與復(fù)方中草藥對虹鱒血清LZM影響的結(jié)果相一致[16]。

3.2 復(fù)方中草藥對虹鱒腸道免疫保護力相關(guān)基因表達(dá)的影響

TNF-α是巨噬細(xì)胞受到病原體等有害刺激產(chǎn)生的小分子蛋白，能直接殺傷腫瘤細(xì)胞，而對正常細(xì)胞無明顯毒性，是炎癥反應(yīng)必須的介質(zhì)[25]。本研究中，弧菌攻毒處理后，復(fù)方中草藥組基因表達(dá)量顯著下調(diào)，說明其腸道促炎癥因子降低，復(fù)方中草藥增加了虹鱒腸道的免疫水平，降低炎癥反應(yīng)。本課題組前期研究表明，該配方的復(fù)方中草藥顯著提高了虹鱒血清含量[16]，同時還發(fā)現(xiàn)該配方中的山藥提取物[22]和紅棗提取物[21]也顯著提高了虹鱒腸道中的mRNA表達(dá)量，說明該配方中草藥能通過的表達(dá)調(diào)控來提高虹鱒的免疫功能。

補體系統(tǒng)在先天性免疫中有良好的作用（趨化、調(diào)理和消滅病原體），補體的激活可促進(jìn)B細(xì)胞增殖、分化，最終產(chǎn)生抗體和效應(yīng)淋巴細(xì)胞，連接免疫系統(tǒng)[26-28]。C3為補體系統(tǒng)中含量最高的成分。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著飼料中中草藥添加量的上升，虹鱒腸道中表達(dá)量有上升的趨勢，且在0.6%與1.2%組顯著上升，表明虹鱒在投喂中草藥后腸道獲得性免疫提升，有助于虹鱒抵抗外界不良環(huán)境，極大地提高虹鱒的抗菌能力。劉飛等[21]研究表明，紅棗提取物提高了虹鱒頭腎中基因表達(dá)量，周顯青等[12]指出，黃芪能明顯促進(jìn)中華鱉（）血清補體C3的合成，WANG等[22]研究顯示，山藥提取物顯著提高了虹鱒血清含量，本研究前期研究同樣證實該配方中草藥提高虹鱒血清中和的含量，這些結(jié)果和本研究結(jié)果一致，表明該復(fù)方中草藥的各種成分均可增強魚類的補體水平，增加抗菌能力。

TGF-β即轉(zhuǎn)化生長因子，主要作用是通過促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的形成與抑制免疫反應(yīng)等來調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長與分化，也是調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞的重要細(xì)胞因子，能抑制其增殖，誘導(dǎo)凋亡，阻斷活化與分化[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，在投喂中草藥添加劑后，基因表達(dá)量在1.2%劑量組顯著下調(diào)，說明復(fù)方中草藥能顯著增強虹鱒淋巴細(xì)胞分化，進(jìn)一步證實復(fù)方中草藥添加劑能顯著增強虹鱒的免疫能力。

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Effect of Chinese Herbal Compound on Immune Protection of Rainbow Trout()

LIU Hai-fang1, WANG Fan2, ZHANG Si-qi2, LI Cong-ge2, MA Ya-wen2

（1. Z,450007,;2.,471934,）

【Objective】The aim of this study is to study the effect of Chinese herbal compound (CHC) on liver immune function and intestinal immune-related genes of rainbow trout ().【Method】Juvenilerainbow trout with a body length of 7.6 - 8.9 cm were fed the diets containing CHC prepared by jujube, yam and astragalus extracts (20∶1) in equal proportion at a dose of 0, 0.3%, 0.6% and 1.2% for 56 d, and then were injected withs (5.48×106cfu/ind). Four days after injection, physiological and biochemical indexes in the liver and the expressions of immune related genes in the intestine were detected by semi-quantitative PCR and qPCR.【Results】Compared with the control, T-AOC and LZM activity were significantly increased (< 0.05< 0.01, ), and the acid phosphatase(ACP), catalase (CAT), and alkaline phosphatase (ALP) activities were decreased (< 0.05), and the MDA level in 0.6% group was also decreased (< 0.01); while SOD was not changed (> 0.05); expressions ofgene in theintestine of CHC groups andgene in 1.2% group were significantly decreased (< 0.01), whilein 0.3% and 0.6% groups were increased (< 0.05). 【Conclusion】CHC (jujube+yam+astragalus) can improve the nonspecific immune function level of rainbow trouts infected withs.

; immune; Chinese herbal medicine;; liver; intestine; nonspecific immune

S968

A

1673-9159（2022）01-0007-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2022.01.002

劉海芳，王凡，張思琪，等. 復(fù)方中草藥對虹鱒免疫保護力的影響[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2022，42（1）：7-12.

2021-07-27

河南省科技廳科技攻關(guān)項目（182102110407）

劉海芳（1977―），女，副教授，研究方向為水生生物學(xué)。E-mail: 49112015@qq.com

（責(zé)任編輯：劉慶穎）