李佳茵　王慧敏　祖國(guó)仁

摘要：通過(guò)研究不同搖床轉(zhuǎn)速、不同碳源和碳源濃度、不同誘導(dǎo)碳源對(duì)海洋真菌MF-08產(chǎn)殼聚糖酶的影響，提高其產(chǎn)酶活性，并對(duì)海洋真菌MF-08產(chǎn)殼聚糖酶進(jìn)行部分酶學(xué)性質(zhì)研究。結(jié)果表明，最佳發(fā)酵條件為27℃，150 r/min，1.5%蔗糖，0.01%氨基葡萄糖，海水培養(yǎng)基發(fā)酵72h。該殼聚糖酶的最適作用溫度為40℃，最適pH 5.2，酶活在pH 4.0～6.0范圍內(nèi)和0～40℃相對(duì)穩(wěn)定；Cu²⁺、Fe³⁺和Hg²⁺對(duì)該酶活具有明顯的抑制作用。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)條件的優(yōu)化，該菌的最高產(chǎn)酶活性達(dá)到1.769 U/mL，與優(yōu)化前相比提高了7.56倍。

關(guān)鍵詞：海洋真菌MF-08；殼聚糖酶；誘導(dǎo)條件；酶學(xué)性質(zhì)

殼寡糖是甲殼素脫乙?；蟮漠a(chǎn)物，是一種具有獨(dú)特生理活性的低聚糖，屬于陽(yáng)離子型天然堿性多糖，這使得殼聚糖具有許多特殊的物理、化學(xué)性質(zhì)及生理和藥理功能。具有抗腫瘤、抗菌、免疫激活等獨(dú)特的生理功能，其應(yīng)用前景廣闊。殼聚糖在自然界廣泛存在于蝦、蟹及少數(shù)菌類(lèi)、藻類(lèi)的細(xì)胞壁中，在高等植物中還未發(fā)現(xiàn)殼聚糖的存在，也可由幾丁質(zhì)通過(guò)部分或完全脫乙酰而成，在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和環(huán)保等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值。降解殼聚糖的方法有化學(xué)法、物理法、酶解法、電化學(xué)法等，其中酶解法具有特異性強(qiáng)、節(jié)能、環(huán)保、安全等優(yōu)勢(shì)。殼聚糖酶是一種降解殼聚糖的專(zhuān)一性水解酶，是理想的殼聚糖降解方法。利用酶法降解殼聚糖的研究還處在實(shí)驗(yàn)室研究階段，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，關(guān)鍵在于尚未研究出有效獲得大量的、專(zhuān)一性的殼聚糖酶制劑的方法。

本試驗(yàn)以一株產(chǎn)殼聚糖酶活力較高的海洋真菌為出發(fā)菌株，研究其培養(yǎng)條件對(duì)產(chǎn)酶的影響及殼聚糖酶學(xué)性質(zhì)的研究，以期為殼聚糖酶工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種 海洋真菌MF-08：大連工業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.2培養(yǎng)基 試管斜面培養(yǎng)基：1.0%葡萄糖，0.5%殼聚糖，0.2%蛋白胨，0.1%酵母膏，40%蒸餾水，60%陳海水，2%瓊脂，自然pH，115-120℃，滅菌20 min，冷卻待用。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：碳源1.0%；酵母膏0.1%；蛋白胨0.5%：FePO₄0.01%：陳海水100 mL；pH 7.6；在115-121℃滅菌20 min，冷卻待用。

液體種子培養(yǎng)基（g/L）：在無(wú)菌試管中裝入5 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，在115-121℃滅菌20 min，冷卻待用。

無(wú)金屬離子培養(yǎng)基：蔗糖1.5%：酵母膏0.1%；蛋白胨0.5%：去離子水100 mL；自然pH；在115-121℃滅菌20 min，冷卻待用。

1.1.3儀器 不銹鋼手提式蒸汽滅菌鍋，上海博訊儀器廠；雙層小容量全溫度恒溫震蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；722 s分光光度計(jì)，上海精密儀器科學(xué)有限公司；TGL-16C型臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；MJP-150型霉菌培養(yǎng)箱、DK-S24型電熱恒溫水浴鍋；DGG-9070B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1粗酶液的制備 從保藏的試管斜面挑取孢子于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)72 h，取一定量發(fā)酵液，8 000 r/min離心15 min，其上清液即為粗酶液。

1.2.2酶活力測(cè)定方法 1 mL含殼聚糖0.5%（0.5g/100 mL）的乙酸緩沖液，加入1 mL粗酶液，37℃下保溫30 min，煮沸5 min終止酶反應(yīng)。DNS法測(cè)定還原糖。相對(duì)酶活是以同組試驗(yàn)的最高酶活性為1，其他酶活性與最高酶活的比值即為相對(duì)酶活。剩余酶活是經(jīng)過(guò)一定處理后的酶活/原來(lái)的酶活。

1.2.3發(fā)酵培養(yǎng)的方法 在超凈工作臺(tái)內(nèi)，從保存的試管斜面上挑取孢子，接入5 mL液體種子培養(yǎng)基中，27℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24h。再接入對(duì)應(yīng)裝有45 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，27℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。考察不同搖床轉(zhuǎn)速（0、50、100、150、180 r/min）、不同碳源（蔗糖、葡萄糖、氨基葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、D-甘露醇、粉末性殼聚糖、可溶性殼聚糖）及碳源濃度（0.50%、1.00%、1.50%、2.00%）、不同誘導(dǎo)性碳源（氨基葡萄糖、膠體殼聚糖、粉末殼聚糖）及碳源濃度（0.01%、0.30%、0.50%、0.70%、0.90%）對(duì)海洋真菌MF-08產(chǎn)殼聚糖酶的影響。

1.2.4酶學(xué)性質(zhì)的研究方法

1）最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性：在不同溫度（30、35、40、45、50、55、60、70、80℃）下測(cè)定酶活，以確定最適反應(yīng)溫度。將粗酶液分別置于不同溫度的恒溫水浴中保溫10 min，然后測(cè)定剩余酶活，以確定溫度對(duì)于酶穩(wěn)定性的影響。

2）殼聚糖酶的熱溫度性：將粗酶液分別置于不同溫度（30、40、50、60℃）的恒溫水浴中保溫不同時(shí)間（0、10、20、30、40、50、60 min），然后測(cè)定剩余酶活，以確定殼聚糖酶的熱溫度性。

3）最適反應(yīng)pH：采用不同pH（2.0、3.0、4.0、4.4、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、7.0、8.0）的乙酸-乙酸鈉緩沖液和0，5%殼聚糖底物溶液測(cè)定殼聚糖酶活，以確定其最適反應(yīng)pH。

4）殼聚糖酶oH穩(wěn)定性：將粗酶液與不同pH（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）的廣泛緩沖液以1：1的體積比混合，在4℃下放置6 h，測(cè)定剩余酶活，測(cè)定殼聚糖酶的pH穩(wěn)定性。

5）金屬離子對(duì)殼聚糖酶活性的影響：分別向粗酶液中加入不同的金屬離子（Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Hg²⁺），4℃靜置10 min后，測(cè)定相對(duì)酶活。以不加金屬離子的酶液為對(duì)照，研究不同離子對(duì)殼聚糖酶相對(duì)酶活的影響。

2.結(jié)果與分析

2，1不同搖床轉(zhuǎn)速對(duì)海洋真菌MF-08產(chǎn)殼聚糖酶的影響

由圖1可見(jiàn)，隨著搖床轉(zhuǎn)速的增大，海洋真菌MF-08產(chǎn)出的殼聚糖酶相對(duì)酶活先升高后降低，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min時(shí)，殼聚糖酶相對(duì)酶活最高，因此，選擇搖床的最佳轉(zhuǎn)速為150 r/min。

2.2不同碳源對(duì)海洋真菌MF-08產(chǎn)殼聚糖酶的影響

海洋真菌MF-08在濃度為1.0%的不同碳源條件下培養(yǎng)，經(jīng)搖瓶振蕩培養(yǎng)72 h，測(cè)定殼聚糖酶相對(duì)酶活，結(jié)果如圖2所示。從圖2可知，在碳源濃度為1.0%時(shí)，蔗糖產(chǎn)殼聚糖酶的效果最好，因此選用蔗糖為碳源。

2.3不同碳源濃度對(duì)海洋真菌MF-08產(chǎn)殼聚糖酶的影響

在培養(yǎng)基中添加不同濃度的碳源，以判斷海洋真菌MF-08對(duì)不同碳源的利用情況，確定最佳的碳源及其濃度，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。由圖3可見(jiàn)，碳源濃度為1.5%的蔗糖產(chǎn)殼聚糖酶效果最好，因此選用濃度為1.5%的蔗糖作為碳源。

2.4不同誘導(dǎo)性碳源對(duì)海洋真菌MF-08產(chǎn)殼聚糖酶的影響

采用混合培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)海洋真菌MF-08，在最佳碳源基礎(chǔ)上添加一定量的誘導(dǎo)性碳源，并記錄菌株的產(chǎn)酶情況，結(jié)果如圖4所示。由圖4可見(jiàn)，添加0.01%的氨基葡萄糖進(jìn)行誘導(dǎo)，海洋真菌MF-08產(chǎn)出的殼聚糖酶相對(duì)酶活最高，故采用1.5%的蔗糖添加0.01%的氨基葡萄糖作為最佳碳源。

綜合以上試驗(yàn)，海洋真菌FM-08的搖床培養(yǎng)最佳轉(zhuǎn)速為150 r/min，最佳碳源是1.5%的蔗糖基礎(chǔ)上添加0.01%的氨基葡萄糖。按照最佳條件進(jìn)行發(fā)酵，經(jīng)過(guò)優(yōu)化后海洋真菌FM-08產(chǎn)出的殼聚糖酶相對(duì)酶活由初始酶活0.234 U/mL優(yōu)化為1.769 U/mL，提高了7.56倍。

2.5殼聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)

2.5.1殼聚糖酶反應(yīng)的最適溫度及溫度穩(wěn)定性將殼聚糖酶酶促反應(yīng)體系的溫度分別設(shè)定為不同的值，試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出，反應(yīng)溫度在40℃以下時(shí)，殼聚糖酶相對(duì)酶活隨著溫度的升高而增強(qiáng)，40℃時(shí)相對(duì)酶活最高，反應(yīng)溫度高于40℃后，相對(duì)酶活隨之降低。所以，殼聚糖酶反應(yīng)最適溫度為40℃。

殼聚糖酶在不同溫度下保溫10 min后，測(cè)得的剩余酶活如圖6所示。如圖6可知，溫度低于45℃，殼聚糖酶剩余酶活可保持在85%以上。

殼聚糖酶在30、40、50、60℃下放置不同時(shí)間后測(cè)定剩余酶活，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，在4個(gè)溫度下，30℃下放置的殼聚糖酶剩余酶活基本保持穩(wěn)定，40℃下殼聚糖酶剩余酶活有所下降，50、60℃下殼聚糖酶很快失活。

2.5.2殼聚糖酶的最適反應(yīng)pH 由圖8可以看出，隨著pH的增大，殼聚糖酶相對(duì)酶活先升高后降低，在pH為5.2時(shí)達(dá)到峰值，因此殼聚糖酶的最適合反應(yīng)pH為5.2。

2.5.3 pH對(duì)殼聚糖酶穩(wěn)定性的影響 從圖9可以看出，在4℃下放置6 h，不同pH下殼聚糖酶的剩余酶活隨pH的升高先升高后降低，在pH 4.0-6.0之間剩余酶活相對(duì)穩(wěn)定。

2.5.4金屬離子對(duì)殼聚糖酶活性的影響 由圖10可以看出，Cu²⁺、Fe³⁺和Hg²⁺對(duì)殼聚糖酶相對(duì)酶活具有很明顯的抑制作用，尤其是Hg²⁺可以使殼聚糖酶完全失去活性。其他金屬離子對(duì)殼聚糖酶相對(duì)酶活影響差異不大。

3.小結(jié)

海洋真菌MF-08產(chǎn)殼聚糖酶的最佳碳源為1.5%的蔗糖添加0.01%的氨基葡萄糖誘導(dǎo)性碳源。最佳搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min。在最優(yōu)誘導(dǎo)條件下，海洋真菌MF-08產(chǎn)殼聚糖酶的酶活達(dá)到1.769 U/mL，相比優(yōu)化前提高了7.56倍。海洋真菌MF-08部分酶學(xué)性質(zhì)的研究表明，殼聚糖酶的最適作用溫度和最適反應(yīng)pH分別為40℃和pH 5.2，酶活在pH4.0～6.0范圍內(nèi)和40℃以下相對(duì)穩(wěn)定：Cu²⁺、Fe³⁺和Hg²⁺對(duì)殼聚糖酶相對(duì)酶活具有明顯的抑制作用，尤其是Hg²⁺可以使殼聚糖酶完全失去活性。