王娣，陳娟，魯文靜，楊智峰 (陜西省中醫(yī)藥研究院，西安 710003)

熄風(fēng)止動(dòng)顆粒由天麻、石決明、菊花、鉤藤、全蝎、青葙子、佛手、辛夷、金果欖、胖大海、片姜黃、制白附子、玫瑰花、龍骨共14味中藥組成，具有養(yǎng)陰平肝、鎮(zhèn)靜祛風(fēng)、滌痰通絡(luò)的功效，為一種臨床經(jīng)驗(yàn)方，主要用于治療兒童多動(dòng)綜合征，經(jīng)臨床多年驗(yàn)證療效顯著、副作用小。該方常以湯劑應(yīng)用于臨床，而湯劑存在服用劑量大、不便于攜帶及長期保存的弊端。顆粒劑具有載藥量大、穩(wěn)定性好、便于攜帶及保存的優(yōu)點(diǎn)[1]，可彌補(bǔ)湯劑的不足，因此本研究擬將該方開發(fā)為熄風(fēng)止動(dòng)顆粒。目前，中藥提取工藝的方法主要有正交試驗(yàn)法、均勻設(shè)計(jì)法、響應(yīng)面設(shè)計(jì)法等，其中正交試驗(yàn)法最常用。正交試驗(yàn)受限于因素水平的設(shè)定，篩選出來的最佳參數(shù)僅限于已設(shè)水平的組合，有一定局限性，而人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)建?？梢源蚱七@一局限[2]。ANN是以生物學(xué)中樞神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)為基本原理，以網(wǎng)絡(luò)拓?fù)渲R(shí)為理論基礎(chǔ)，模擬人腦的神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)復(fù)雜信息的處理機(jī)制的一種數(shù)學(xué)模型，近年來在中藥提取工藝方面應(yīng)用廣泛，其中反向傳播人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(BP-ANN)的應(yīng)用最廣泛[3-4]。因此，本試驗(yàn)以天麻素含量和干膏率的綜合評(píng)分為指標(biāo)，在正交試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上聯(lián)合BP-ANN對(duì)熄風(fēng)止動(dòng)顆粒的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳提取條件，為熄風(fēng)止動(dòng)顆粒的工業(yè)化生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

Agilent 1260系列高效液相色譜儀，配置VWD檢測(cè)器和Agilent Chem Station工作站(美國安捷倫科技有限公司)；電熱套(北京科偉永興儀器有限公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(中外合資重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；KQ-400DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BT25S型電子分析天平、BS210S型電子分析天平(賽多利斯天平有限公司)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(北京科偉永興儀器有限公司)。

1.2 藥物與試劑

天麻、石決明、菊花、鉤藤、全蝎、青葙子、佛手、辛夷、金果欖、胖大海、片姜黃、制白附子、玫瑰花、龍骨均購自廣州致信藥業(yè)有限公司，均符合《中國藥典》2015年版有關(guān)規(guī)定，經(jīng)陜西省中醫(yī)藥研究院中藥研究所楊智峰研究員鑒定均為正品；天麻素對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)110807-201809，供含量測(cè)定用)；甲醇(HPLC級(jí)，F(xiàn)isher)；磷酸(分析純，成都市科龍化工試劑廠)；水為純化水。

2 方法

2.1 天麻素含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 Promosil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm， 5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-0.05%磷酸(3∶97)，流速0.8 mL/min，檢測(cè)波長220 nm，理論塔板數(shù)按天麻素峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱定天麻素對(duì)照品2.1 mg至10 mL容量瓶，甲醇定容，再精密量取2 mL至10 mL容量瓶，定容，得含天麻素0.042 mg/mL的溶液。另精密稱定天麻素對(duì)照品1.44 mg至10 mL容量瓶，甲醇定容，得含天麻素0.144 mg/mL的溶液。

2.1.3 供試品溶液制備 稱取熄風(fēng)止動(dòng)顆粒處方量藥材共9份，按照正交試驗(yàn)表各條件回流提取，提取液用100目篩網(wǎng)過濾，合并提取液。精密吸取所得提取液25 mL置于烘箱中，以60 ℃烘干，加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.4 陰性對(duì)照品溶液制備 按熄風(fēng)止動(dòng)顆粒處方量稱取除天麻以外的其他藥材，按11倍加水量，回流提取1.0 h，提取2次，提取液用100目篩網(wǎng)過濾，合并提取液。精密吸取所得提取液25 mL置于烘箱中，以60 ℃烘干，加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.5 線性關(guān)系考察 精密吸取天麻素對(duì)照品溶液(0.042 mg/mL)，分別進(jìn)樣1、5、10、15、20、25 μL，測(cè)定峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，實(shí)際進(jìn)樣量(X，μg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=2 811.9X-2.154 3(r=0.999 8)。結(jié)果表明，天麻素進(jìn)樣量在0.042～1.050 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.6 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取天麻素對(duì)照品溶液(0.042 mg/mL)10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，得天麻素峰面積的RSD為0.069%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別于供試品溶液放置0、2、4、6、8、10、12 h時(shí)，精密吸取10 μL進(jìn)樣測(cè)定，得天麻素峰面積的RSD為1.12%，表明供試品溶液12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同批樣品6份，制備供試品溶液，精密吸取10 μL進(jìn)樣測(cè)定，得天麻素峰面積的RSD為1.15%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的熄風(fēng)止動(dòng)顆粒共6份，每份2.0 g，分別置于10 mL容量瓶中，精密加入0.144 mg/mL的天麻素溶液0.8、1.0、1.2 mL各2份，定容，按本方法測(cè)定，得天麻素平均回收率為98.66%，RSD為1.46%，說明該方法回收率良好。見表1。

表1 熄風(fēng)止動(dòng)顆粒中天麻素含量測(cè)定的加樣回收率實(shí)驗(yàn)

2.2 干膏率測(cè)定

稱取熄風(fēng)止動(dòng)顆粒處方量藥材共9份，按照正交試驗(yàn)表各條件回流提取，提取液用100目篩網(wǎng)過濾，合并提取液。分別量取50 mL放入已干燥至恒重的蒸發(fā)皿內(nèi)，80 ℃烘箱烘干，于105 ℃烘箱中干燥3 h，取出，置于用凡士林封口的干燥器中冷卻30 min，精密稱質(zhì)量，再于105 ℃烘箱中干燥30 min，再置于用凡士林封口的干燥器中冷卻30 min，精密稱質(zhì)量，恒重后計(jì)算干膏率。

2.3 藥材吸水率實(shí)驗(yàn)

稱取熄風(fēng)止動(dòng)顆粒處方量藥材，加水800 mL浸泡 1 h，回流提取 1 h，濾過，量取傾出溶液，計(jì)算藥材吸水率為339%。因此，考察提取工藝時(shí)，第1次提取應(yīng)該多加水3.4倍量(按干藥材質(zhì)量計(jì)，下同)。

3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

采用L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)熄風(fēng)止動(dòng)顆粒提取工藝，以天麻素含量與干膏率的綜合評(píng)分為指標(biāo)，對(duì)提取工藝的提取次數(shù)、加水量及提取時(shí)間等三個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素水平、試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2、表3。由表3可知，提取因素對(duì)綜合評(píng)分[綜合評(píng)分=干膏率(%)×4+天麻素含量(mg)]的影響大小為提取次數(shù)>提取時(shí)間>加水量；由表2可知，提取次數(shù)的影響差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，應(yīng)選擇A3B3D2，最佳提取工藝確定為處方量藥材加水浸泡1 h后，回流提取3次，第1次提取加水14.4倍量，第2、3次提取加水11倍量，每次提取時(shí)間1 h。

表2 熄風(fēng)止動(dòng)顆粒提取工藝正交試驗(yàn)因素水平

表3 熄風(fēng)止動(dòng)顆粒提取工藝正交試驗(yàn)及直觀分析

4 BP-ANN建模與應(yīng)用

4.1 BP-ANN模型的建立

隨機(jī)選取9組正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)中的7組為訓(xùn)練樣本，其余2組為測(cè)試樣本，利用SPSS MODELER 18.0軟件建立BP-ANN模型，其中輸入層的3個(gè)神經(jīng)元設(shè)定為提取次數(shù)、加水量、提取時(shí)間，輸出層的1個(gè)神經(jīng)元設(shè)定為綜合評(píng)分，進(jìn)行訓(xùn)練模擬。得到最優(yōu)模型隱含層條件為隱含層1層，神經(jīng)元10個(gè)。結(jié)果顯示，BP-ANN模型預(yù)測(cè)所得9組預(yù)測(cè)值與正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)值的平均相對(duì)誤差為0.783%，擬合系數(shù)為0.998，表示該BP-ANN模型訓(xùn)練與預(yù)測(cè)精度較好，滿足試驗(yàn)要求。見表4。

表4 正交試驗(yàn)與BP-ANN模型預(yù)測(cè)比較

4.2 BP-ANN模型的仿真優(yōu)化

將原有正交試驗(yàn)中的因素水平增加并進(jìn)行任意組合，正交試驗(yàn)中提取次數(shù)1～3次，設(shè)為3個(gè)水平；提取時(shí)間為30～90 min，每間隔15 min設(shè)一個(gè)水平，共5個(gè)水平；加水量為7～11倍加水量，每間隔0.25倍加水量設(shè)一個(gè)水平，共17個(gè)水平。新增的因素水平任意組合可得到135種不同的組合，將這135種組合的數(shù)據(jù)引入輸入層，采用BP-ANN模型進(jìn)行仿真優(yōu)化，可得到輸出層的135個(gè)綜合評(píng)分，再進(jìn)行最佳提取工藝的篩選，最終確定熄風(fēng)止動(dòng)顆粒的最優(yōu)提取工藝為處方量藥材加水浸泡1.0 h后，回流提取2次，第1次提取加14.4倍量水，第2次提取加11倍量水，每次提取時(shí)間75 min，預(yù)測(cè)得到對(duì)應(yīng)綜合評(píng)分為142.15。

4.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

正交試驗(yàn)優(yōu)化的提取條件為處方量藥材加水浸泡 1 h 后，回流提取3次，第1次提取加水14.4倍量，第2、3次提取加水11倍量，每次提取時(shí)間1 h；BP-ANN模型優(yōu)化的提取條件為處方量藥材加水浸泡1 h后，回流提取2次，第1次提取加水14.4倍量，第2次提取加水11倍量，每次提取時(shí)間75 min。分別進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，平行 3次，結(jié)果顯示，BP-ANN模型優(yōu)化的提取工藝綜合評(píng)分高于正交試驗(yàn)優(yōu)化的提取工藝，不但可提高提取液中天麻素的含量、節(jié)約溶劑用量、縮短提取時(shí)間，而且工藝穩(wěn)定、重復(fù)性良好。見表5。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

5 討論

正交試驗(yàn)為一種多水平多因素的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法，特點(diǎn)為均勻分散、整齊可比，廣泛應(yīng)用于中藥提取工藝的研究中，但其篩選因素水平和最佳參數(shù)組合僅限于實(shí)驗(yàn)已設(shè)水平的組合，優(yōu)選結(jié)果不會(huì)超越所取水平的范圍，有一定局限性，而這一局限可以通過人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模得以突破[5-7]。ANN是模擬生物神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)外界復(fù)雜信息處理反饋機(jī)制的數(shù)學(xué)模型，包括徑向基網(wǎng)絡(luò)、BP-ANN、自組織網(wǎng)絡(luò)、反饋網(wǎng)絡(luò)等，其中BP-ANN的應(yīng)用最廣泛，由接受信息的輸入層、輸出信息的輸出層和中間隱含層中大量的神經(jīng)元及相互連接傳遞的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)組成，具有強(qiáng)大的自主學(xué)習(xí)、聯(lián)想儲(chǔ)存能力、高效尋求優(yōu)化解能力和非線性問題擬合能力，鑒于這些優(yōu)勢(shì)，BP-ANN在中藥提取工藝等許多研究領(lǐng)域均得到了廣泛地應(yīng)用[8-11]。因此，本研究將正交試驗(yàn)與BP-ANN聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行熄風(fēng)止動(dòng)顆粒提取工藝的研究。

本研究首先通過傳統(tǒng)的正交試驗(yàn)獲得熄風(fēng)止動(dòng)顆粒提取工藝的數(shù)據(jù)，然后利用正交試驗(yàn)的數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練樣本數(shù)據(jù)建立BP-ANN的數(shù)學(xué)模型，再使用已建好的模型進(jìn)一步優(yōu)化熄風(fēng)止動(dòng)顆粒提取工藝，在不增加實(shí)驗(yàn)工作量的基礎(chǔ)上獲取理想的提取工藝。研究結(jié)果顯示，正交試驗(yàn)聯(lián)合BP-ANN得到熄風(fēng)止動(dòng)顆粒最佳提取工藝為處方量藥材加水浸1 h后，回流提取2次，第1次提取加水14.4倍量(按干藥材質(zhì)量計(jì))，第2次提取加水11倍量，每次提取75 min，不但可提高提取液中天麻素的含量，而且節(jié)約溶劑用量、縮短提取時(shí)間。

本研究中由于提取時(shí)間、提取溫度、溶劑用量等因素的單位不相同，數(shù)量級(jí)相差較大。因此，本研究在使用正交試驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行BP-ANN建模前，將正交試驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行了歸一化處理，使數(shù)據(jù)處于0～1范圍內(nèi)，縮小因數(shù)量級(jí)差異造成的實(shí)驗(yàn)誤差。同時(shí)，與任何一種數(shù)學(xué)模型一樣，BP-ANN也存在模型結(jié)構(gòu)和函數(shù)算法等帶來的缺陷，如模型結(jié)構(gòu)中隱含層的層數(shù)和每層神經(jīng)元的數(shù)量不僅會(huì)影響輸出層的結(jié)果，還會(huì)延長訓(xùn)練時(shí)間、出現(xiàn)過度擬合等問題，因此在分析處理具體數(shù)據(jù)時(shí)，應(yīng)多次嘗試選擇合適的模型結(jié)構(gòu)和函數(shù)算法，并結(jié)合具體實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)加以優(yōu)化分析，建立更適合的BP-ANN模型。