徐紅 孫紅 楊坤 向陽

骨肉瘤 ( osteosarcoma，OS ) 起源于間葉細(xì)胞，是一種最常見于 10～30 歲青少年的原發(fā)惡性骨腫瘤，多見于長(zhǎng)骨干骺端，具有侵襲性強(qiáng)且易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)[1-4]。目前主要的治療包括手術(shù)結(jié)合新輔助化療，但是存在耐藥、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等問題[5-6]。已發(fā)生肺部等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者幾乎不可治愈，5 年總體生存率不到 30%[7]，因此骨肉瘤的早期診斷對(duì)于患者的預(yù)后至關(guān)重要。然而目前骨肉瘤的早期診斷卻相對(duì)局限，臨床常用的有影像學(xué)檢查和血清生化等方法，遺憾的是其特異性和敏感度普遍不高[8]。迄今為止，驅(qū)動(dòng)骨肉瘤細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)的關(guān)鍵機(jī)制仍未研究透徹。幸運(yùn)的是，越來越多的研究表明，組蛋白去乙?；? histone deacetylases，HDAC ) 影響多種細(xì)胞過程，并通過多種機(jī)制促進(jìn)骨肉瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展[9]，挖掘其在骨肉瘤發(fā)生及進(jìn)展中的作用機(jī)理，對(duì)于骨肉瘤的早期診斷、治療及預(yù)后分析等均帶來新的希望。組蛋白去乙?；敢种苿? histone deacetylase inhibitors，HDACi ) 通過作用于組蛋白乙?；?( histone acetyltransferases，HAT ) 和 HDAC，調(diào)控細(xì)胞核內(nèi)乙酰化與去乙?；^程，從而抑制腫瘤細(xì)胞周期、誘發(fā) DNA 損傷、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化及腫瘤細(xì)胞死亡，發(fā)揮抗腫瘤作用，逐漸成為腫瘤治療的新方向[9-11]?，F(xiàn)對(duì) HDAC 及 HDACi 在骨肉瘤中的表達(dá)及其分子機(jī)制作用的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、HDAC 生物學(xué)功能概述

1. HDAC：HDAC 主要存在于真核生物中，是去除賴氨酸殘基上乙酰基的一類蛋白酶?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)證實(shí)的包括 18 種同工型的 HDAC，按照結(jié)構(gòu)差異將其分為四類。Ⅰ 類 HDAC 成員主要由 HDAC1、2、3 和 8 構(gòu)成，主要位于細(xì)胞核中，并在所有組織中普遍表達(dá)。Ⅱ 類 HDAC不但分布于細(xì)胞核中，而且細(xì)胞質(zhì)中也有表達(dá)。分為 Ⅱa類，包括 HDAC4、5、7、9 和由 HDAC6 和 10 構(gòu)成的 Ⅱb類。Ⅲ 類 HDAC 是沉默調(diào)節(jié)蛋白 ( Sirtuins ) 同源物，主要由 Sirtuins 1～7 組成[12]，Ⅳ 類 HDAC 目前已探及的僅為 HDAC11[13]。其中 Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ 類屬于稱為“金典家族”Zn+ 依賴性酶，Ⅲ 類屬于依賴煙酰胺的腺嘌呤二核苷酸 ( NAD+) 酶[14]。

2. HDAC 的作用及功能：HDAC 通過作用于組蛋白、抑癌因子 P53 等細(xì)胞因子，直接或間接地參與多種重要的細(xì)胞通路，從而影響腫瘤細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡[15]。其在人類腫瘤中普遍存在 HDAC 的異常表達(dá)，其可作為腫瘤組織區(qū)別于正常組織的分子標(biāo)志物[16]。主要臨床應(yīng)用有：( 1 ) 腫瘤早期診斷[15]；( 2 ) 腫瘤遷移預(yù)測(cè)[15]；( 3 ) 腫瘤預(yù)后分析[17-20]；( 4 ) 腫瘤的臨床治療[15]。

二、HDACi 生物學(xué)功能概述

1. HADCi 概述：HDACi 是一類表觀遺傳學(xué)藥物，通過作用于 HDAC 調(diào)節(jié)基因表達(dá)，而無須改變基因序列[10,21]?；谄湓隗w外和體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力，HDACi 在近 10 年中已成為潛在的腫瘤治療選擇[22]。自20 世紀(jì) 90 年代至今，人們通過研究已發(fā)現(xiàn)了多種結(jié)構(gòu)不同的 HDACi，根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的特異性，主要分為以下幾類：( 1 ) 異羥肟酸類，代表藥物有伏立諾他 ( SAHA )、制滴菌素 A ( TSA ) 等；( 2 ) 短鏈脂肪酸類，如丁酸鈉、異戊酸等；( 3 ) 親電子酮類，目前發(fā)現(xiàn)的僅為三氟甲基酮；( 4 ) 環(huán)四肽類；( 5 ) 苯甲酰胺類；( 6 ) 其它類化合物。

2. HDACi 功能：靶向抑制 HDAC 已被證實(shí)具有抗腫瘤的效應(yīng)[23]，HDACi 通過抑制 HDAC 的活性而增強(qiáng)組蛋白乙?；?，以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子與 DNA 鏈結(jié)合，從而啟動(dòng)抑癌基因等特異性基因的表達(dá)，基于以上特點(diǎn)，HDACi 主要作用有：( 1 ) 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡 ( 影響細(xì)胞凋亡、自噬以及壞死的程序性死亡 )[24-25]；( 2 ) 增加腫瘤細(xì)胞對(duì)其它抗瘤藥的敏感性[26]；( 3 ) 影響活性氧水平[27-28]；( 4 ) 抗血管新生效應(yīng)[22,29]；( 5 ) 影響細(xì)胞因子信號(hào)[30]。

三、HDAC 與骨肉瘤

1. HDAC 促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖的分子機(jī)制：組蛋白乙?；腿ヒ阴；且粋€(gè)可以逆轉(zhuǎn)的過程，該過程接受 HAT和 HDAC 調(diào)節(jié)。通過乙?；饔?，去除組蛋白上的正電荷，降低組蛋白 N 末端與 DNA 磷酸基團(tuán)的相互作用，從而將染色質(zhì)轉(zhuǎn)化為更松弛的狀態(tài)。在這種狀態(tài)下，DNA 更易于訪問，這將導(dǎo)致更多的轉(zhuǎn)錄因子能夠到達(dá) DNA[31]。研究表明組蛋白的乙酰化會(huì)增加基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致基因在涉及增殖，遷移，血管生成和分化的多種途徑中表達(dá)[11,32]。而組蛋白去乙?；?DNA 更緊密地包裹在組蛋白核心周圍，使得轉(zhuǎn)錄因子不易于與 DNA 相結(jié)合，從而使基因的表達(dá)水平降低。研究發(fā)現(xiàn)：在包括骨肉瘤的許多癌癥中已觀察到 HDAC 的表達(dá)失調(diào)可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。隨著研究的不斷深入，HDAC 在骨肉瘤進(jìn)展中的重要作用也將逐步被揭示。

2013 年，國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn) β-catenin 可作為癌基因和 HDAC6 的底物，在骨肉瘤中，rho 相關(guān)的卷曲螺旋激酶通過防止 TPPP1 介導(dǎo)的 HDAC6 活性抑制作用調(diào)節(jié)β-catenin 的穩(wěn)定性，從而通過 CK1 和 GSK3β 的磷酸化來減少其乙?；徒到?，進(jìn)一步促進(jìn)骨肉瘤的進(jìn)展[33]。隨后國外一項(xiàng)研究表明，HDAC6 / STAT3 通路下調(diào)了程序性死亡受體配體 1 ( PD-L1 ) 的表達(dá)，從而使 T 細(xì)胞中的抑制性調(diào)節(jié)途徑 PD-1 降低，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[34]。最近國內(nèi)學(xué)者在體外試驗(yàn)中又發(fā)現(xiàn) HDAC5 通過上調(diào) Twist 1 的表達(dá)促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞系中的細(xì)胞增殖[35]。

此后，Deng 等[36]通過臨床病例發(fā)現(xiàn)：MG63 細(xì)胞中的核 HDAC 活性和 Ⅰ 類 HDAC 表達(dá)明顯高于 hFOB 1.19細(xì)胞，達(dá)到 3.6 倍，與配對(duì)的相鄰正常組織相比，在人骨肉瘤組織中觀察到了相似的趨勢(shì)；但是，HAT 活性未見明顯差異，從而使 HAT / HDAC 活性比率降低 69%，這些將影響骨肉瘤發(fā)病機(jī)理中乙?；臓顟B(tài)，從而影響骨肉瘤細(xì)胞的活力。

以上研究均揭示 HDAC 可通過不同分子機(jī)制促進(jìn)骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展，筆者期望通過尋找某種方式阻斷不同的細(xì)胞通路來抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖與發(fā)展，以期在腫瘤的早期進(jìn)行干預(yù)。

2. HDAC 促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞遷移的分子機(jī)制：隨著近年來新輔助化療的有序開展，骨肉瘤患者 5 年生存率提高到70% 左右[37]，然而遺憾的是，對(duì)于已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者，5 年生存率僅為 30%[38]，因此迫切的需要掌握骨肉瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制。

沉默調(diào)節(jié)蛋白 1 ( sirtuin 1，SIRT1 ) 是一類 NAD+依賴的 Ⅲ 型 HDAC，一項(xiàng)研究分析了 22 例骨肉瘤患者的生存率和轉(zhuǎn)移率與 SIRT1 的關(guān)系。結(jié)果得出表達(dá)高水平SIRT1 的患者的病死率沒有增加，表明 SIRT1 的表達(dá)水平或許與生存率無關(guān)，而 SIRT1 表達(dá)水平升高可能與骨肉瘤患者的高轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SIRT1 的過表達(dá)增加了 KHOS / NP，HOS 和 U2-OS 細(xì)胞系的遷移能力[39-40]。同時(shí)也有學(xué)者在橫紋肌肉瘤、平滑肌瘤、骨肉瘤、平滑肌肉瘤中觀察到了強(qiáng)烈的 Sirtuin 1 表達(dá)[41]。國外一項(xiàng)研究表明，Sirtuin 1 的過度表達(dá)與較高的臨床分期，較高的組織學(xué)等級(jí)，增加的有絲分裂計(jì)數(shù)和較高的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移潛力密切相關(guān)，從多變量分析來看，SIRT1的過表達(dá)是與骨肉瘤顯著相關(guān)的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，Sirtuin 1的過表達(dá)是骨肉瘤患者轉(zhuǎn)移潛能和無病生存的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)[42]。

通過檢測(cè)人體骨肉瘤和骨軟骨瘤組織中 HDAC4 和增殖細(xì)胞核抗原 ( PCNA ) 的 mRNA 及蛋白質(zhì)的水平，結(jié)果顯示人骨肉瘤患者臨床標(biāo)本中 HDAC4 和 PCNA 的表達(dá)量均明顯高于骨軟骨瘤患者臨床標(biāo)本；同時(shí)在體外實(shí)驗(yàn)中，上調(diào)人骨肉瘤細(xì)胞株 MG-63 和 U2-OS 中 HDAC4，過表達(dá) HDAC4 后，PCNA 的蛋白水平明顯升高，而 PCNA的 mRNA 水平無明顯變化；另一方面，在過表達(dá) HDAC4后，骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲明顯增強(qiáng)，而細(xì)胞凋亡明顯減少[43]；以上研究得出，HDAC4 可以使 PCNA 蛋白的表達(dá)增加，從而促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，并抑制其凋亡，為骨肉瘤的治療找到潛在靶點(diǎn)。

3. HDAC 與骨肉瘤預(yù)后分析：一項(xiàng)檢驗(yàn) HDAC 在 89例高級(jí)骨肉瘤組織中的表達(dá)情況的研究表明，HDAC1、HDAC2 和 HDAC3 的三種所有 HDAC 同工型，均主要在骨肉瘤細(xì)胞核中表達(dá)，原發(fā)性骨肉瘤細(xì)胞表達(dá)較高水平的HDAC1 和 HDAC2，但與良性成骨細(xì)胞相比，HDAC3 水平較低。進(jìn)一步研究表明，HDAC1 的表達(dá)水平在 Enneking晚期和初始轉(zhuǎn)移表型顯著降低。成人 ( > 15 歲 ) 中 HDAC3的表達(dá)明顯低于兒童 ( ≤ 15 歲 ) 中的表達(dá)。單因素生存分析表明，低水平的 HDAC1 核表達(dá)是高級(jí)別骨肉瘤的顯著陰性預(yù)測(cè)因子。低 HDAC1 表達(dá)的患者 5 年生存率高于HDAC1 表達(dá)較高的患者?？傮w來說，HDAC1 的低表達(dá)與不良結(jié)局如轉(zhuǎn)移和晚期有關(guān)[44]。隨著 HDAC 在骨肉瘤細(xì)胞遷移中的作用機(jī)制的研究進(jìn)一步深入，對(duì)于骨肉瘤的預(yù)后分析起到一定的作用。相信隨著這方面研究進(jìn)一步深入，對(duì)于骨肉瘤早期轉(zhuǎn)移的控制會(huì)逐漸增強(qiáng)，進(jìn)一步提高骨肉瘤患者的治愈率。

四、HDACi 與骨肉瘤

骨肉瘤細(xì)胞的程序性死亡在骨肉瘤發(fā)生、進(jìn)展及臨床治療中均可發(fā)揮重要作用。研究表明，HDACi 可以顯著影響骨肉瘤細(xì)胞的凋亡、壞死和自噬等關(guān)鍵的程序性死亡途徑。

1. HDACi 誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制：凋亡是介導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞死亡的主要途徑，且與化療藥物耐藥率的高低存在一定聯(lián)系[45]。研究表明，HDACi 在骨肉瘤細(xì)胞的凋亡途徑中可起到誘導(dǎo)作用。在骨肉瘤中，Bcl-2 / Bax 被認(rèn)為是最關(guān)鍵的調(diào)節(jié)凋亡通路之一[46]，Bax 與 Bcl-21 兩者都屬于 Bcl-2 家族蛋白，分別屬于最主要的凋亡蛋白及抗凋亡蛋白[47]。國內(nèi)學(xué)者證實(shí) SAHA 聯(lián)合順鉑可通過協(xié)同靶向Bcl-2 / Bax 促進(jìn)骨肉瘤的增殖抑制，誘導(dǎo)其凋亡[48]。一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TSA 通過 p53 信號(hào)通路激活以劑量依賴的方式顯著抑制 MG63 細(xì)胞的生長(zhǎng)并促進(jìn)凋亡[36]。而進(jìn)一步研究表明[49]，HDACi 能夠通過 p53 的信號(hào)傳導(dǎo)途徑或內(nèi)在線粒體途徑誘導(dǎo)的骨肉瘤細(xì)胞的凋亡，這種有效的凋亡活性與 HDACi 通過 AKT ( 蛋白激酶 B，也稱為 PKB ) 下調(diào)生存信號(hào)的更大能力有關(guān)[50]。

2. HDACi 誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞自噬：近年來研究發(fā)現(xiàn)，HDACi 在細(xì)胞自噬調(diào)控過程中也能發(fā)揮作用，但其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入，是目前研究的熱點(diǎn)之一。

一項(xiàng)研究表明，曲古抑素 A ( TSA ) 處理可抑制雷帕霉素 ( mTOR ) 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的哺乳動(dòng)物靶點(diǎn)，并增強(qiáng)叉頭盒 O1 ( FOXO1 ) 的轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致自噬水平提高，而通過 siRNA 敲除抑制 FOXO1 功能則可顯著降低 TSA 誘導(dǎo)自噬。而通過自噬抑制劑或 ATG 基因敲低抑制自噬，可顯著增強(qiáng) TSA 引起的細(xì)胞死亡，揭示了自噬在 HDACi 引起的骨肉瘤細(xì)胞死亡中的功能是一種細(xì)胞存活機(jī)制，HDACi能夠阻斷 AKT-mTOR 信號(hào)傳導(dǎo)并抑制癌細(xì)胞存活率和遷移，因此通過結(jié)合 HDACi 和自噬抑制劑成為骨肉瘤治療中的一個(gè)新的方向[51]。

3. HDACi 誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞壞死：壞死也是細(xì)胞程序性死亡的一種方式。然而只有在 Caspase 抑制劑抑制凋亡途徑時(shí)，活化的死亡受體才會(huì)將細(xì)胞壞死途徑激活，從而介導(dǎo)細(xì)胞死亡。一項(xiàng)研究表明，HDACi 可能通過誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞上的 NKG2D 配體 MICA / B 上調(diào)以及增加自然殺傷細(xì)胞上 NKG2D 受體的表達(dá)來增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)自然殺傷細(xì)胞的識(shí)別[52]，通過這一途徑，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞壞死。

4. HDACi 在骨肉瘤中的其它作用機(jī)制：HDACi 增強(qiáng)了骨肉瘤和 RMS 細(xì)胞系的輻射作用，暴露于 HDACi 后，DNA 修復(fù)的抑制以及凋亡誘導(dǎo)的增加可能是 HDACi 引起放射增敏的機(jī)制[53]。Ⅰ 類 HDAC 抑制劑 MS-275 可增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞對(duì)活性氧 ( ROS ) 的脆弱性，通過增強(qiáng) YB-1 乙酰化作用，抑制了關(guān)鍵細(xì)胞保護(hù)因子的 YB-1 轉(zhuǎn)化控制及其促轉(zhuǎn)移活性，從而限制骨肉瘤的轉(zhuǎn)移[54]。AR-42 與阿霉素的組合可有效抑制細(xì)胞活力并產(chǎn)生明顯的協(xié)同作用[49]。SAHA 和順鉑的組合通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，使得細(xì)胞遷移速率顯著降低[48]。Blattmann 等[55]通過皮下注射 KHOS-24OS 細(xì)胞建立骨肉瘤異種移植物，并用媒介物 ( DMSO )，SAHA，HIT ( 重離子放射療法 ) 或 HIT和 SAHA 進(jìn)行處理，確定腫瘤生長(zhǎng)并評(píng)估腫瘤壞死，增殖率，凋亡率以及血管密度，證實(shí) HIT 和 SAHA 的組合通過增加凋亡率，增加 p53 和 p21 Waf1 / Cip1 的表達(dá)，抑制增殖和血管生成，誘導(dǎo)了腫瘤生長(zhǎng)的顯著延遲。國內(nèi)學(xué)者阿吉木·克勒木等通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究得出，HDAC6通過激活 STAT3 通路下調(diào)了骨肉瘤細(xì)胞表達(dá)的重要共刺激分子程序死亡受體配體-1 ( PD-L1 ) 的表達(dá)，激活了 T 細(xì)胞的抑制性調(diào)節(jié)通路 PD-1，從而抑制體內(nèi)腫瘤的進(jìn)展，這為骨肉瘤的免疫治療提供了新的思路[34]。

五、總結(jié)與展望

總的來說，HDAC 在骨肉瘤中發(fā)生及進(jìn)展中意義重大，愈來愈多的研究表明其在骨肉瘤中的表達(dá)水平較正常組織中高，通過研究不同類型的 HDAC 在骨肉瘤中的表達(dá)情況，可以盡早在骨肉瘤早期預(yù)測(cè)抑或是檢測(cè)出骨肉瘤，以便于早診斷、早治療，這對(duì)于骨肉瘤患者來說意義重大。HDACi 在骨肉瘤中有跨越細(xì)胞途徑的廣泛生物學(xué)效應(yīng)，包括骨肉瘤中的凋亡、壞死、自噬、細(xì)胞分化和 ROS生成，這些機(jī)制表明，HDACi 可能是骨肉瘤患者有前途的治療劑之一，并為 HDACi 在骨肉瘤中的臨床應(yīng)用中奠定了基礎(chǔ)。此外，研究表明，HDACi 不但使骨肉瘤對(duì)放療和化療敏感，而且還在骨肉瘤中聯(lián)合化療藥物或其它靶向藥物時(shí)可以提高治療效果，這極大地改善了放化療不敏感類型骨肉瘤患者的治療窘境。雖然 HDACi 在骨肉瘤的治療中表現(xiàn)顯著，但是問題也同樣存在，例如 HDACi 精準(zhǔn)性不夠高，無法調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)中的細(xì)微差別，這也帶來了無法精準(zhǔn)識(shí)別的問題，從而在腫瘤不同亞型中效果不盡相同，甚至起到反作用的可能。相信通過國內(nèi)外學(xué)者的不斷研究，HDACs 在骨肉瘤中表達(dá)機(jī)制會(huì)進(jìn)一步揭露，為骨肉瘤的早期診斷與預(yù)后療效預(yù)測(cè)提供更多的便利。同時(shí)，HDACi 的不斷推廣，通過聯(lián)合化療藥物或其它靶向藥物，將會(huì)為骨肉瘤患者帶來更多的福音。