付圣麟　方　亮　蘇廣林　劉　斌

虎奶菇不同栽培方案及其子實(shí)體抗氧化研究

付圣麟1,2方亮1,2蘇廣林1,2劉斌1,2

（1.廣西大學(xué)食用菌研究所廣西南寧530005；2.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院應(yīng)用微生物研究所廣西南寧530005）

文章旨在探究不同木屑搭配菌草后對(duì)虎奶菇產(chǎn)量及其子實(shí)體抗氧化的影響。選取苦楝木屑、松木屑和杉木屑3種木屑，共設(shè)置3種不同栽培配方：A.苦楝木屑52%、菌草26%、麩皮20%、石灰1%、石膏1%；B.松木屑52%、菌草26%、麩皮20%、石灰1%、石膏1%；C.杉木屑52%、菌草26%、麩皮20%、石灰1%、石膏1%。測(cè)定不同配方下的菌包產(chǎn)量、子實(shí)體活性物質(zhì)含量及抗氧化活性。試驗(yàn)結(jié)果表明：配方B的子實(shí)體產(chǎn)量最高，達(dá)到160.13 g/包；配方B栽培的子實(shí)體的多糖、三萜和多酚含量均最高，分別為21.84 mg/g、14.76 mg/g、4.37 mg/g；配方B栽培的子實(shí)體的醇提物對(duì)DPPH的清除能力最強(qiáng)，7 mg/mL醇提物的清除率可達(dá)81.50%；配方A栽培的子實(shí)體的醇提物對(duì)ABTS的清除能力最強(qiáng)，1.0 mg/mL醇提物的清除率可達(dá)87.69%。

虎奶菇；木屑；栽培；產(chǎn)量；抗氧化

虎奶菇[(Fr.) Sing]，別名菌核側(cè)耳、茯苓側(cè)耳、虎乳菌，為木腐生真菌，屬擔(dān)子菌亞門(mén)層菌綱傘菌目側(cè)耳科側(cè)耳屬，具有重要的藥用價(jià)值，其耐高溫，主要種植在熱帶和亞熱帶地區(qū)，一般能在木樁或者土壤內(nèi)的腐木上生長(zhǎng)[1]。該菌也是一種子實(shí)體和菌核都能食用的珍稀食藥用菌[2]。

食用菌具有非常高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用保健的藥理功效，食用菌多糖在抗癌方面具有一定的優(yōu)越功效[3]。此外，還能降低某些物質(zhì)誘發(fā)腫瘤的發(fā)生率，并對(duì)多種化療藥物具有增效效應(yīng)[4]。

目前側(cè)耳類食用菌栽培多使用棉籽殼培養(yǎng)基，而貴州省農(nóng)作物品質(zhì)資源研究所開(kāi)發(fā)的松杉木鋸末發(fā)酵熟料竹蓀脫袋培養(yǎng)基解決了農(nóng)業(yè)廢料的污染問(wèn)題。研究發(fā)現(xiàn)，利用鋸末的培養(yǎng)基產(chǎn)量與效率較低，且開(kāi)發(fā)難度大[5]，尤其針對(duì)針葉木材廢料在食用菌栽培培養(yǎng)基的開(kāi)發(fā)較少[6]。其樹(shù)脂道中分泌樹(shù)脂酸等是針葉樹(shù)防御蟲(chóng)害及其共生微生物入侵的重要途徑[7]，所以目前利用木屑的培養(yǎng)基中幾乎都是闊葉木材[8]。針葉木屑作為許多木材加工廠的副產(chǎn)物，是一種可以利用起來(lái)的潛在資源[9]。

本研究以不同針葉木屑為主料設(shè)置栽培配方，對(duì)其產(chǎn)量和活性物質(zhì)進(jìn)行了初步研究，篩選出適宜的木屑栽培虎奶菇，以期為木屑的有效利用和虎奶菇的栽培提供參考方向。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與材料

試驗(yàn)所用菌株采自廣西壯族自治區(qū)來(lái)賓市經(jīng)分子鑒定與形態(tài)鑒定確定種屬，現(xiàn)保存于廣西大學(xué)微生物研究所。

木屑來(lái)源于南寧市木材加工市場(chǎng)，麩皮等發(fā)酵粗料均來(lái)自廣西大學(xué)微生物研究所菌種廠；試劑包括硫酸鈣等常用試劑，均購(gòu)于成都科龍化工有限公司；儀器有SYW-2食用菌自動(dòng)裝袋機(jī)（隨州智宸機(jī)械有限公司）、KQ-300GDV恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器（昆山舒美儀器有限公司）等。

1.2 菌種培養(yǎng)基

母種培養(yǎng)基為PDA，即200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、20 g瓊脂、1 g磷酸二氫鉀、0.5 g硫酸鎂，加水定容至1 000 mL，pH自然。

1.3 栽培方案設(shè)計(jì)

不同栽培方案設(shè)計(jì)如表1。

表1虎奶菇栽培料配方表

配方編號(hào)苦楝木屑/%松木屑/%杉木屑/%菌草/%麩皮/%生石灰/%石膏/% ABC52———52———52262626202020111111

1.4 栽培管理

按照上述表1配方，將配料拌勻，控制含水量為60%，攪拌均勻后裝入15 cm×33 cm的聚丙烯袋，每袋裝料重量為500 g（濕重），用棉花塞緊封口，貼好標(biāo)簽，放入高壓滅菌鍋121 ℃滅菌2 h。每個(gè)配方設(shè)置10個(gè)重復(fù)。

將接種好的菌袋放入栽培菇房進(jìn)行菌絲培養(yǎng)，培養(yǎng)期間溫度設(shè)置為25 ℃～28 ℃，濕度保持在70%～80%。

待菌絲長(zhǎng)滿菌袋后，即可開(kāi)袋放入出菇菇房進(jìn)行出菇，出菇期間保持菇房溫度為28 ℃，濕度為80%，每天間斷日光燈光照3 h～6 h。

1.5 多糖類化合物含量測(cè)定

1.5.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取干燥至恒重的葡萄糖1.00 g，加水溶解定容到100 mL，即標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為10.0 mg/mL。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行稀釋，得到濃度分別為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL的葡萄糖溶液各2.0 mL。以蒸餾水為對(duì)照，各試管加入5%苯酚溶液0.50 mL搖勻。再分別加入2.50 mL濃硫酸，充分搖勻后，室溫下靜置15 min，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)得其相應(yīng)吸光度值。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制出葡萄糖濃度與吸光度值之間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸線方程和線性范圍。

1.5.2 虎奶菇子實(shí)體多糖類化合物含量測(cè)定

將采摘后的虎奶菇子實(shí)體放入烘箱烘干至恒重后粉碎，稱量1 g子實(shí)體粉末，置于25 mL試管中，加入80%乙醇25 mL，混合均勻后，置于超聲破壁儀中超聲30 min，用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，測(cè)定具體操作方法同1.5.1。

1.6 三萜含量測(cè)定

1.6.1 三萜標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取105℃干燥至恒重的齊墩果酸（對(duì)照品）10.0 mg，以色譜級(jí)甲醇配制成0.2 mg/mL的溶液。分別精密吸取0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL該溶液置于刻度試管中，60 ℃水浴蒸發(fā)干溶劑，加入新配制的0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液及1.2 mL高氯酸，70 ℃恒溫水浴15 min后冰水浴冷卻。再加入乙酸乙酯使體系總量為4 mL，搖勻，于550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.2 虎奶菇子實(shí)體三萜含量測(cè)定

稱量1 g虎奶菇子實(shí)體粉末于錐形瓶中，加入25 mL乙醇，連續(xù)超聲45 min，過(guò)濾后將濾液置于100 mL容量瓶中定容待測(cè)。參照NY/T 1676—2008，用香草醛-冰醋酸法測(cè)定醇提物中的三萜含量[10]。吸取待測(cè)樣品溶液1.0 mL置于試管中60 ℃水浴蒸干，加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL及高氯酸1.2 mL后，按齊墩果酸對(duì)照品溶液處理方法處理，于550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品中三萜類化合物含量。

1.7 多酚含量測(cè)定

稱取虎奶菇子實(shí)體粉末0.25 g，加8 mL水超聲60 min，加水定容至10 mL。取2 mL于離心管中，12 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)至新離心管中，即虎奶菇供試樣液。具體測(cè)定多酚含量操作參照李洋洋等（2017）[10]的方法。

1.8 抗氧化活性測(cè)定

1.8.1 清除DPPH自由基能力測(cè)定

將上述1.6中醇提物樣品稀釋成不同濃度，樣品組為2 mL不同濃度樣品+2 mLDPPH試劑，對(duì)照組用無(wú)水乙醇代替DPPH，空白組用無(wú)水乙醇代替樣品。測(cè)定方法參考范三紅等（2020）[11]的方法并加以改動(dòng)。

1.8.2 清除ABTS自由基能力測(cè)定

參照謝惠等（2017）[12]的方法并加以改動(dòng)。樣品組為2 mL不同濃度樣品+2 mLABTS試劑，對(duì)照組用蒸餾水代替ABTS，空白組用蒸餾水代替樣品。

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用Origin2018軟件繪圖，并采用Excel和SPSS 25軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 出菇產(chǎn)量

待子實(shí)體生長(zhǎng)至八分成熟后采收，將每袋子實(shí)體采收后用天平稱量子實(shí)體鮮重，計(jì)算出不同配方的平均產(chǎn)量，結(jié)果如表2。

表2不同配方出菇產(chǎn)量及顯著性差異分析比較

配方編號(hào)單包產(chǎn)量/（g/包）顯著性差異（P＜0.05） ABC135.08±3.99160.13±4.6693.10±2.63 bac

由表2可知，供試的不同木屑配方中，配方B的產(chǎn)量和配方A、C的產(chǎn)量均存在顯著性差異。其中，配方B的產(chǎn)量在3種配方中是最高的，其單包產(chǎn)量達(dá)160.13 g；而以杉木屑為主料的配方C產(chǎn)量最低，僅為93.1 g/包，與B相比，其單包產(chǎn)量相差41.98 g。

2.2 不同配方下虎奶菇子實(shí)體活性成分含量比較分析

（1）活性成分標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。

圖1　苯酚-硫酸法葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2　香草醛-冰醋酸法三萜含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得到如圖1苯酚-硫酸法葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線=0.067 5－0.066 3，2=0.999，以及圖2香草醛-冰醋酸法三萜含量標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線=2.561 1－0.026 5，2=0.999，以此作為后續(xù)測(cè)定值的計(jì)算依據(jù)。

（2）子實(shí)體活性成分含量比較分析。

圖3　不同配方虎奶菇子實(shí)體活性成分含量

由圖3可知，3種不同木屑對(duì)虎奶菇子實(shí)體內(nèi)的多糖、三萜以及多酚等活性成分含量均有一定的影響。其中，在多糖含量方面，配方B的子實(shí)體多糖含量最高，為21.84 mg/g，配方C的多糖含量最低，其含量與配方B相差1.09 mg/g。

三萜含量方面，以松木屑為主料的配方B栽培的虎奶菇子實(shí)體內(nèi)三萜含量最高，達(dá)到14.76 mg/g，其次是以苦楝木屑為主料的配方A，而以杉木屑為主料的配方C栽培的子實(shí)體三萜含量最低，為12.77 mg/g，與配方B相差1.99 mg/g。

在多酚含量方面，也是以松木屑為主的配方B栽培的子實(shí)體含量最高，為4.37 mg/g，其次為配方C，配方A的含量最低，為3.9 mg/g。因此，綜合分析，配方B栽培的虎奶菇子實(shí)體的多糖、三萜、多酚這些活性物質(zhì)含量均為最高。

2.3 不同配方虎奶菇子實(shí)體醇提物的抗氧化活性分析

圖4　不同配方下虎奶菇子實(shí)體醇提物對(duì)DPPH的清除率

圖5　不同配方下虎奶菇子實(shí)體醇提物對(duì)ABTS的清除率

如圖4，隨著濃度的增大，不同木屑栽培的子實(shí)體醇提物對(duì)DPPH自由基的清除率都呈穩(wěn)定上升趨勢(shì)。當(dāng)醇提物濃度為1 mg/mL～5 mg/mL時(shí)，3種配方下的子實(shí)體醇提物對(duì)DPPH自由基的清除率均呈快速上升趨勢(shì)，且配方A的子實(shí)體醇提物對(duì)DPPH的清除率較高于配方B、C；當(dāng)醇提物濃度大于5 mg/mL時(shí)，清除率的上升趨勢(shì)逐漸緩慢趨平，但配方B的子實(shí)體醇提物對(duì)DPPH的清除率相較于配方A和C增長(zhǎng)迅速；當(dāng)醇提物濃度達(dá)到7 mg/mL時(shí)，不同配方下的子實(shí)體醇提物的DPPH自由基清除率均達(dá)到最大值，分別為80.78%（A）、81.50%（B）、77.64%（C），即B＞A＞C。

如圖5，隨著濃度的增大，不同木屑栽培的子實(shí)體醇提物對(duì)ABTS自由基的清除率也呈上升趨勢(shì)[10]。當(dāng)醇提物濃度為0.2 mg/mL～1.0 mg/mL時(shí)，配方A的子實(shí)體醇提物對(duì)ABTS的清除率均高于配方B、C；當(dāng)醇提物濃度為0.6 mg/mL～1.0 mg/mL時(shí)，配方C的子實(shí)體醇提物的清除率高于配方B；當(dāng)醇提物濃度達(dá)到1.0 mg/mL時(shí)，配方A的子實(shí)體醇提物的ABTS清除率最高，為87.69%，此時(shí)配方C的子實(shí)體醇提物的清除率接近配方A，為84.00%，而配方B為78.53%，即A＞C＞B。

3 討論

通過(guò)使用不同木屑對(duì)虎奶菇進(jìn)行栽培，對(duì)比其產(chǎn)量和活性物質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)苦楝木屑、松木屑和杉木屑中，松木屑對(duì)虎奶菇栽培產(chǎn)量提高效果顯著。之后對(duì)虎奶菇活性物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定分析，發(fā)現(xiàn)松木屑栽培的虎奶菇子實(shí)體中多糖、三萜及多酚這些活性物質(zhì)含量也是最高的。因此，從這3種木屑中可篩選出松木屑和菌草搭配更適宜栽培虎奶菇，希望本實(shí)驗(yàn)?zāi)転槟拘假Y源的有效利用提供參考。

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10.3969/j.issn.2095-1205.2021.12.07

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2095-1205(2021)12-18-03

劉斌