曹政，格格其木格，徐曉泉，3，翟少欽，付文貴，朱買勛

1. 重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；2. 內(nèi)蒙古阿伊薩畜牧業(yè)發(fā)展有限公司，內(nèi)蒙古 錫林郭勒盟 027200；3. 重慶棠城畜牧科技有限公司，重慶 402460

殼聚糖是一類天然多糖類高分子材料，是氨基葡萄糖與N-乙酰葡萄糖胺的共聚合物，屬于低毒性大分子聚合物，具有較好的生物相容性和可降解性，目前在藥劑和化妝品行業(yè)中的使用已經(jīng)較為廣泛［1-5］。有研究表明，殼聚糖的前體甲殼素可通過激活甘露糖受體、TLR-2 和Ⅰ型凝集素等抗原模式識(shí)別受體誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生天然免疫反應(yīng)［6-7］。且殼聚糖可上調(diào)體外培養(yǎng)的DC 表面CD80 及CD60 等分子表達(dá)，促進(jìn)DC 分泌IL-6、IL-12 等促炎癥因子，有助于激活T細(xì)胞接受的免疫應(yīng)答。在細(xì)胞水平試驗(yàn)中，殼聚糖與常用鋁膠佐劑最顯著的差別為殼聚糖可促進(jìn)DC分泌IL-12，而鋁膠佐劑可抑制DC 分泌IL-12，這充分說明殼聚糖在誘導(dǎo)Th1 型細(xì)胞免疫反應(yīng)方面具有優(yōu)勢［8-9］。Th1 型細(xì)胞免疫在病毒性疾病感染過程中，以及在有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答等清除病毒感染過程中起到至關(guān)重要的作用，同時(shí)質(zhì)子化的殼聚糖可使動(dòng)物細(xì)胞膜形成短暫的通道，有效提高疫苗抗原跨膜運(yùn)輸效率，因此，売聚糖的免疫増強(qiáng)作用已經(jīng)得到了一定的證實(shí)［10-11］。由于分子特性限制，殼聚糖不能溶解于生理pH 環(huán)境，僅可在酸性環(huán)境中形成質(zhì)子化的可溶殼聚糖，同時(shí)殼聚糖溶液還存在黏度較大、難以濕熱滅菌等使用問題，嚴(yán)重限制了殼聚糖作為疫苗佐劑的應(yīng)用及推廣。因此近年的報(bào)道多為殼聚糖佐劑納米顆粒的佐劑特性研究。ABDEL ALLAH 等［12］報(bào)道，殼聚糖納米顆粒被明礬及海藻酸鈉包被后，可具備良好的水溶性即生物相容性，且具有較好的緩釋特性。作為甲型肝炎疫苗佐劑使用時(shí)，可促進(jìn)IL-4 和IL-2 的分泌，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生良好的 IFNγ 和 IL-10，且促進(jìn) Th1 和 Th2 免疫應(yīng)答方面保持平衡，顯現(xiàn)出良好的佐劑特性。EI-SISSI 等［13］發(fā)現(xiàn)，殼聚糖納米顆粒攜帶裂谷熱病毒的滅活抗原后，可顯著提高中和抗體效價(jià)，并可上調(diào) IL-2、IL-4和IFNγ 基因的表達(dá)，促進(jìn)Th1 型免疫應(yīng)答。且ZHAO等［14］報(bào)道，殼聚糖納米顆粒作為黏膜疫苗佐劑，可有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IgA、IgG 抗體，并活化樹突狀細(xì)胞，促進(jìn)免疫反應(yīng)。

目前殼聚糖納米顆粒的制備在各個(gè)領(lǐng)域應(yīng)用的研究已被廣泛報(bào)道［15-18］，但由于生產(chǎn)工藝以及生產(chǎn)成本的影響，目前殼聚糖納米顆粒并不適用于獸用疫苗領(lǐng)域。

本研究利用殼聚糖可以在酸性條件下溶解的特點(diǎn)，并借鑒殼聚糖納米顆粒制備的方法，先使殼聚糖在酸性條件下完全溶解，再緩慢調(diào)節(jié)pH，使已經(jīng)溶解的大分子殼聚糖緩慢析出，形成類似納米顆粒的分散狀態(tài)的再生殼聚糖。之后再利用不同pH 的緩沖體系對(duì)不同濃度的再生殼聚糖進(jìn)行復(fù)溶，篩選并建立了制備pH 接近中性的再生殼聚糖無菌溶液的方法。

1 材料與方法

1. 1 疫苗 山羊痘活疫苗和豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）購自重慶澳龍生物制品有限公司。

1. 2 主要試劑 殼聚糖（脫乙酰甲殼素）購自山東綠英化工科技有限公司，分析純；鋁膠疫苗稀釋液由重慶澳龍生物制品有限公司提供；氯化鈉注射液（生理鹽水）購自廣東圣戈生物科技有限公司；山羊痘抗體（Pox-Ab）ELISA 試劑盒購自泉州市睿信生物科技有限公司；豬瘟抗體（CSF-Ab）ELISA 試劑盒購自齊一生物科技（上海）有限公司。

1. 3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康山羊（散養(yǎng)，4 ~ 6 月齡，未接種疫苗）和健康育肥豬（集約化養(yǎng)殖，6 月齡，豬瘟抗體呈陰性）均由內(nèi)蒙古阿伊薩畜牧業(yè)發(fā)展有限公司提供。本實(shí)驗(yàn)均以科研為目的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的養(yǎng)殖和使用，且按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1. 4 殼聚糖稀釋液的制備 根據(jù)表1 配制不同pH的 0. 2 mol ／ L 磷酸-檸檬酸緩沖液、醋酸-醋酸鈉緩沖液及磷酸鹽緩沖液。稱取1 ~ 5 g 殼聚糖分別加至100 mL 不同pH 的3 種緩沖溶液中，室溫下攪拌30 min 至澄清，10 000 × g 離心 10 min，去除雜質(zhì)，上清即為可溶殼聚糖稀釋液（soluble chitosan diluent，SCD）。取任意一種緩沖體系的SCD 稀釋液，緩慢添加 1 mol ／ L NaOH 至沉淀完全析出，2 000 × g 離心10 min，收集沉淀，去離子水洗滌2 ~ 3 次并涼干，即為再生殼聚糖。取1 ~ 5 g再生殼聚糖，分別用不同pH 的3 種緩沖體系溶解，室溫下攪拌30 min 至澄清，10 000 × g 離心10 min，去除雜質(zhì)，上清即為再生殼聚糖稀釋液（regenerated chitosan diluent，RCD）。將制備的各種SCD 及RCD 用相應(yīng)緩沖體系的共軛酸鹽調(diào)pH 接近中性后，115 ℃（68 kPa）濕熱滅菌30 min，記錄殼聚糖及再生殼聚糖在不同緩沖體系中的溶解特性等參數(shù)。

表1 緩沖液配制表Tab. 1 Formula of buffer

1. 5 殼聚糖稀釋液最佳濃度篩選 將制備好的SCD及RCD 分別用相應(yīng)緩沖體系制備成0. 5%、1%、2%濃度的溶液，用不同濃度的SCD 及RCD 將山羊痘活疫苗稀釋成1 頭份 ／ mL，分別免疫健康山羊，頸部皮下注射，1 mL ／ 只，共 10 只，同時(shí)用生理鹽水以同樣方式稀釋疫苗并免疫動(dòng)物作為對(duì)照。根據(jù)表2持續(xù)監(jiān)測動(dòng)物健康狀態(tài)，并在第1 次免疫后14 d，按同樣方法進(jìn)行第2 次免疫。采集第1 次免疫前、免疫后14 d 及第2 次免疫后14 d 靜脈血并分離血清，利用山羊痘抗體（Pox-Ab）ELISA 試劑盒檢測血清ELISA 抗體效價(jià)。

表2 臨床檢測內(nèi)容Tab. 2 Clinical tests

1. 6 殼聚糖稀釋液對(duì)山羊痘活疫苗安全及效力影響的檢測 用殼聚糖稀釋液、鋁膠稀釋液及生理鹽水分別將山羊痘活疫苗稀釋成1 頭份 ／ mL，分別免疫健康山羊。每組免疫50 只，每只頸部皮下注射1 mL。免疫前先采集靜脈血并分離血清備用，免疫后持續(xù)監(jiān)測72 h 體溫變化。第1 次免疫后14 d 采集靜脈血并分離血清，按同樣方法進(jìn)行第2 次免疫。第2 次免疫后14 d 采集靜脈血并分離血清。利用山羊痘抗體（Pox-Ab）ELISA 試劑盒檢測血清ELISA 抗體效價(jià)。

1. 7 殼聚糖稀釋液對(duì)豬瘟疫苗（細(xì)胞源）安全及效力影響的檢測 用殼聚糖稀釋液、鋁膠稀釋液、疫苗自帶稀釋液（Z1 稀釋液）及生理鹽水分別將豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）稀釋成1 頭份 ／ mL，分別免疫健康育肥豬。每組免疫10 頭，每頭在耳根背后皮下注射1 mL。免疫前先采集前腔靜脈血并分離血清，免疫后持續(xù)監(jiān)測72 h 體溫變化。第1 次免疫后14 d 采集前腔靜脈血并分離血清，按同樣方法進(jìn)行第2 次免疫。第2 次免疫后14 d 采集前腔靜脈血并分離血清。利用豬瘟抗體（CSF-Ab）ELISA 試劑盒檢測血清ELISA 抗體效價(jià)。

1. 8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Graphpad prism 8 軟件進(jìn)行抗體水平的比較分析，通過單因素方差分析（One-way ANOVA）對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組的抗體水平進(jìn)行分析，以P <0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 殼聚糖稀釋液的制備 結(jié)果顯示，殼聚糖在任何pH 的磷酸-檸檬酸緩沖液及磷酸鹽緩沖液中均不能溶解，僅在部分pH 的醋酸-醋酸鈉緩沖液中可以溶解；同時(shí)利用醋酸-醋酸鈉緩沖體系制備的再生殼聚糖，仍然不能在上述2 種緩沖體系中溶解。無論殼聚糖或再生殼聚糖，其溶解程度均會(huì)隨著體系pH逐漸升高或溶質(zhì)濃度逐漸增加而下降。其中，1%濃度的殼聚糖可在pH 5. 2 以下較好地溶解，最大溶解程度為pH 4. 0 ／ 3%。而再生后的殼聚糖2%濃度時(shí)在pH 6. 0 時(shí)仍能較好地溶解，最大溶解程度為pH 4. 0 ／ 5%。見表3。表明醋酸-醋酸鈉緩沖液是一種溶解殼聚糖或制備再生殼聚糖較為理想的緩沖體系。同時(shí)可推斷，殼聚糖經(jīng)過溶解-析出-再溶解的再生過程，溶解度會(huì)有所提升。

表3 殼聚糖在醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中的溶解特性Tab. 3 Dissolution characteristics of chitosan in acetic acidsodium acetate buffer

將1%~5%的SCD 及RCD 115 ℃濕熱滅菌30 min后，原本在pH 5. 2 條件下清澈透明的1% SCD，經(jīng)濕熱滅菌后呈現(xiàn)為茶色，而2% pH 6. 0 的RCD 也變?yōu)轲こ頎钜后w。見表4。表明濕熱滅菌對(duì)殼聚糖溶解度的影響是隨著pH 以及殼聚糖濃度增加而增強(qiáng)的，最終會(huì)導(dǎo)致溶液顏色逐漸加深，且狀態(tài)也逐漸變得黏稠，直至成為棕黑色的膏狀物體。通過結(jié)果可以推斷，濕熱滅菌條件下，應(yīng)使用pH 4. 0 的醋酸-醋酸鈉緩沖液制備1%可溶殼聚糖緩沖液（SCD），而pH 4. 6 的醋酸-醋酸鈉緩沖液可制備2%再生殼聚糖緩沖液（RCD）。

表4 濕熱滅菌后溶液變化Tab. 4 Properties of solution after sterilization by moist heat

綜上所述，殼聚糖稀釋液的制備流程為：①SCD：應(yīng)使用0. 2 mol ／ L pH 4. 0 醋酸-醋酸鈉緩沖液配制1%濃度的殼聚糖，離心去除雜質(zhì)后，115 ℃濕熱滅菌30 min，最后用 1 mol ／ L 無菌醋酸鈉溶液調(diào) pH 至5. 2。②RCD：應(yīng)使用 0. 2 mol ／ L pH 4. 0 醋酸-醋酸鈉緩沖液配制3%濃度的殼聚糖溶液，離心去除雜質(zhì)后，上清滴加濃度為 1 mol ／ L 的 NaOH 至沉淀完全析出。低速離心收集再生殼聚糖，并用0. 2 mol ／ L pH 4. 6 醋酸-醋酸鈉緩沖液配制成2%濃度的再生殼聚糖溶液，115 ℃濕熱滅菌30 min，最后用1 mol／L無菌醋酸鈉溶液調(diào)pH 至6. 0。

2. 2 殼聚糖稀釋液的最佳濃度 用制備的稀釋液稀釋山羊痘活疫苗并免疫山羊后，各組安全性檢測結(jié)果無差異，采食、行為、精神狀態(tài)、糞便均未出現(xiàn)異常，局部均無病變。雖然各試驗(yàn)組山羊體溫未超過正常體溫（38. 3 ~ 39. 9 ℃），但 1% SCD、2% SCD 及2% RCD 試驗(yàn)組在免疫后2 ~ 12 h 內(nèi)出現(xiàn)體溫升高現(xiàn)象，最高達(dá)39. 8 ℃，見表5。第2 次免疫后14 d解剖結(jié)果顯示，上述3 組在頸部皮下的注射部位均存在大小不規(guī)則的硬塊，各組肺、肝、脾、腎、胰腺未見異常。表明殼聚糖濃度增大后會(huì)難以吸收，并在局部引起炎癥反應(yīng)，從而引發(fā)體溫升高，當(dāng)殼聚糖經(jīng)過再生后，會(huì)緩解這一現(xiàn)象。

表5 各組山羊體溫檢測結(jié)果（℃，，n = 10）Tab. 5 Body temperatures of goats in various groups（℃，，n = 10）

表5 各組山羊體溫檢測結(jié)果（℃，，n = 10）Tab. 5 Body temperatures of goats in various groups（℃，，n = 10）

組別 0 h 2 h 12 h 24 h 72 h 0. 5% SCD 試驗(yàn)組 38. 6 38. 9 38. 6 38. 0 38. 9 0. 5% RCD 試驗(yàn)組 38. 7 38. 3 38. 9 38. 8 38. 4 1% SCD 試驗(yàn)組 38. 3 39. 6 38. 7 38. 5 39. 6 1% RCD 試驗(yàn)組 38. 7 38. 1 38. 6 38. 5 38. 4 2% SCD 試驗(yàn)組 38. 6 39. 8 39. 4 38. 2 38. 4 2% RCD 試驗(yàn)組 38. 5 39. 6 39. 1 38. 5 38. 6生理鹽水對(duì)照組 38. 4 38. 9 38. 9 38. 5 38. 7

ELISA 結(jié)果顯示，在第1 次免疫后14 d，各組殼聚糖稀釋液的抗體均達(dá)到一個(gè)較高的水平，1% SCD、1%RCD 和2%RCD 試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 分別為 0.005 1、0.006 1 和 0.008 8），其余各組差異也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均 ＜0. 05），見圖1。表明各試驗(yàn)組殼聚糖稀釋液起到了良好的佐劑性能，且0. 5% ~ 2% SCD 及RCD 均可激發(fā)良好的免疫應(yīng)答。綜合以上結(jié)果，0. 5% SCD 和0. 5%、1% RCD 均具備較好的安全性及良好的佐劑性能，可作為疫苗稀釋液使用。結(jié)合制備方法及制備成本等因素考慮，最終選擇pH 6. 0 0. 5% RCD 作為最佳稀釋液配方。

圖1 不同濃度殼聚糖稀釋液的安全及效力試驗(yàn)Fig. 1 Safety and efficacy test on chitosan diluents at various concentrations

2. 3 殼聚糖稀釋液對(duì)山羊痘活疫苗安全及效力的影響 用0. 5% RCD（pH 6. 0）、鋁膠稀釋液及生理鹽水稀釋山羊痘活疫苗并免疫山羊后，0. 5% RCD與生理鹽水均未激發(fā)動(dòng)物體溫升高，鋁膠稀釋液在注射后12 h 內(nèi)造成動(dòng)物體溫升高約1 ℃，見圖2A。表明0. 5% RCD 在群體免疫時(shí)具備與生理鹽水一樣的適應(yīng)性及安全性。

ELISA 結(jié)果顯示，0.5%RCD 在第 1 次免疫后，即產(chǎn)生了高于鋁膠稀釋液及生理鹽水的抗體水平，見圖2B，表明該稀釋液在保證安全性的同時(shí)，有效地提升了疫苗的免疫效果，適合作為獸用疫苗稀釋液。

圖2 不同稀釋液稀釋山羊痘活疫苗免疫山羊后的體溫觀察（A）和抗體效價(jià)檢測（B）Fig. 2 Body temperature（A）and antibody titer（B）of goats immunized with live pox vaccine diluted with various diluents

2. 4 不同稀釋液對(duì)豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）安全及效力的影響 用0. 5% RCD（pH 6. 0）、鋁膠稀釋液、生理鹽水及疫苗自帶稀釋液（Z1）分別稀釋豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）并免疫育肥豬，72 h 后，僅鋁膠稀釋液組出現(xiàn)約1 ℃的體溫升高，其他3 組均無明顯的體溫反應(yīng)，見圖3A?？贵w水平檢測結(jié)果也與預(yù)期一致，即0. 5%RCD 在第1 次免疫后即達(dá)到了其他組需2 次免疫才達(dá)到的抗體水平，見圖3B。表明制備的0.5%RCD具備與生理鹽水一致的動(dòng)物適應(yīng)性及安全性，同時(shí)具備理想的免疫增強(qiáng)作用。因此，推斷本實(shí)驗(yàn)制備的RCD 獸用疫苗稀釋液具有作為獸用疫苗稀釋液的應(yīng)用潛力，尤其適用于動(dòng)物的大規(guī)模疫苗免疫。

圖3 不同稀釋液稀釋豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）免疫育肥豬后的體溫觀察（A）和效價(jià)檢測（B）Fig. 3 Body temperature（A）and antibody titer（B）of fattening pigs immunized with classical swine fever vaccine diluted with various diluents

3 討 論

在草原牧區(qū)對(duì)散養(yǎng)的大規(guī)模的動(dòng)物進(jìn)行疫苗免疫時(shí)，普遍存在免疫效果參差不齊，而且動(dòng)物在免疫后1 ~ 3 d 內(nèi)出現(xiàn)規(guī)模性的進(jìn)食減少、行動(dòng)不便等現(xiàn)象。免疫效果不理想是由于動(dòng)物數(shù)量龐大以及缺乏動(dòng)物保定設(shè)備，獸醫(yī)人員難以均一地注射足夠劑量的疫苗導(dǎo)致的。因此在臨床實(shí)際操作中，獸醫(yī)人員往往加大劑量進(jìn)行免疫注射，同時(shí)伴隨反復(fù)追逐捕捉動(dòng)物并造成動(dòng)物間擠壓、踩踏等機(jī)械性損傷，最終導(dǎo)致動(dòng)物在注射疫苗后常大面積出現(xiàn)行動(dòng)不便、進(jìn)食減少、注射部位潰爛甚至死亡等現(xiàn)象。本研究是針對(duì)草原牧區(qū)的工作特點(diǎn)，建立一套再生殼聚糖獸用疫苗稀釋液的制備方法，目的是利用殼聚糖的吸附性以及激活免疫系統(tǒng)等特點(diǎn)，在有效提高疫苗免疫源性的同時(shí)，減輕臨床工作強(qiáng)度，避免副反應(yīng)發(fā)生。

殼聚糖是一種天然的大分子物質(zhì)，具有良好的激發(fā)天然免疫的能力，但由于其分子結(jié)構(gòu)的限制，殼聚糖僅能在酸性條件下溶解，且黏度較大。本研究采用0. 2 mol ／L pH 4. 0 醋酸-醋酸鈉緩沖液配制了3%濃度的殼聚糖溶液，之后利用滴加高濃度NaOH 的方式使已經(jīng)完全溶解的殼聚糖均勻地析出，經(jīng)去離子水反復(fù)洗滌并干燥后得到再生殼聚糖。經(jīng)過再生后的殼聚糖再用0. 2 mol ／ L pH 4. 6 醋酸-醋酸鈉緩沖液配置成2%濃度溶液，溶液的黏度下降，溶解度也有所增加，且可耐受115 ℃濕熱滅菌而不變性。經(jīng)高壓滅菌后的再生殼聚糖溶液經(jīng)稀釋后，用無菌醋酸鈉調(diào)pH 至6. 0，最終可得到pH 接近中性、性狀理想的RCD，有效地解決了殼聚糖溶解度較低、黏度較大、溶解pH 較低等不利因素。

本研究安全性及免疫應(yīng)答試驗(yàn)結(jié)果顯示，采用0.5%RCD 作為疫苗稀釋液時(shí)，不僅具有等同與生理鹽水的動(dòng)物適應(yīng)性及安全性，而且可有效提高山羊痘活疫苗以及豬瘟活疫苗的免疫原性。ELISA 檢測結(jié)果顯示，使用0.5%RCD 稀釋的山羊痘活疫苗以及豬瘟活疫苗，在第1 次免疫14 d 后，抗體水平可達(dá)到其他稀釋液免疫2 次后才能達(dá)到的抗體水平。推斷本研究使用的0. 5% RCD 在免疫劑量不足（單次免疫）時(shí)，即可有效地激發(fā)良好的免疫應(yīng)答，尤其適合作為大規(guī)模動(dòng)物免疫時(shí)使用的疫苗稀釋液。