韋佳妮，趙慧函，蔣慶娟，文萃，黃欣欣，凌瑛，應燕萍

（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院護理部，廣西南寧530021）

中心靜脈導管（central venous catheter，CVC）是置入大靜脈的長、軟、細、中空的導管，使用CVC 在帶來便利的同時，其導致的并發(fā)癥不容忽略，尤其是導管相關血栓（catheter related thrombosis，CRT）形成[1-2]。CRT 是指因置管或導管直接損傷血管內膜及患者自身狀態(tài)等因素，使導管外壁或內壁血凝塊形成的過程[3]。目前CRT 的治療主要為抗凝和溶栓治療，其中抗凝治療目的是阻止血栓進一步發(fā)展，使血栓緩慢地自然機化再通，但并沒有加速血栓溶解過程[4]。溶栓治療可以快速去除血栓，但是其僅適用于新鮮形成的血栓，且在一些特殊病例獲利大于出血的風險時才推薦使用[5]。因此，血栓仍需自身緩慢機化再通，而血栓延遲溶解直接影響血栓后并發(fā)癥的發(fā)生及患者預后[6]。血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1）可通過介導復雜炎癥反應及炎癥依賴性，在血管新生、傷口的愈合、血管重塑過程發(fā)揮重要作用[7]。近年有研究發(fā)現(xiàn)，HO-1 在血栓的溶解再通過程中發(fā)揮重要作用[8]，目前對于血栓的研究中大多集中于深靜脈血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）[9]，而對于CRT 的溶解再通過程的研究較少，因此本研究通過構建大鼠CRT 模型，通過注射HO-1 激動劑與抑制劑，觀察HO-1 在血栓溶解再通中的作用效果，以期為臨床CRT 溶解再通過程及治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠72 只，周齡7～8 周，體質量200～250 g，購于廣西醫(yī)科大學動物實驗中心（SCXK 桂2020-0003），本實驗嚴格遵循實驗動物3R 原則，并通過廣西醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會審查（審批號：202008006）。

1.2 主要儀器及試劑

多功能酶標儀（Synergy H1，美國）、切片機（Leica，德國）、實時熒光定量PCR 儀（Bio-Rad，美國）、頸靜脈導管及堵頭（思科諾思生物科技有限公司，中國）、大鼠HO-1、IL-6、IL-10 ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，中國）、鈷原卟啉（Sigma，美國）、錫原卟啉（Senta Cruz Biotechnology，美國）、HE 染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，中國）、RPLP1 及HO-1 引物（上海生工生物工程股份有限公司，中國）、CD31 抗體（AF6191，Affinity Biosciences，美國）、通用二步法試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 造模方法 參照課題組前期實驗方法[10]，采用3%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）對大鼠進行腹腔注射麻醉，待麻醉滿意后，右側頸部備皮，常規(guī)消毒、鋪巾，沿氣管右側0.5 cm 縱切頸部1～2 cm，導管至上腔靜脈，縫合傷口，常規(guī)消毒。

1.3.2 分組及干預 課題組前期研究發(fā)現(xiàn)置管7 d后血栓高發(fā)，10 d 后血栓形成穩(wěn)定[11]。因此，本研究選取置管后10 d 經B 超確診血栓形成的大鼠CRT模型作為研究對象，采用動物隨機分組軟件將大鼠隨機分為模型組、HO-1 激動劑組、HO-1 抑制劑組，每組24 只。激動劑組和抑制劑組在置管10 d后分別腹腔注射鈷原卟啉（protoporphyrin IX cobalt chloride，CoPP）和錫原卟啉（tin protoporphyrin IX，SnPP）5 mg/kg 進行干預，模型組不做干預。

1.3.3 樣本采集 在干預后的第1、7、14、28 天，每個時間點隨機取6 只大鼠，大鼠麻醉后進行腹主動脈采血，離心收集血清后放置于-80 ℃冰箱，用于后續(xù)ELISA 檢測血清HO-1、IL-6、IL-10 濃度。剪開大鼠置管側皮膚，取自導管穿刺處至右心房上段血管，一部分血管用于病理切片染色；另一部分血管用于qPCR 檢測。

1.4 評價指標

1.4.1 血栓溶解再通情況 血管組織經包埋切片染色后，在光鏡下觀察血栓溶解再通情況，應用Image J 圖像分析軟件分析，使用以下公式計算各組血栓溶解率：溶解率=[（靜脈管腔面積-血栓面積）/靜脈管腔面積]×100%[12]。

1.4.2 CD31 免疫組化染色 血管組織切片、抗原修復后，加入一抗、二抗，DAB 顯色、蘇木素復染并在光學顯微鏡下觀察，計算其平均光密度值。

1.4.3 血清HO-1、IL-6、IL-10 含量 應用ELISA 法檢測大鼠HO-1、IL-6、IL-10 含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4.4 qPCR 檢測血管組織HO-1 mRNA 表達 使用TRIzol 提取總RNA，逆轉錄為cDNA 后，用SYBR Green 法進行PCR 擴增，設置復孔，實驗結果重復3 次。HO-1 序列：上游引物：5′-TCT GCA GGG GAG AAT CTT GC-3′，下游引物：5′-TTG GTG AGG GAA ATG TGC CA-3′。大鼠內參RPLP1 序列:上游引物：5′-AAA GCA GCT GGT GTC AAT GTT-3′，下游引物：5′-GCA GAT GAG GCT TCC AAT GT-3′。使用2-△△Ct 法分析qPCR 結果。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 24.0 軟件進行數(shù)據處理。計量資料用均數(shù)±標準差（±s）描述。不同組之間采用單因素方差分析比較，若方差齊，則使用LSD 法進行兩兩比較，若方差不齊，則使用TamhaneT2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠基本情況及CRT病理形態(tài)

大鼠術后精神狀態(tài)良好，存活率為100%，置管成功率為100%，導管留置期間無導管脫出。干預1 d 后可觀察到各組CRT 形成趨于穩(wěn)定，血栓膠原蛋白成分增多，并可見肉芽組織從靜脈壁向血栓中心形成，血栓開始機化。隨著時間增加，血栓體內部裂隙擴大，并可見有新生管腔樣結構形成。至干預28 d 后，在血栓內部形成新的血管相互吻合再通，使被阻塞的血管部分血流重建，其中HO-1 激動劑組接近完全再通，HO-1 抑制劑組中管腔內有紅細胞形成，僅部分再通（圖1）。

圖1 各組干預不同時間點大鼠血管內血栓HE染色（×50）Figure 1 HE staining of thrombosis in the blood vessel in rats in each group at different time points(×50)

2.2 各組血栓溶解率

各組血栓溶解率隨時間增長而增加。其中，HO-1 激動劑組各個時間點血栓溶解率高于模型組，而HO-1 抑制劑組均低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05 或P＜0.01）（表1）。

表1 各組不同時間點血栓溶解率（%，±s)Table 1 Comparison of thrombolysis rates in each group at different time points(%,±s)

表1 各組不同時間點血栓溶解率（%，±s)Table 1 Comparison of thrombolysis rates in each group at different time points(%,±s)

注：1）與模型比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.01Note:1)P＜0.05 vs.model group;2)P＜0.01 vs.model group

第28天69.830±0.016 88.132±0.0192）48.186±0.0212）221.516＜0.001組別模型組HO-1激動劑組HO-1抑制劑組FP第1天13.827±0.002 19.903±0.0142）10.421±0.0101）39.938＜0.001第7天22.902±0.017 42.105±0.0171）17.883±0.0192）103.329＜0.001第14天43.042±0.017 69.389±0.0262）35.697±0.0211）128.011＜0.001

2.3 血管組織CD31的免疫組化檢測

免疫組化結果顯示，CD31 表達于血管內皮間隙，與模型組比較，干預后各時間點HO-1 激動劑組中CD31 的表達明顯增高，而HO-1 抑制劑組中CD31 的表達減少，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（圖2）（表2）。

表2 各組不同時間點CD31平均光密度值的變化(±s)Table 2 Changes in CD31 average optical density at different time points in each group(±s)

表2 各組不同時間點CD31平均光密度值的變化(±s)Table 2 Changes in CD31 average optical density at different time points in each group(±s)

注：1）與模型組比較，P＜0.01Note:1)P＜0.01 vs.model group

第28天0.047±0.001 0.067±0.0011）0.033±0.0021）240.319＜0.001組別模型組HO-1激動劑組HO-1抑制劑組FP第1天0.008±0.001 0.014±0.0011）0.003±0.0011）121.525＜0.001 0.016±0.001 0.025±0.0011）0.010±0.0011）114.515＜0.001第7天第14天0.031±0.001 0.048±0.0011）0.018±0.0011）274.039＜0.001

圖2 各組不同時間點血管CD31免疫組織化學染色（×100）Figure 2 Immunohistochemical staining of CD31 at different time points in each group（×100）

2.4 各組不同時間點HO-1、IL-6、IL-10含量變化

干預后各時間點，HO-1 激動劑組HO-1、IL-10含量均高于其他兩組，而IL-6 含量均低于其他兩組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。HO-1 抑制劑組干預后各時間點HO-1、IL-10 含量均低于模型組，IL-6 含量均高于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（圖3）。

圖3 各組不同時間點HO-1、IL-6、IL-10含量變化Figure 3 Changes of HO-1,IL-6 and IL-10 content in each group at different time points

2.5 各組不同時間點HO-1 mRNA表達情況

HO-1 激動劑組干預后各時間點血管組織中HO-1 mRNA 表達均高于其他兩組，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；HO-1 抑制劑組干預后各時間點HO-1 mRNA 表達均低于其他兩組，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（圖4）。

圖4 各組不同時間點HO-1 mRNA表達情況變化Figure 4 Changes in HO-1mRNA expression in each group at different time points

3 討論

前期已成功構建大鼠CRT 模型，并且通過B 超、病理切片染色等觀察CRT 發(fā)生發(fā)展過程，對CRT形成過程進行了動態(tài)研究。發(fā)現(xiàn)大鼠置入CVC 后1～4 d 為CRT 的形成階段；7～10 d 為CRT 形成高發(fā)時段；10～14 d 為CRT 機化發(fā)展階段，14 d 血栓開始消退[10-11]。因此，導管留置10 d 是觀察CRT 形成的一個關鍵時間點。本研究選用導管留置10 d 后血栓形成穩(wěn)定的大鼠CRT 模型，在前期研究基礎上進一步研究血栓溶解再通的過程。付健等[13]發(fā)現(xiàn)大鼠下腔靜脈血栓的自然溶解演變過程伴隨血管新生，其自然溶解演變過程與本研究相似。

HO-1 是一種誘導酶，其可催化血紅素氧化為一氧化碳（CO）、鐵和膽綠素（BV），這些產物可分別通過不同途徑發(fā)揮抗炎癥損傷和抗氧化應激損傷的作用[14]。在血管組織中，HO-1 保護內皮細胞免受各種誘導刺激，在傷口的愈合、血管重塑過程發(fā)揮重要作用，其具有免疫調節(jié)作用和促進血管新生功能[15]。同時，HO-1 在冠狀動脈粥樣硬化、急性腦梗死等疾病進展過程中具有抗氧化、減輕炎癥反應的作用[16]。IL-6 是一種炎癥反應因子，能夠促進炎癥反應；而IL-10 作為一種抗炎因子，能夠抑制促炎因子的釋放，從而抑制炎癥反應[17]。HO-1 被IL-6 高度誘導，而HO-1 負調控IL-6，這表明HO-1 和IL-6 之間存在負反饋循環(huán)；而IL-10和HO-1 通過正反饋環(huán)相互聯(lián)系，IL-10 誘導可促進HO-1 高表達，從而可發(fā)揮其抗炎作用[18-19]。南川川等[20]研究發(fā)現(xiàn)HO-1 能夠增加膿毒癥大鼠腎臟中血栓調節(jié)蛋白（thrombomodulin，TM）表達，發(fā)揮抗凝血及抗炎作用，從而改善膿毒癥大鼠的腎臟功能。同時，越來越多的證據支持HO-1 誘導在血管損傷中的抗血栓作用，在DVT 形成早期，HO-1可通過減輕氧化應激、抑制血小板功能和抑制炎癥反應等機制來實現(xiàn)抑制DVT 的形成[8]。在小鼠靜脈血栓模型中，經HO-1 基因轉染后，血栓顯著減少，血紅素誘導的HO-1 上調也降低了血凝塊形成和纖溶酶原激活因子抑制物（PAI） 水平，表明HO-1 可能通過其分解產物直接發(fā)揮抗血栓作用[7,21]。先前有研究發(fā)現(xiàn)，誘導HO-1 高表達后，DVT 機化程度和溶解速度明顯加快，抑制HO-1 表達后，其機化速度和溶解速度明顯減慢[22]。這與本研究的結果相似，在本研究中，不同時間點HO-1 激動劑組血栓溶解率均高于模型組，HO-1 抑制劑組血栓溶解率均低于模型組，由此證明HO-1能促進血栓的溶解再通。

靜脈血栓的溶解對于血管恢復通暢至關重要，其過程類似于正常的傷口愈合過程。需要纖維蛋白溶解、蛋白水解作用、炎癥和血管生成的協(xié)調作用[23]。血栓形成后，血管壁和白細胞產生的活性氧通過氧化血栓內紅細胞的血紅蛋白，生成并釋放游離亞鐵血紅素；其具有促炎和氧化作用，能加強炎癥反應和凝血之間的相互作用，因此促進血液在血栓表面凝固，從而延遲DVT 的溶解；然而這種氧化能力和促炎可被HO-1 中和[8,24]。本研究發(fā)現(xiàn)HO-1 促進CRT 溶解過程中，炎癥因子IL-6水平降低，而抑炎因子IL-10 升高，由此說明HO-1的抗炎反應可能有助于血栓溶解。而新生血管形成是血栓溶解再通的關鍵，血栓機化初期，血栓從血管壁回縮，導致在血栓主體和靜脈壁內膜之間形成內皮細胞內襯的口袋樣及裂縫結構，形成新的血管腔并相互融合擴大，逐漸恢復成血栓前狀態(tài)，使堵塞的靜脈恢復血流[25]。CD31 作為一種黏附性應激反應蛋白，在內皮細胞細胞連接高表達，是血管新生的標志物，既能維持內皮細胞連接的完整性，又能在炎癥或血栓形成后加速血管通透性屏障的修復[26]。本研究通過對血管組織中的CD31 進行檢測并分析，發(fā)現(xiàn)HO-1 激動劑組血栓溶解加快，其CD31 表達升高，表明誘導HO-1 表達可促進CRT 溶解再通，其機制可能與其促進新生血管形成功能有關。一項研究發(fā)現(xiàn)通過藥物誘導HO-1 表達和基因修飾都能促進小鼠心肌梗死后的心肌新生血管生成，最終減輕心肌損傷，改善心功能[27]。近期也有研究表明，HO-1 可促進內皮祖細胞（EPCs）的增殖動員及遷移，并聚集至損傷區(qū)域向新生內皮細胞分化，從而促進血管修復并能增強其活力及抗氧化應激損傷能力，這可能是HO-1 促進血管新生的關鍵機制[28]。因此，HO-1 能促進CRT 的溶解再通，可能與抑制炎癥反應，促進血管新生的功能有關。

綜上所述，HO-1 是組織細胞應對損傷性刺激的一種內源性適應保護方式，且多項研究均證實HO-1 在促進血栓溶解再通中具有重要作用，可通過多種途徑和機制促進血栓溶解，其中主要的機制是HO-1 及其分解產物的抑制炎癥反應及促血管新生作用。誘導HO-1 表達從而修復血管，抑制炎癥反應已在不同研究中發(fā)現(xiàn)其臨床應用價值，一項研究發(fā)現(xiàn)水蛭提取物可通過上調HO-1 表達，提高抗氧化能力，減少氧化應激和減輕血管損傷，從而預防血栓形成[29]；Wu 等[30]表明銀杏葉提取物可誘導HO-1 表達對鋼絲損傷后血管修復中起關鍵作用；Zheng 等[31]發(fā)現(xiàn)在血管移植中的PU 管壁內加入天麻素，可激活HO-1，具有促進血管再生，抑制炎癥的潛力。因此繼續(xù)深入研究HO-1 在血栓溶解再通中促進血管生成，抑制炎癥的作用機制及效果，可能會為未來驗證HO-1 作為血管修復和相關疾病的潛在治療策略的藥理誘導作用提供新的理論基礎。