王冉冉，許品品，朱丹，姚希

（連云港市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，連云港222061）

食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是指食管鱗狀上皮異型增生導(dǎo)致的食管惡性腫瘤疾病。近年來，隨著食管切除術(shù)、放化療、分子靶向治療技術(shù)的發(fā)展，ESCC患者的近期預(yù)后得到明顯改善。但由于ESCC具有侵襲性強(qiáng)等特點(diǎn)，患者遠(yuǎn)期預(yù)后仍不理想[1]。目前，ESCC的具體發(fā)病機(jī)制仍不明確，但有研究表明，ESCC的發(fā)生、進(jìn)展與多種致癌基因、抑癌基因及其產(chǎn)物的表達(dá)或結(jié)構(gòu)異常密切相關(guān)[2,3]。三重基序蛋白36（tripartite motif-containing protein 36，TRIM36）可參與機(jī)體固有免疫應(yīng)答，屬于一類E3泛素連接酶和免疫調(diào)節(jié)蛋白，由RING鋅指結(jié)構(gòu)、B-box結(jié)構(gòu)和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域構(gòu)成[4]。人源TRIM36作為TRIM家族的一員，基因位于染色體5q22.3[5]。據(jù)報(bào)道，TRIM36是一種微管結(jié)合蛋白，在胚胎形成、頂體反應(yīng)、染色體分離和細(xì)胞周期進(jìn)程中起著重要作用[5,6]。最近的一項(xiàng)研究指出，TRIM36作為雄激素受體基因通過調(diào)控癌細(xì)胞凋亡相關(guān)途徑在前列腺癌中扮演抑癌基因的作用[7]。也有研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中TRIM36高表達(dá)與放射敏感性相關(guān)[8]。然而，TRIM36在ESCC患者中的生物學(xué)作用尚不清楚。本研究主要探討TRIM36表達(dá)水平與ESCC患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，旨在為ESCC患者臨床治療及預(yù)后評估提供參考。

對象與方法

1 研究對象

76例ESCC患者病理標(biāo)本為連云港市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科和病理科2016年1月至2017年12月收集，癌旁組織取自距腫瘤邊緣＞5cm區(qū)域正常食管黏膜。納入標(biāo)準(zhǔn)：鱗癌；TNM分期為I期、II期、III期；術(shù)前均未接受放、化療和靶向藥物治療；無其他器官惡性腫瘤。其中，男性48例，女性28例；年齡范圍32～85歲，中位年齡56歲，＜60歲42例，≥60歲34例；體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）＜25kg/m235例，≥25kg/m241例；吸煙史32例；飲酒史21例；分化程度低分化、中分化、高分化分別為13例、18例、45例；腫瘤大?。?cm 41例，≥5cm 35例；TNM分期I期、II期、III期分別為18例、22例、36例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例。

2 TRIM36 mRNA表達(dá)水平測定

按照TRIZOL試劑盒（DP419，TIANGEN，北京）說明書要求提取ESCC組織及癌旁組織總RNA；參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（FP314，TIANGEN，北京）說明書要求將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，－20℃冰箱保存待用。以GAPDH為內(nèi)參基因，引物序列為：上游5’-AATCCCATCACCATCTTC-3’，下游5’-AGGCTGTTGTCATACTTC-3’；TRIM36引物序列為：上 游5’-CGTCGGTCCTCCAGAGTTTGTG-3’，下游5’-GTGGCAAGTTCCGTCGTCTTCC-3’。根據(jù)SYBR@ Premix Ex TaqTM II試劑盒（RR820A，TaKaRa，大連）說明書進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)。以 2－△△Ct相對定量法計(jì)算TRIM36 mRNA相對表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

3 TRIM36蛋白表達(dá)水平測定

分別取30mg ESCC及癌旁組織與300μl蛋白裂解液（組織與裂解液比例100:1）混合后加入研磨器中，研磨完全后至于冰上，30min使其完全裂解，離心機(jī)冷卻至4℃后20000r/min離心30min，取上清，根據(jù)BCA蛋白濃度測定試劑盒（福州邁新生物技術(shù)公司）的說明書測定提取組織樣本的蛋白濃度。取30μg蛋白行10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，室溫5%脫脂牛奶密封1～2h，加入稀釋比例為1:1000的兔抗人TRIM36多克隆抗體（美國abcam公司）和GAPDH（美國Abcam公司）單克隆抗體，4℃孵育過夜，充分洗滌后，加入稀釋比例為1:1000的HRP山羊抗兔二抗（中國碧云天公司），室溫孵育1h，充分洗膜后，用電化學(xué)發(fā)光試劑盒（以色列BioInd公司）處理后顯影，觀察條帶，應(yīng)用GIS軟件獲得蛋白條帶吸光度（A）值。以GAPDH作為內(nèi)參，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶A值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。

4 TRIM36免疫組織化學(xué)染色

ESCC組織及癌旁組織經(jīng)10%中性甲醛固定、乙醇脫水、石蠟包埋并切片（4μm），根據(jù)CS-X14392免疫組織化學(xué)試劑盒（上海莼試生物技術(shù)有限公司）說明書進(jìn)行TRIM36免疫組織化學(xué)染色：檸檬酸緩沖液修復(fù)20min，3%雙氧水封閉20min，山羊血清封閉20min，加入兔抗人TRIM36多克隆抗體（1:1000；美國Abcam公司）4℃孵育過夜。PBS清洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG二抗（1:1000；福州邁新生物技術(shù)公司），室溫孵育60min，PBS清洗后加入DAB顯色液（福州邁新生物技術(shù)公司）顯色6～7min，蘇木精復(fù)染后封片觀察。TRIM36表達(dá)量判定方法：40倍物鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，根據(jù)染色強(qiáng)度和染色陽性率評定。其中：無顯色為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分；陽性細(xì)胞≤5%記0分，陽性細(xì)胞6%～25%記1分，陽性細(xì)胞26%～75%記2分，陽性細(xì)胞＞75%記3分。兩者乘積＜3分為TRIM36低表達(dá)，≥3分為TRIM36高表達(dá)[9]。

5 隨訪

通過電話、微信、門診復(fù)查等方式對ESCC患者進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間截止于2020年12月30日。記錄所有患者5年無瘤生存時(shí)間和總體生存時(shí)間，繪制Kaplan-Meier生存曲線。隨訪時(shí)間3～69月，平均（42.36±14.67）月。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。通過單因素、多因素Cox回歸模型評估影響ESCC患者預(yù)后的因素。通過Kaplan-Meier生存分析TRIM36水平與ESCC患者5年無瘤生存率和總體生存率的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 食管鱗狀細(xì)胞癌組織中TRIM36低表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色顯示：在76例ESCC標(biāo)本中，51例TRIM36免疫反應(yīng)性降低，25例TRIM36免疫反應(yīng)性增強(qiáng)（圖1）。Western blot檢測和qRT-PCR分析顯示，ESCC組中TRIM36蛋白水平和mRNA表達(dá)量均顯著低于癌旁對照組（圖2，表1）。

圖1 ESCC組織及癌旁組織中TRIM36表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測。A，ESCC組織中低TRIM36免疫反應(yīng)性；B，ESCC組織中高TRIM36免疫反應(yīng)性；C，癌旁組織中高TRIM36免疫反應(yīng)性；比例尺，25μmFig.1 Immunohistochemical examination of TRIM36 in ESCC and adjacent tissues. A, low TRIM36 immunoreactivity in ESCC tissues; B, high TRIM36 immunoreactivity in ESCC tissues; C, high TRIM36 immunoreactivity in adjacent tissues; scale bar, 25μm

圖2 ESCC組織及癌旁組織中TRIM36表達(dá)的Western blot檢測。ParaCa，癌旁組織Fig.2 Western blot detection of TRIM36 in ESCC and paracancerous tissues. ParaCa, paracancerous tissue

表1 ESCC和癌旁組織中TRIM36蛋白和mRNA表達(dá)水平比較Tab.1 Comparison of the expression of TRIM36 protein and mRNA in ESCC and adjacent tissues

2 ESCC組織中TRIM36表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

應(yīng)用χ2檢驗(yàn)分析顯示，ESCC組織中TRIM36低表達(dá)患者，腫瘤大小≥5cm患者比例、TNM分期III期患者比例、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者比例、死亡患者比例均升高，TRIM36表達(dá)水平與性別、年齡、BMI、吸煙史、飲酒史、分化程度無相關(guān)性（表2）。

表2 ESCC組織中TRIM36表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系Tab.2 Relationship between the expression of TRIM36 and the clinicopathological characteristics of ESCC

3 影響ESCC患者預(yù)后的單因素和多因素Cox回歸分析

單因素Cox回歸分析和多因素Cox回歸分析均顯示，低分化、TNM分期III期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TRIM36低表達(dá)是影響ESCC患者5年無瘤生存率和5年總體生存率的危險(xiǎn)因素（表3，表4）。

表3 影響ESCC患者預(yù)后的單因素Cox回歸分析Tab.3 Univariate Cox regression analysis on prognosis of ESCC patients

表4 影響ESCC患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析Tab.4 Multivariate Cox regression analysis on prognosis of ESCC patients

因素 5年無瘤生存率 5年總體生存率HR 95%CI P HR 95%CI P腫瘤大小＜5cm 1.000 1.000≥5cm 1.254 0.811～1.659 0.311 1.043 0.658～1.449 0.178淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是1.000 1.000否0.887 0.641～0.990 0.014 0.872 0.600～0.981 ＜0.001 TRIM36表達(dá)水平低1.000 1.000高0.855 0.611～0.982 ＜0.001 0.831 0.572～0.971 ＜0.001

4 ESCC組織中TRIM36表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier生存分析顯示，ESCC組織中TRIM36低表達(dá)組患者5年無瘤生存率、總體生存率均低于TRIM36高表達(dá)組（圖3）。

圖3 ESCC組織中TRIM36表達(dá)水平與患者5年無瘤生存率和總體生存率的關(guān)系Fig. 3 Relationship between the TRIM36 expression in ESCC tissues and the 5 years disease-free survival rate and overall survival rate of ESCC patients

討 論

近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)TRIM家族參與多種生物過程，它既可以維持機(jī)體細(xì)胞生長分化、細(xì)胞骨架的重構(gòu)、膜修復(fù)、信號通路和細(xì)胞凋亡等正常生理功能，還具有抗HIV感染、抗流行性乙型腦炎病毒感染、抗丙型肝炎病毒感染等抗病毒功能[10]。TRIM36屬于TRIM家族成員，除具有RING鋅指結(jié)構(gòu)、B-box結(jié)構(gòu)和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域外，還包含羧基末端的纖連蛋白Ⅲ、雙特異性蛋白激酶spla和蘭尼堿受體[11]。有研究指出，TRIM36蛋白以位移的方式調(diào)控核受體，并通過參與原癌基因和抑癌基因?qū)?yīng)蛋白的轉(zhuǎn)錄后修飾，在腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡過程中發(fā)揮重要作用[12,13]。本研究從mRNA、蛋白相對表達(dá)量方面入手，選擇與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)的TRIM36基因，分析TRIM36表達(dá)水平與ESCC患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。

TRIM36表達(dá)水平與許多惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后存在相關(guān)性。Olsson等人通過生物信息學(xué)分析鑒定神經(jīng)母細(xì)胞瘤相關(guān)的異常甲基化差異表達(dá)基因的研究發(fā)現(xiàn)，TRIM36可作為神經(jīng)母細(xì)胞瘤發(fā)病相關(guān)的異常甲基化差異表達(dá)的生物標(biāo)志物，研究表明TRIM36與神經(jīng)母細(xì)胞瘤發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān)[14]。Kimura等人的研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)TRIM36可抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，siRNA敲除TRIM36可抑制前列腺癌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移，微陣列分析顯示TRIM36過表達(dá)顯著上調(diào)了細(xì)胞凋亡相關(guān)通路，研究提示，TRIM36的高表達(dá)與前列腺癌患者預(yù)后有關(guān)，TRIM36通過抑制細(xì)胞增殖和遷移、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抑瘤作用[15]。Man等人的研究指出，胃癌組織中TRIM36與臨床病理特征無相關(guān)性，但接受放療的TRIM36高表達(dá)患者的總生存率有所提高，TRIM36可能是影響胃癌放療患者臨床預(yù)后的重要因素，可能被認(rèn)為是潛在的放射敏感性標(biāo)志物[8]。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，ESCC組織中TRIM36的表達(dá)量顯著下調(diào)，采用癌癥基因組圖譜的ESCC全基因組RNA測序數(shù)據(jù)和基因集富集分析方法得出TRIM36的表達(dá)與β 鏈接素通路呈負(fù)相關(guān)，Kaplan-Meier和Log-rank檢驗(yàn)表明，TRIM6的低表達(dá)和β鏈接素的高表達(dá)與ESCC患者的總體生存率低相關(guān)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，ESCC組中TRIM36 mRNA和蛋白相對表達(dá)量均顯著低于癌旁對照組，這或許表明TRIM36表達(dá)水平與ESCC進(jìn)展存在密切聯(lián)系。本研究評估了TRIM36蛋白表達(dá)與ESCC患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)ESCC組織中TRIM36表達(dá)水平與腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、生命狀態(tài)有關(guān)，這或許提示TRIM36表達(dá)的下調(diào)影響了ESCC細(xì)胞生長、侵襲及分化等一系列生物學(xué)行為。Liang等人的研究證實(shí)，TRIM36通過抑制MAPK/ERK磷酸化途徑延緩前列腺癌細(xì)胞周期進(jìn)程、抑制細(xì)胞增殖[7]。Miyajima等人的研究則指出，TRIM36與著絲粒蛋白CENP-H相互作用，延緩細(xì)胞周期進(jìn)程[17]。此外，組織中低表達(dá)TRIM36的患者表現(xiàn)出較差的預(yù)后，多因素分析顯示組織中TRIM36表達(dá)、TNM分期和分化程度對預(yù)測ESCC患者預(yù)后有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示TRIM36可能是臨床上預(yù)測ESCC患者預(yù)后的一個(gè)潛在指標(biāo)。然而，由于TRIM36在ESCC中作用的相關(guān)研究和權(quán)威報(bào)告較少，其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探索和驗(yàn)證。

總之，TRIM36在ESCC組織中低表達(dá)，與患者腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，組織中TRIM36低表達(dá)的ESCC患者預(yù)后差。TRIM36在ESCC中的功能和機(jī)制研究或許為揭示ESCC發(fā)生機(jī)制提供新思路，并有望成為ESCC患者腫瘤治療的新靶點(diǎn)。