蔡育波，曲春華，黃輝，李海成，李榮崗，周偉，陳杰偉，3*

（1廣東省江門市中心醫(yī)院病理科，江門 529000；2中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，廣州 510060；3廣東省食管癌研究所，廣州 510060）

網(wǎng)狀纖維源自于網(wǎng)狀細(xì)胞，主要由III型膠原蛋白交錯(cuò)排列成網(wǎng)狀故稱網(wǎng)狀纖維，屬于疏松結(jié)締組織中的一種成分，因其原纖維上包裹一層特殊的嗜銀糖蛋白，而被稱為嗜銀纖維[1-2]。網(wǎng)狀纖維以網(wǎng)狀支架和上皮基膜的形式廣泛存在于組織中，網(wǎng)狀纖維的增減，斷裂，崩解，都預(yù)示著疾病的發(fā)生和進(jìn)展，因此網(wǎng)狀纖維染色在病理診斷中得到廣泛應(yīng)用[1]。由于改良Gordon-Sweets法中對(duì)網(wǎng)狀纖維結(jié)合的銀氨離子Ag(NH3)2+在水中解離規(guī)律未見文獻(xiàn)報(bào)道，實(shí)踐中網(wǎng)狀纖維染色效果穩(wěn)定性及一致性較差，影響病理診斷；為了改善染色質(zhì)量，提高病理診斷準(zhǔn)確性，本研究通過實(shí)驗(yàn)對(duì)其解離規(guī)律進(jìn)行揭示及驗(yàn)證。

材料與方法

1 材料

收集10例來自江門市中心醫(yī)院病理科的肝臟手術(shù)切除組織石蠟標(biāo)本及中山大學(xué)腫瘤防治中心的146例肝癌病例組織石蠟標(biāo)本。

2 改良Gordon-Sweets法染色

由兩位授權(quán)的中級(jí)病理技術(shù)員嚴(yán)格按照改良Gordon-Sweets法操作規(guī)程進(jìn)行染色，銀氨液新鮮配制，銀氨液經(jīng)驗(yàn)證效果符合診斷要求。將10例肝臟大體切除石蠟標(biāo)本按照4um連續(xù)切片，在65℃烤箱中30min，二甲苯梯度酒精脫蠟至水，接著按照改良Gordon-Sweets法操作規(guī)程進(jìn)行染色：①酸化高錳酸鉀液氧化5min后稍水洗。②2%草酸漂白2min后稍水洗，再用蒸餾水水洗。③2%硫酸鐵氨液媒染5min后蒸餾水稍水洗。④Gordon-Sweets銀氨液作用1min。⑤將連續(xù)切片分別用兩缸蒸餾水進(jìn)行浸洗，兩缸蒸餾水浸洗時(shí)間相同，浸洗總時(shí)間分別為30s、60s、90s、110s、120s、130s、150s、3min、5min、10min、15min、20min。⑥10%中性甲醛液還原1min后流水沖洗10min。⑦核固紅液染胞核10min后稍水洗。⑧脫水透明，中性樹膠封固。以上實(shí)驗(yàn)均在常溫下進(jìn)行。

3 評(píng)價(jià)及驗(yàn)證

由兩位主治病理醫(yī)師獨(dú)立評(píng)分，網(wǎng)狀纖維著色強(qiáng)度按強(qiáng)中弱進(jìn)行評(píng)價(jià)（強(qiáng)為3分，中等強(qiáng)度為2分，弱為1分）；背景采用信噪比評(píng)價(jià)，分為優(yōu)、良、差3個(gè)等級(jí)；根據(jù)病理診斷要求對(duì)染色效果從0—10分進(jìn)行評(píng)分，最差為0分，最好為10分；選擇最佳染色方法（最佳的染色強(qiáng)度對(duì)應(yīng)的方法）對(duì)146例肝癌病例組織進(jìn)行染色，驗(yàn)證該方法的有效性。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS V16.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)資料率比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05差異為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

切片在蒸餾水浸洗30s至2min之間，網(wǎng)狀纖維染色強(qiáng)度不變，均染成棕黑色，不同時(shí)間點(diǎn)均有9例呈強(qiáng)陽，1例呈中等強(qiáng)度，但1min前的切片殘留銀離子較多，信噪比差；隨著時(shí)間增加信噪比逐步改善，在蒸餾水浸洗2min時(shí)網(wǎng)狀纖維染色強(qiáng)，定位準(zhǔn)確，且背景干凈，信噪比最佳；2min后網(wǎng)狀纖維結(jié)合Ag(NH3)2+開始逐步解離，鏡下網(wǎng)狀纖維由棕黑色漸變紫色，15min以后Ag(NH3)2+多完全解離，網(wǎng)狀纖維變成紫紅色，不能滿足病理診斷（圖1、2，表1）。根據(jù)兩位主治病理醫(yī)師盲評(píng)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析顯示：切片在蒸餾水中浸洗2min，評(píng)分均值最高，為9.9±0.31，能夠滿足病理診斷需求（表2）。

圖1 銀氨溶液反應(yīng)后不同蒸餾水浸泡時(shí)間對(duì)網(wǎng)狀纖維染色效果的影響。比例尺，20μmFig. 1 The effect of different distilled water immersion time after silver ammonia solution reaction on the reticular fiber staining. Scale bar, 20μm

表1 Gordon-Sweets網(wǎng)狀纖維染色后蒸餾水浸洗時(shí)間對(duì)染色效果的影響Tab. 1 Effect of distilled water immersion time after Gordon-Sweets reticular fiber staining on the staining result

圖2 銀氨溶液反應(yīng)后銀氨離子在蒸餾水中解離曲線Fig. 2 Dissociation curve of silver ammonium ions in distilled water after reaction in silver ammonia solution

表2 Gordon-sweets網(wǎng)狀纖維染色后蒸餾水浸洗時(shí)間對(duì)病理診斷評(píng)分的影響Tab. 2 Influence of distilled water immersion time on the pathological diagnosis score

在146例的肝癌病例組織切片中采用Gordon-sweets網(wǎng)狀纖維染色后蒸餾水浸洗120s的最佳方法進(jìn)行網(wǎng)狀纖維染色，穩(wěn)定性及一致性好，優(yōu)片率達(dá)到98.6%(144/146)，不但滿足臨床病理診斷，也改善了診斷醫(yī)生閱片的體驗(yàn)。

討 論

網(wǎng)狀纖維有多種染色方法，最常應(yīng)用的是改良Gordon-Sweets法，該方法主要利用酸化高錳酸鉀把網(wǎng)狀纖維表面嗜銀糖蛋白的羥基氧化成醛基，然后在媒染劑的作用下與Ag(NH3)2+結(jié)合，經(jīng)甲醛還原后變成黑色的金屬銀，把網(wǎng)狀纖維染成黑色[1]。有研究顯示：銀氨液配制有效與否是網(wǎng)狀纖維染色的成功的關(guān)鍵，因此銀氨液需新鮮配制，并及時(shí)使用，才能保證網(wǎng)狀纖維染色質(zhì)量[3]。同時(shí)由于自來水中含有氯離子可以與Ag(NH3)2+反應(yīng)生成氯化銀沉淀，影響染色質(zhì)量，因此在銀氨液反應(yīng)后應(yīng)用蒸餾水進(jìn)行沖洗[4,5]。現(xiàn)有理論上并沒有明確蒸餾水水洗時(shí)間，導(dǎo)致病理技術(shù)從業(yè)者在行網(wǎng)狀纖維染色時(shí)，個(gè)體化差異明顯，染色質(zhì)量不穩(wěn)定，批間差明顯，影響病理的鑒別診斷。

本研究嚴(yán)格按照改良Gordon-Sweets法的要求進(jìn)行配制銀氨液，并驗(yàn)證其有效性，及時(shí)運(yùn)用于本實(shí)驗(yàn)中，試劑的有效性保證了本實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量。研究顯示氫氧化二氨合銀是一種絡(luò)合物，能夠溶解于水，可完全電離[6]。根據(jù)氫氧化二氨合銀能在水中可完全電離的特性，本實(shí)驗(yàn)在銀氨液反應(yīng)完后設(shè)置了不同的水洗時(shí)間并多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了網(wǎng)狀纖維結(jié)合的

Ag(NH3)2+在蒸餾水中的解離規(guī)律，切片經(jīng)銀氨液反應(yīng)完后在蒸餾水中浸洗2min時(shí)不但能獲得最佳的染色效果，強(qiáng)度合適，信噪比佳，可以滿足臨床病理診斷，也提高了病理診斷醫(yī)生的閱片的體驗(yàn)；而在蒸餾水中浸洗2min后，網(wǎng)狀纖維結(jié)合的Ag(NH3)2+開始逐步解離，網(wǎng)狀纖維由棕黑色漸變成紫紅色，直到15min至20min時(shí)銀氨離子完全解離，網(wǎng)狀纖維變成深紫紅色，不能滿足病理診斷。本研究初步揭示了網(wǎng)狀纖維結(jié)合的Ag(NH3)2+在蒸餾水中的解離規(guī)律，為網(wǎng)狀纖維染色實(shí)踐操作提供了規(guī)范化的參考。

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)反復(fù)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)了改良Gordon-Sweets法中對(duì)網(wǎng)狀纖維結(jié)合的Ag(NH3)2+在水中解離規(guī)律，有效地指導(dǎo)了網(wǎng)狀纖維的染色，解決了實(shí)踐中由于銀氨液反應(yīng)后水洗時(shí)間的不確定導(dǎo)致網(wǎng)狀纖維染色效果穩(wěn)定性較差，個(gè)體化差異明顯的問題，提高網(wǎng)狀纖維染色的穩(wěn)定性及一致性，值得在臨床實(shí)踐中進(jìn)一步推廣應(yīng)用。