豐誠杰, 劉 健, 吳春雷, 沈潤溥, 楊金緯, 杜 奎

一種比率型硫化氫熒光探針的合成及細(xì)胞成像

豐誠杰1, 劉 健1, 吳春雷1, 沈潤溥1, 楊金緯2, 杜 奎1

(1. 紹興文理學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院, 浙江 紹興 312000;2. 浙江昂利康制藥股份有限公司, 浙江 紹興 312000)

為了對(duì)腫瘤細(xì)胞硫化氫(H2S)進(jìn)行定量檢測，降低基于喹啉母環(huán)設(shè)計(jì)的H2S熒光探針活細(xì)胞成像背景干擾，基于疊氮還原的H2S熒光探針設(shè)計(jì)策略，以5-位炔烴取代喹啉替代5-三氮唑取代喹啉，提高探針本身的熒光量子產(chǎn)率，設(shè)計(jì)制備了一種新的基于喹啉母環(huán)的比率型H2S熒光探針QL-N3。結(jié)果表明，喹啉母環(huán)經(jīng)5-炔烴修飾后，探針本身的熒光量子產(chǎn)率提高到0.12，表現(xiàn)出明顯的比率型熒光探針特點(diǎn)。同時(shí)，QL-N3探針保持對(duì)H2S的高選擇性、高檢測靈敏度(檢測極限為1.8′10-8mol×L-1)和高檢測速率(30 s)，在HeLa細(xì)胞H2S熒光成像中表現(xiàn)出較好效果。

硫化氫；熒光探針；比率型；快速響應(yīng)；熒光成像

1 前言

硫化氫(H2S)是人體內(nèi)僅次于一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)的第3種內(nèi)源性氣體信號(hào)遞質(zhì)分子[1-4]，同時(shí)，硫化氫也是環(huán)境有毒氣體之一，生理水平與毒理水平之間的H2S濃度范圍小于兩個(gè)數(shù)量級(jí)[5-7]，因此，實(shí)現(xiàn)生物體內(nèi)H2S高效檢測具有重要意義。熒光分析方法具有選擇性好、靈敏度高、檢測速度快和適于細(xì)胞和活體成像等特點(diǎn)，在內(nèi)源性H2S檢測方面得到廣泛應(yīng)用[8-10]。比率計(jì)量型熒光探針與活性分子反應(yīng)前后，表現(xiàn)出比率型特點(diǎn)，可有效減少激發(fā)光源和光漂白效應(yīng)引起的成像干擾，適合生物活性分子的定量檢測[11]。因此，開發(fā)出具有良好熒光性能的比率型H2S熒光探針是當(dāng)前的主要需求[12-17]。

基于疊氮還原的反應(yīng)型H2S熒光探針具有反應(yīng)穩(wěn)定性好、設(shè)計(jì)簡單等優(yōu)勢，已成為H2S熒光探針設(shè)計(jì)的重要策略之一。但是受疊氮基團(tuán)熒光淬滅效應(yīng)的影響，基于疊氮還原設(shè)計(jì)的H2S探針大多是熒光增強(qiáng)型探針[18-21]。2018年，朱勍教授團(tuán)隊(duì)基于喹啉母環(huán)設(shè)計(jì)了一例增強(qiáng)型H2S探針，成功用于活細(xì)胞H2S成像[22]。進(jìn)一步提高該類探針的檢測靈敏度和準(zhǔn)確性，結(jié)合比率型熒光探針設(shè)計(jì)的前期基礎(chǔ)[23-24]，本研究以炔基替代三氮唑基團(tuán)，改善探針分子的共軛特征，提高探針熒光量子產(chǎn)率，制備了新型具有良好比率型特點(diǎn)的H2S熒光探針，并對(duì)探針的熒光檢測性能和細(xì)胞成像效果進(jìn)行了研究。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

合成過程中所使用的所有原料和試劑均屬于國產(chǎn)分析純或者化學(xué)純試劑，沒有經(jīng)過進(jìn)一步處理；無水試劑按照常規(guī)方法進(jìn)行處理。8-氨基喹啉、N-碘代丁二酰亞胺、苯甲酰氯、雙三苯基磷二氯化鈀、碘化亞銅、苯乙炔、疊氮三甲基硅烷和亞硝酸叔丁酯均購自薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司；四氫呋喃、乙酸乙酯等試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Hitachi F-4500型熒光光譜儀(Hitachi 公司，日本)；UV-2700 型分光光度計(jì)(島津公司，日本)；Brucker 核磁共振儀400 MHz (Brucker 公司，瑞士)；X-5型顯微熔點(diǎn)測定儀(北京泰克儀器有限公司)；共聚焦熒光顯微鏡(CLSM，Nikon A1R系統(tǒng)，日本)。

2.2 探針QL-N3的合成及表征

探針QL-N3的合成路線如圖1所示。稱取質(zhì)量為0.497 g (1.33 mmol)化合物1，質(zhì)量為0.271 g (2.66 mmol) 苯乙炔，質(zhì)量為0.5 g (0.71 mmol)雙三苯基磷二氯化鈀和質(zhì)量為0.1 g (0.52 mmol)的碘化亞銅于50 mL三口燒瓶中，加入10 mL 三乙胺和1 mL 四氫呋喃，50 ℃溫度且氮?dú)獗Ｗo(hù)下，磁力攪拌反應(yīng)1 h后停止反應(yīng)并降溫；溶劑減壓旋干；加入乙酸乙酯和飽和食鹽水，萃取，有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥后過濾。濾液減壓旋干，加入乙酸乙酯和環(huán)己烷重結(jié)晶，過濾后得化合物2，為灰色固體，質(zhì)量為0.23 g。化合物2產(chǎn)率49.5%。氫譜1H NMR (400 MHz，CDCl3) 化學(xué)位移: 10.83 (單峰s，1H)，8.93 (雙峰d，耦合常數(shù)= 8.1 Hz，1H)，8.89 (雙重雙峰dd，= 4.2, 1.6 Hz，1H)，8.73 (dd，= 8.4，1.6 Hz，1H)，8.09 (dd，= 8.0，1.4 Hz，2H)，7.86 (d，= 8.1 Hz，1H)，7.65～7.61 (m，2H)，7.61～7.53 (m，4H)，7.41～7.37 (m，3H)。碳譜13C NMR (101 MHz, CDCl3,TMS):165.47、148.68、138.43、135.18、135.09、134.89、132.06、131.88、131.62、128.88、128.52、128.27、127.35、123.12、122.32、116.04、114.94、94.16、86.38。

圖1 探針QL-N3合成路線

稱取質(zhì)量為0.46 g (1.32 mmol)化合物2，氫氧化鈉 4.0 g(0.1 mol)于100 mL三口燒瓶中，加入13 mL甲醇、15 mL水和10 mL四氫呋喃，攪拌升溫至回流，反應(yīng)18 h。薄層層析法(thin layer chromatography，TLC)檢測反應(yīng)完全，冷卻至室溫后，加入20 mL四氫呋喃，適量飽和食鹽水洗滌，有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥后過濾，濾液旋干，粗品柱層析分離(體積比(乙酸乙酯):(正己烷) =1:10)，得黃色固體化合物3，質(zhì)量為0.29 g?；衔?產(chǎn)率為89.5%。氫譜1H NMR (400 MHz，CDCl3) 化學(xué)位移: 8.78 (雙重雙峰dd，耦合常數(shù)= 4.1，1.7 Hz，1H)，8.63 (dd，= 8.4，1.7 Hz，1H)，7.65～7.56 (m，3H)，7.48 (dd，= 8.4，4.2 Hz，1H)，7.40～7.30 (m，3H)，6.85 (雙峰d，= 7.9 Hz，1H)，5.23 (s，2H)。碳譜13C NMR (101 MHz，CDCl3，TMS):147.74、144.92、137.79、134.76、132.22、131.38、129.21、128.44、127.93、123.80、122.12、109.31、108.33、 92.18、87.47。

將質(zhì)量為0.40 g (1.64 mmol)化合物3溶解于30 mL乙腈中，加入疊氮三甲基硅烷質(zhì)量為0.38 g (3.28 mmol) 和亞硝酸叔丁酯 0.34 mL (3.28 mmol)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng) 20 h。反應(yīng)結(jié)束后，旋干溶劑，粗品柱層析分離(體積比(乙酸乙酯):(正己烷) =1:20)，得0.13 g黃色固體，為熒光探針QL-N3，收率為29.4%，熔點(diǎn)為103～105 ℃。氫譜1H NMR (400 MHz，CDCl3)化學(xué)位移: 8.99 (雙重雙峰dd，耦合常數(shù)= 4.1，1.6 Hz，1H)，8.75 (dd，= 8.5、1.7 Hz，1H)，7.78 (d,= 7.9 Hz，1H)，7.65 (dd，= 6.5、3.2 Hz，2H)，7.60 (dd，= 8.5、4.2 Hz，1H)，7.47～7.41 (m，3H)，7.38 (雙峰d，= 7.9 Hz，1H)。碳譜13C NMR (101 MHz，CDCl3):149.76、141.16、137.68、135.03、131.64、130.71、129.56、128.77、128.55、122.81、122.58、117.84、117.47、95.07、85.89。高分辨質(zhì)譜HRMS: C17H11N4理論值 271.098 4，實(shí)測值271.100 4。

3 結(jié)果與討論

3.1 熒光性能

首先考察熒光探針QL-N3對(duì)H2S熒光響應(yīng)的比率型特點(diǎn)，如圖2所示。向探針濃度為5 μmol×L-1的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(1.0×10-2mol×L-1，pH 7.4，質(zhì)量分?jǐn)?shù)40% 的二甲基亞砜(DMSO))加入120 μmol×L-1H2S，利用UV-2700 型分光光度計(jì)獲得加入H2S前后的紫外吸收光譜，如圖2(a)；利用Hitachi F-4500型熒光光譜儀獲得加入H2S前后的熒光發(fā)射光譜變化，如圖2(b)。結(jié)果表明，在加入H2S前，探針QL-N3的紫外最大吸收峰位于345 nm，溶液表現(xiàn)出明顯的藍(lán)色熒光，最大熒光發(fā)射峰位于435 nm；與H2S反應(yīng)后，發(fā)生明顯紅移，最大吸收峰紅移至390 nm，最大熒光發(fā)射峰紅移至525 nm，表現(xiàn)出明顯比率型特點(diǎn)。

圖2 探針QL-N3(5 μmol×L-1)對(duì)H2S(0 μmol×L-1和120 μmol×L-1)的熒光響應(yīng)

為了了解QL-N3對(duì)H2S的熒光識(shí)別過程，采用高效液相色譜和質(zhì)譜對(duì)樣品溶液進(jìn)行了分析。QL-N3(濃度5 μmol×L-1)與H2S(濃度60 μmol×L-1)反應(yīng)5 min后，有2個(gè)明顯的峰值，分別對(duì)應(yīng)于QL-N3和QL-NH2。同時(shí)，高分辨質(zhì)譜結(jié)果顯示，[QL-N3+H]的質(zhì)荷比峰值出現(xiàn)在/=271.100 4處。[QL-NH2+H]的質(zhì)荷比峰值出現(xiàn)在=245.109 5處。這些結(jié)果表明，紫外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜顯示的熒光響應(yīng)是由H2S還原QL-N3生成QL-NH2引起的。

進(jìn)一步研究了熒光探針QL-N3對(duì)不同離子和活性分子的熒光響應(yīng)能力(1：GSH、2：Cys、3：Na+、4：Ca2+、5：Zn2+、6：Cl-、7：Br-、8：F-、9：CO32-、10：SO42-、11：N3-、12：NO32-、13：SO32-、14：Hcy、15：Gly、16：Lys、17：Glu、18：H2S)，如圖3所示，向探針濃度為5 μmol×L-1的PBS溶液(濃度為1.0′10-2mol×L-1，pH 7.4，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的DMSO)中加入120 μmol×L-1常見金屬離子(Na+、Ca2+、Zn2+)，陰離子(Cl-、Br-、F-、CO32-、SO42-、N3-、NO32-、SO32-)，活性分子(Hcy、Cys、GSH、Gly、Lys、Glu、H2S)，如圖3(a)。525nm435nm表示在熒光發(fā)射光譜525和435 nm處的強(qiáng)度比值，如圖3(b)。結(jié)果表明，與其他離子或者活性分子相比，僅有H2S能夠使熒光探針發(fā)生熒光強(qiáng)度變化和熒光光譜紅移，表現(xiàn)出對(duì)H2S的較高選擇性。

圖3 探針QL-N3 (5 μmol×L-1)對(duì)不同離子和活性分子(120 μmol×L-1) 的選擇性

研究探針QL-N3在不同H2S濃度下的熒光性能，向探針濃度為5 μmol×L-1的PBS溶液(濃度為1.0′10-2mol×L-1，pH 7.4，質(zhì)量分?jǐn)?shù)40% DMSO)中分別加入濃度為0、20、40、60、80、100、120、140 μmol×L-1的H2S溶液，其熒光發(fā)射光譜如圖4所示。隨著H2S濃度的增大，探針溶液的在525 nm 處熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，且525 nm/435nm在0～120 μmol×L-1呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(相關(guān)系數(shù)2=0.990 86)。計(jì)算得到探針的檢測極限為 1.8×10-8mol×L-1。同時(shí)，以羅丹明B(熒光量子產(chǎn)量為0.69)作為標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)[25-26]，探針在PBS溶液中與H2S反應(yīng)前后的熒光量子產(chǎn)率分別為0.12和0.48。結(jié)果表明，探針QL-N3對(duì)H2S檢測靈敏度較高。

圖4 探針QL-N3(5 mmol×L-1)對(duì)不同H2S濃度 (0 ～120 mmol×L-1)的熒光響應(yīng)

3.2 響應(yīng)時(shí)間

研究探針QL-N3對(duì)H2S的熒光響應(yīng)速度，向探針濃度為5 μmol×L-1的PBS溶液(濃度為1.0′10-2mol×L-1，pH 7.4，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40% 的DMSO)中加入濃度為120 μmol×L-1的H2S，檢測在不同時(shí)間下525 nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度變化，如圖5所示。結(jié)果表明，探針QL-N3與H2S反應(yīng)迅速，在30 s內(nèi)即可完成檢測，具有H2S快速響應(yīng)的特點(diǎn)。

圖5 探針QL-N3(5 μmol×L-1)對(duì)H2S (120 μmol×L-1)響應(yīng)時(shí)間

3.3 細(xì)胞成像

在探針QL-N3用于人宮頸癌細(xì)胞(HeLa cell) H2S熒光成像之前，研究探針的細(xì)胞毒性。分別選取濃度為0、10、20、50 μmol×L-1的探針溶液與HeLa細(xì)胞孵化48 h，采用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽比色法(MTT法)，獲得HeLa細(xì)胞的存活率數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，探針QL-N3對(duì)HeLa細(xì)胞毒性較弱，適合進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)H2S熒光成像。

研究了QL-N3用于HeLa細(xì)胞H2S共聚焦熒光成像效果。首先，向HeLa細(xì)胞中加入探針QL-N3(濃度為5 μmol×L-1)，孵育10 min后，僅觀察到探針本身的藍(lán)色熒光(如圖6(a)所示)。接著，使用PBS 緩沖液對(duì)上述細(xì)胞洗滌3次，最后，加入外源性H2S (60 μmol×L-1)繼續(xù)孵育10 min，觀察到明顯的綠色熒光(如圖6(b)所示)。從熒光成像效果來看，熒光探針QL-N3可以有效減少激發(fā)光源和光漂白效應(yīng)引起的干擾，表現(xiàn)出較好的比率型H2S熒光成像特點(diǎn)(如圖6(c)所示)。

圖6 探針QL-N3用于HeLa細(xì)胞H2S共聚焦熒光成像

4 結(jié)論

設(shè)計(jì)合成了一種新型快速響應(yīng)的比率型H2S熒光探針QL-N3，具有選擇性好、檢測靈敏度高(檢測極限為1.8′10-8mol×L-1)、檢測速度快(30 s)和生物相容性好等特點(diǎn)。該熒光探針表現(xiàn)出良好的熒光發(fā)射比率型特點(diǎn)，有效減少激發(fā)光源和光漂白效應(yīng)引起的成像干擾，為進(jìn)一步進(jìn)行生物體內(nèi)H2S的定量檢測及熒光成像提供了有力工具，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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Synthesis and cell imaging of a ratiometric hydrogen sulfide fluorescent probe

FENG Cheng-jie1, LIU Jian1, WU Chun-lei1, SHEN Run-pu1, YANG Jin-wei2, DU Kui1

(1. College of Chemistry & Chemical Engineering, Shaoxing University, Shaoxing 312000, China;2. Zhejiang Anglikang Pharmaceutical Co. Ltd., Shaoxing 312000, China)

In order to quantitatively detect hydrogen sulfide (H2S) in tumor cells, background interference of fluorescence probes based on quinoline in live cell imaging should be reduced. A novel ratiometric H2S fluorescent probe QL-N3was designed and synthesized using the design strategy of H2S fluorescent probe based on azide reduction. The fluorescence quantum yield of the probe was improved through replacing 5-triazole with 5-alkyne. The results show that the fluorescence quantum yield of the probe increases to 0.12, which indicates ratiometric characteristics. Meanwhile, high selectivity, high detection sensitivity (detection limit was 1.8′10-8mol×L-1) and high detection rate (30 s) are maintained. The probe QL-N3demonstrates great potentials in H2S fluorescence imaging of HeLa cells.

hydrogen sulfide; fluorescent probe; ratiometric; fast response; fluorescene image

1003-9015(2021)06-1109-06

O657.3

A

10.3969/j.issn.1003-9015.2021.06.020

2020-10-13；

2020-12-23。

浙江省公益基金項(xiàng)目(LGG19B02002)；紹興文理學(xué)院博士研究啟動(dòng)基金(20185020)。

豐誠杰(1995-)，男，江西樟樹人，紹興文理學(xué)院碩士生。

杜奎，E-mail：dkui@usx.edu.cn