王 燦，張應(yīng)華，許俊強，周華杰，李 根，郝希茹，王紹祥

（1.文山州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，云南 文山663000；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省滇臺特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化工程研究中心，昆明650201；3.江蘇香河農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，江蘇連云港222047；4.沈陽市辣伙伴農(nóng)業(yè)有限公司，沈陽110000）

辣椒（Capsicum annuumL.）是世界上重要的蔬菜作物之一，適應(yīng)性廣、產(chǎn)業(yè)鏈長、營養(yǎng)成分豐富，具有較大的商業(yè)開發(fā)潛力，栽培面積逐年上升。近年來，研究者采用植物生理學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)已在辣椒育種和栽培研究中取得了長足的進展，然而從微生物角度分析栽培過程中辣椒對土壤的影響則鮮有報道。植物根際土壤受根系活動影響，不同基因型、不同環(huán)境下的根系分泌物均對土壤微生物群落產(chǎn)生直接或間接的影響，如Marques等［1］發(fā)現(xiàn)，低淀粉基因型馬鈴薯與高淀粉基因型馬鈴薯的根際細(xì)菌組成差異很大，低淀粉基因型馬鈴薯根際環(huán)境中，鞘脂菌屬Sphingobium、Pseudomonas、不 動 桿 菌 屬Acinetobacter、寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonas和金黃桿菌屬Chryseobacterium的相對豐度顯著增加。丁紅等［2］研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫及干旱低氮脅迫處理均不同程度地提高了花生根際放線菌門和酸桿菌門的相對豐度，而降低了變形菌門的相對豐度等。另有研究表明，植物根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性受施肥條件的影響較大，施用肥料降低了花生根際土壤的菌群多樣性，但提高了其菌群物種豐度［3］。

文山州作為云南省主要辣椒種植區(qū)，常年辣椒種植導(dǎo)致土壤肥力下降、化感作用嚴(yán)重等問題。探究不同辣椒種植前后生境中微生物多樣性差異，對改善本地辣椒種植環(huán)境、修復(fù)栽培土壤有重要生態(tài)意義，對辣椒定植生長過程中專用生物菌肥和生物農(nóng)藥的制造也具有指導(dǎo)意義。本研究以不同品種成苗期辣椒為研究對象，通過ITS rDNA擴增子測序?qū)ΩH土壤真菌群落組成進行測定，探討不同品種辣椒種植前后對根際真菌群落結(jié)構(gòu)的影響，為挖掘可能對地方特色辣椒品種高效、優(yōu)質(zhì)生長起關(guān)鍵作用的真菌類型提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試品種及材料

試驗辣椒品種分別是本地一年生文山丘北辣椒（Capsicum annuumL.）和觀賞簇生辣椒（Capsicum frutescensvar.fasciculatumL.H.Bailey）。其中WG1和9F33是 一 年生文山 丘 北 辣椒，Y19278和Y19292是觀賞簇生辣椒，均由文山州農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供（圖1）。

圖1 供試?yán)苯饭麑嵄硇褪疽鈭D

種植育苗土壤為市面上購買的商品育苗基質(zhì)（‘湘正農(nóng)科’牌，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)湘暉農(nóng)業(yè)技術(shù)研究所研制，主要成分為草炭土），主要土壤化學(xué)性質(zhì)如下：堿解氮（92.30±0.39）mg/kg、速效磷（54.56±0.45）mg/kg、速效鉀（938.72±0.11）mg/kg、碳氮比1.47±0.55、pH 5.28±0.03、EC（712.67±0.17）μs/cm。

1.2 方法

1.2.1 盆栽試驗及樣品采集

試驗地點為文山州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，時間2021年2—8月。將發(fā)芽整齊一致的不同辣椒種子播種于苗盤（21孔）中進行盆栽試驗，共5個處理，分別是：WG1、9F33、Y19278、Y19292、CK（未種植辣椒的原始土壤基質(zhì)）。每個處理3次重復(fù)，3盤為1次生物學(xué)重。在相同環(huán)境下（光照培養(yǎng)箱）進行常規(guī)管理。苗齡為51 d時，采用5點取樣法選取植株，將植株整株拔出，抖落附著土壤基質(zhì)后用單獨無菌刷刷取粘附在根表面的土壤基質(zhì)，各樣品混合后放入50 mL無菌離心管中，迅速置于干冰中保存運輸，后放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 測定項目

真菌DNA提取均使用Magen核酸提取試劑盒（MagPure Soil DNA KF Kit），Equalbit dsDNA HS Assay Kit檢 測DNA濃 度。

真菌以20-30 ng DNA為模板，采用GENEWIZ公司設(shè)計的PCR擴增真菌ITS rDNA上的ITS2可變區(qū)，引物如下：F：5’-GTGAATCATCGARTC-3’；R：5’-TCCTCCGCTTATTGAT-3’。真菌PCR反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性7 min，94℃變性60 s，57℃退火60 s，72℃延伸60 s，共32個循環(huán)，72℃延伸15 min，4℃保存。反應(yīng)體系：50 μL體系，5 μL 10×PCR Buffer、8 μL DNA模板、1 μL dNTPs、引物各2 μL、2 μL Taq DNA聚合酶、去離子水30 μL。通過PCR向ITS rDNA的PCR產(chǎn)物末端加上帶有In-dex的接頭，按Illumina MiSeq儀器使用說明書進行雙端測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)質(zhì)控與分析

原始數(shù)據(jù)整理采用WPS軟件。測序數(shù)據(jù)質(zhì)量優(yōu) 化 使 用Cutadapt 1.9.1、Vsearch 1.9.6和Qiime 1.9.1，作圖采用R語言平臺。測序數(shù)據(jù)優(yōu)化后質(zhì)量見表1。

表1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物群落OTU分析

試驗共采集5個樣本處理。按97%相似性對unique序列（重復(fù)次數(shù)＞1）進行OTU聚類，真菌中5個樣本共有的OTU數(shù)為55個，辣椒樣本中共有的OTU是77個，其中丘北辣椒中共同含有的OTU為107個，觀賞辣椒中為93個。另外，WG1處理具有較高的OTU個數(shù)，獨有的OTU是21個，9F33獨有的OTU是10個，Y19278獨有的OTU是14個，Y19292獨 有 的OTU是8個，CK獨 有 的OTU是14個（圖2a）。

對排名前15的OTU做熱圖可知，WG1中OTU4、OTU15豐 度 顯 著 高 于 其 他 處 理，9F33中OTU8、OTU10、OTU12豐度顯著高于其他處理，Y19278中OTU1、OTU13豐度顯著高于其他處理，Y19292中OTU11豐 度 顯 著 高 于 其 他 處 理，CK中OTU6、OTU7、OTU16豐度顯著高于其他處理（圖2b）。OTU主坐標(biāo)分析中（圖2），第一主坐標(biāo)對樣本差異的貢獻(xiàn)率為62.24 %，第二主坐標(biāo)對樣本參與的貢獻(xiàn)率為18.38%。樣本點之間的距離越近，說明相似度越高，反之亦然。WG1與9F33、Y19278、Y19292在PCo2軸上分離，CK與辣椒樣本在PCo1軸上分離，說明WG1和CK樣本的真菌群落結(jié)構(gòu)與其他處理具有較大差異，而9F33和Y19292真菌群落結(jié)構(gòu)相似度較高。

圖2 不同辣椒根際真菌OTU分析

2.2 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

真菌門水平下共獲得7個物種種類（圖3a），4個辣椒樣本中子囊菌門Ascomycota為主要優(yōu)勢菌，占比分別是WG1（81.91%）、9F33（91.29%）、Y19278（83.61%）、Y19292（91.84%），均顯著高于CK（45.77%）。在擔(dān)子菌門中，WG1（1.57%）、9F33（0.64%）、Y19278（9.47%）、Y19292（0.93%）顯著低于CK（53.47%）。毛霉菌門Mucoromycota中，WG1（0.28%）、9F33（0.33%）、Y19278（0.34%）、Y19292（0.65%）高于CK（0.06%）；而壺菌門Chytridiomycota只少量存在于WG1（0.32%）、9F33（0.13%）。

屬水平下（圖3b）可以看出，4個辣椒樣本中，Conlarium占比高于CK，分別是WG1（24.79%）、9F33（45.05%）、Y19278（20.93%）、Y19292（59.3%），而CK僅1.05%。在錐蓋傘屬Conocybe比較中則情況剛好相反，CK樣本占比最高達(dá)26.41%，而辣椒樣 本W(wǎng)G1（0.02%）、9F33（0.02%）、Y19278（8.15%）、Y19292（0%）則明顯低于CK。另外，在一年生文山丘北辣椒中，柄孢殼菌屬Podospora占比顯著高于觀賞辣椒，分別是WG1（1.77%）、9F33（2.77%），而Y19278（0.39%）、Y19292（0.23%）、CK（0.15%）均未超過1%。

圖3 不同辣椒根際真菌群落組成比例及其在樣本中的分布比例

2.3 微生物群落多樣性分析

α多樣性比較中，Ace和Chao1是反映菌群豐富度的指標(biāo)，數(shù)值越小表明豐富度越低。Shannon、Simpson是反映菌群多樣性的指標(biāo)，其數(shù)值越小表明群落多樣性越低。表2中，4個辣椒樣本真菌的Ace、Chao1指數(shù)均高于CK，其中以Y19278最高。在Shannon、Simpson指數(shù)中，則僅有Y19278高于CK，說明種植辣椒后明顯提高了基質(zhì)土壤根際真菌的豐度。通過Spearman計算關(guān)聯(lián)系數(shù)，由圖4可以看出，子囊菌門Ascomycota與毛霉菌門Mucoromycota顯著正相關(guān)（P＜0.05）；毛霉菌門Mucoromycota與鞭毛菌門Mortierellomycota、子囊菌門Ascomycota顯著正相關(guān)（P＜0.05）；壺菌門Chytridiomycota與k__Fungi_Unclassified顯 著 正 相 關(guān)（P＜0.05）。

圖4 不同樣本根際真菌關(guān)聯(lián)性分析（門水平TOP10）

表2 不同樣本真菌多樣性指數(shù)比較

3 結(jié)論與討論

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)不僅直接影響到養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化與組成，也是維持和恢復(fù)土壤生產(chǎn)力的主要因素之一［4］。耕地土壤微生物豐度和結(jié)構(gòu)的變化是反映土壤環(huán)境質(zhì)量變化的重要生物指標(biāo)［5］。植物生長對根際微生物群落構(gòu)建有顯著影響，本研究5個樣本中共同含有的OTU數(shù)為55個，其 中4個 辣 椒 樣本中共有的OTU是77個，表明4個辣椒樣本中真菌群落有一定的相似性，但WG1處理的辣椒樣本相較于其他處理具有較高的OTU個數(shù)，獨有的OTU高達(dá)21個。通過OTU主坐標(biāo)分析后發(fā)現(xiàn)，WG1和CK與其他處理真菌群落具有較大的差距，而9F33和Y19292真菌群落結(jié)構(gòu)相似度較高。門水平下共獲得7個物種種類，在4個辣椒樣本中子囊菌門Ascomycota為優(yōu)勢菌，相對豐度均顯著高于CK空白對照，而擔(dān)子菌門Basidiomycota則顯著低于對照。同時發(fā)現(xiàn)，壺菌門Chytridiomycota只少量存在于一年生丘北辣椒WG1（0.32%）和9F33（0.13%）中，其它樣本均未檢測出。屬水平下，在柄孢殼菌屬Podospora比較中，丘北辣椒WG1（1.77%）、9F33（2.77%）占比顯著高于觀賞辣椒Y19278（0.39%）、Y19292（0.23%）和CK（0.15%）。可見，在相同環(huán)境下種植辣椒導(dǎo)致原本土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的變化，這一結(jié)果與前人研究一致（種植辣椒后對真菌有較大影響，真菌OTU數(shù)明顯增加）［6］。

研究表明，植物可以通過根系釋放分泌物來促進或抑制微生物的生長［7］，如碳水化合物、氨基酸、黃酮類和酚酸類物質(zhì)均可對根際微生物多樣性產(chǎn)生影響［8］。Liu［9］等研究發(fā)現(xiàn)，花生根系分泌物中的苯甲酸可增加根際土壤中伯克霍氏菌（Burkholderiaspp.）的相對豐度。Li［10］等在對玉米根際微生物的代謝能力研究中發(fā)現(xiàn)，玉米根際土壤中含有相對豐度較高的與碳、氮循環(huán)相關(guān)的微生物菌群，參與分解有機酸、糖、氨基酸、纖維素和芳香族化合物等，說明這些物質(zhì)是影響根際微生物群落形成的驅(qū)動力。綜上，基于前人研究分析，造成本試驗結(jié)果的原因可能是試驗辣椒材料不同，其根系分泌物不同，導(dǎo)致對種植前土壤微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響。下一步試驗可收集根系分泌物進行代謝組學(xué)檢測和微生物基因功能注釋，具體分析影響微生物結(jié)構(gòu)的分泌物質(zhì)。

α多樣性分析中，種植辣椒明顯提高了根系真菌的豐度，多樣性除觀賞辣椒Y19278高于CK外，其他樣本均低于CK，表明觀賞辣椒Y19278處理顯著提高了根際真菌的多樣性。通過斯皮爾曼（Spearman）關(guān)聯(lián)系數(shù)計算，結(jié)果表明本試驗條件下某些微生物種類間存在正向作用。優(yōu)勢菌子囊菌門Ascomycota與毛霉菌門Mucoromycota顯著正相關(guān)；毛霉菌門Mucoromycota與鞭毛菌門Mortierellomycota、子囊菌門Ascomycota顯著正相關(guān)；壺菌門Chytridiomycota與k__Fungi_Unclassified顯著正相關(guān)。前人研究表明，根際土壤環(huán)境中土壤微生物之間存在協(xié)同與競爭機制，其通過競爭營養(yǎng)物質(zhì)、侵染位點、合成抗生素類物質(zhì)抑制其他微生物的生長繁殖，同時益生菌可通過分泌物協(xié)同促進某些微生物生長和增強植物免疫力［11-12］。因此，種植辣椒秧苗可顯著改變種植前基質(zhì)土壤中真菌群落豐度和多樣性，同時不同基因型品種辣椒之間對根際真菌群落結(jié)構(gòu)的影響也存在顯著差異。這對辣椒生產(chǎn)中不同辣椒環(huán)境適應(yīng)機制研究、挖掘可能對本地辣椒優(yōu)質(zhì)高效生長起關(guān)鍵作用的微生物種類提供了研究基礎(chǔ)。