郭利娜，宮 強，張 彬，陳艷楠

（河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽471023）

牡蠣是全世界分布和養(yǎng)殖范圍最廣的海洋生物之一，其含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)，以及海洋生物特有的多種活性物質(zhì)，營養(yǎng)價值豐富[1]。我國是牡蠣養(yǎng)殖大國，其年產(chǎn)量可達487.9萬t，分別占全國海水養(yǎng)殖產(chǎn)量和貝類產(chǎn)量的24.4%和34.0%[2]。目前，我國牡蠣產(chǎn)品主要以鮮食或肉干產(chǎn)品為主，高附加值加工技術(shù)仍有待開發(fā)。

牡蠣中蛋白質(zhì)含量較高，通常占牡蠣肉干的45%～57%[3]，其水解后所產(chǎn)生的多肽顯示出多種生物活性，其中已報道的牡蠣蛋白源活性肽包括血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽[4]、抗菌肽[5]、抗癌肽[6]、Zn-螯合肽[7]等。因此，使用牡蠣蛋白開發(fā)具有良好生物活性的多肽產(chǎn)品為提高牡蠣附加值利用提供了重要思路。

鈣是人體中重要的微量元素，鈣缺乏將導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，甚至誘發(fā)高血壓、腎結(jié)石和結(jié)腸癌等疾病[8]。目前，鈣缺乏的治療依賴于鈣補充劑，特別是有機鈣補充劑的使用。作為有機鈣補充劑中的一種，肽-鈣螯合物的研究越來越受到重視。當(dāng)作為鈣的遞送載體使用時，肽具有運輸速度快、能量消耗少等優(yōu)勢[9]。近年來，已從多種來源的蛋白，包括鵝骨膠原蛋白[10]、大豆蛋白[11]、酪蛋白[12]和小麥胚芽蛋白[13]制備獲得了鈣-肽螯合物。然而，目前針對牡蠣蛋白源鈣離子螯合肽的研究較少。因此，基于實驗室前期對牡蠣肽活性的篩選，通過酶解法從牡蠣蛋白制備了鈣離子螯合肽并對酶解產(chǎn)物進行了性質(zhì)分析，從而為牡蠣蛋白的高附加值利用提供了重要科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

牡蠣蛋白，陜西一諾生物科技有限公司提供；風(fēng)味蛋白酶（Flavourzyme）、堿性蛋白酶（Alcalase 2.4l）、復(fù)合蛋白酶（Protamex）、中性蛋白酶（Neutrase），諾維信公司提供；胃蛋白酶、胰蛋白酶和鄰甲酚酞絡(luò)合酮，Sigma-Aldrich公司提供；木瓜蛋白酶，上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供；細胞色素C、抑肽酶、桿菌肽、亮抑酶肽、丙谷二肽，生工生物工程（上海）股份有限公司提供；色譜純乙腈，賽默飛世爾科技有限公司提供；其他試劑均為分析純，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 儀器

L5S型紫外分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；Eclassical 3100型高效液相色譜儀，大連依利特分析儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 蛋白酶的篩選

蛋白酶的最適溫度和pH值見表1。

表1 蛋白酶的最適溫度和pH值

使用胰蛋白酶、胃蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶，對牡蠣蛋白進行水解研究。具體試驗條件如下：在各個蛋白酶的最適溫度和最適pH值條件下，以5%的底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，1/50的酶/底物比（E/S），在恒溫水浴振蕩器上水解4 h。水解結(jié)束后，加熱煮沸反應(yīng)混合物5 min以終止反應(yīng)，并將混合物以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心10 min，取上清液測定水解度和鈣螯合率。綜合考慮水解度和鈣螯合率兩者，選擇風(fēng)味蛋白酶進行后續(xù)優(yōu)化研究。

1.4 風(fēng)味蛋白酶水解牡蠣蛋白的單因素試驗

按照1.3中所述的方法，通過單因素試驗優(yōu)化風(fēng)味蛋白酶水解牡蠣蛋白的過程，具體方法如下：使用特定底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)（2%，4%，6%，8%，10%）和E/S（1∶100，1∶66.7，1∶50，1∶40，1∶33.3），在一定溫度（35，40，45，50，55，60℃）和pH值（4.0，5.0，6.0，7.0，8.0）條件，水解一定時間（1，2，3，4，5，6 h）。水解結(jié)束后，加熱煮沸反應(yīng)混合物5 min以終止反應(yīng)，并將混合物以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心10 min，取上清液測定水解度和鈣螯合率。

1.5 水解度的測定

采用OPA法測定蛋白水解度[14]，具體方法如下：將100 mmol/L的四硼酸鈉溶液25 mL、5% SDS溶液10 mL、水13.9 mL，OPA溶液1 mL、0.1 mL β-巰基乙醇混合以制備OPA測定溶液。取50 μL測試樣品與2 mL OPA測定溶液混合并在室溫下反應(yīng)8 min。反應(yīng)結(jié)束后，于波長340 nm處測定反應(yīng)物的吸光度。以甘氨酸-甘氨酸二肽作為標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定水解前（C1）和水解后（C2）反應(yīng)混合物中的氨基含量。基于公式（1）測定蛋白水解度DH：

式中：C1——水解前蛋白中的游離氨基含量，mol/L；

C2——水解后反應(yīng)混合物中的游離氨基濃度，mol/L；

C0——總氨基含量（根據(jù)凱氏定氮法測定）。

1.6 鈣螯合率的測定

參考Zhao L等人[15]的方法測定鈣螯合率，具體步驟如下：將5 mmol/L的氯化鈣溶液1 mL和0.2 mol/L pH值8.0的磷酸鹽緩沖液2 mL混合，然后向其中加入多肽樣品1 mL。將混合物在空氣浴振蕩器中，在37℃下反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，將混合物以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心10 min。離心結(jié)束后，以標(biāo)準(zhǔn)鈣離子溶液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用鄰甲酚酞絡(luò)合比色法測定上清液中的鈣離子含量，并根據(jù)公式（2）計算鈣離子螯合率：

1.7 多肽的分子量分布

通過高效液相色譜法[16]測定水解多肽的分子量分布，具體方法如下：使用配備有紫外檢測器的依利特Eclassical 3100型高效液相色譜，使用TSKgel 2000 SWXL型凝膠色譜柱（300 mm×7.8 mm），以乙腈∶水∶三氟乙酸（體積比為45∶55∶0.1）作為流動相，在進樣量20 μL，流速0.5 mL/min，柱溫37℃的條件下，于波長214 nm處測定吸光度。使用細胞色素C（12 362 Da）、抑肽酶（6 511.4 Da）、桿菌肽（1 423 Da）、亮抑酶肽（475.59 Da）、丙谷二肽（146.145 Da）作為標(biāo)準(zhǔn)品，以分子量對數(shù)（lg MW）為縱坐標(biāo)，以樣品保留時間為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算樣品分子量分布。

1.8 DPPH自由基清除活性

參考劉龍等人[17]的方法，如下所述進行DPPH自由基清除活性的測定：將DPPH溶解于無水乙醇，使其最終濃度為0.1 mmol/L（現(xiàn)用現(xiàn)配）。將0.5 mL牡蠣肽-鈣離子螯合物和牡蠣肽溶液與2.5 mL DPPH溶液混合，避光靜置30 min，以無水乙醇為參比，于波長517 nm處測定吸光度A1。同時，測定0.5 mL無水乙醇與2.5 mL DPPH溶液混合后的吸光度A2，和0.5 mL樣品溶液與2.5 mL無水乙醇混合后的吸光度A3。則DPPH自由基清除率按公式（3）計算為：

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

首先比較了不同蛋白酶對牡蠣蛋白的水解度和水解產(chǎn)物的鈣離子螯合率的影響。使用風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和復(fù)合蛋白酶水解后所獲得的牡蠣多肽的鈣離子螯合率較高，均在25%以上；使用復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶時，牡蠣蛋白的水解度較高，均大于30%。從水解度角度考慮，水解度越高則所產(chǎn)生的多肽片段數(shù)越多，同時所產(chǎn)生的多肽長度則越短，因此越利于吸收；而從鈣離子螯合率角度來看，由于不同蛋白酶的作用位點不同，因此水解產(chǎn)物顯示出不同的氨基或羧基末端，因而具有不同的高級結(jié)構(gòu)并顯示出不同的螯合率。由于研究的目的在于篩選高鈣離子螯合肽，因此在優(yōu)先考慮鈣離子螯合率并兼顧水解度的情況下，選擇風(fēng)味蛋白酶用于后續(xù)研究。

蛋白酶種類對水解度和螯合率的影響見圖1。

圖1 蛋白酶種類對水解度和螯合率的影響

2.2 風(fēng)味蛋白酶水解牡蠣蛋白的單因素試驗

2.2.1 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對水解度和螯合率的影響見圖2。

圖2 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對水解度和螯合率的影響

隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，牡蠣蛋白的水解度逐漸降低，而鈣離子螯合率則呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢。在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)較小時，蛋白質(zhì)的水解度較高，因此水解片段中存在較多氨基酸，不利于鈣離子螯合；而在高質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，水解度顯著降低，所產(chǎn)生的水解片段長度加大，甚至一些鈣離子結(jié)合位點可能未充分暴露，導(dǎo)致鈣離子螯合率降低。因此，選擇6%的底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)進行后續(xù)試驗。

2.2.2 E/S的影響

E/S對水解度和螯合率的影響見圖3。

圖3 E/S對水解度和螯合率的影響

隨著E/S升高，用于反應(yīng)的蛋白酶逐漸增加，反應(yīng)速度加快，水解度升高。從鈣離子螯合率來看，當(dāng)E/S=1∶66.7時，鈣離子螯合率最大，顯示出水解度的變化導(dǎo)致了水解產(chǎn)物組成的顯著改變，從而對鈣離子螯合率有較大影響。因此，選擇E/S=1∶66.7進行后續(xù)試驗。

2.2.3 水解時間的影響

水解時間對水解度和螯合率的影響見圖4。

圖4 水解時間對水解度和螯合率的影響

隨著反應(yīng)時間的延長，水解度逐漸升高，而鈣離子螯合率在前4 h逐漸升高，隨后輕微降低。張文婷[18]和龐忠莉[19]分別在研究藍圓鲹和牡蠣水解產(chǎn)物對二價鐵離子的結(jié)合中發(fā)現(xiàn)隨著水解時間的延長，水解度逐漸升高，而金屬離子螯合率則隨水解時間先升高并隨后保持基本不變，該趨勢與研究結(jié)論類似。因此，選擇水解4 h作為最優(yōu)條件進行后續(xù)試驗。

2.2.4 水解溫度的影響

水解溫度對水解度和螯合率的影響見圖5。

圖5 水解溫度對水解度和螯合率的影響

由圖5可以看出，水解度在50℃時達到最大，這與風(fēng)味蛋白酶的最適水解溫度一致。在該溫度下，鈣離子螯合率也達到最大。因此，選擇50℃作為最優(yōu)條件進行后續(xù)試驗。

2.2.5 pH值的影響

pH值對水解度和螯合率的影響見圖6。

圖6 pH值對水解度和螯合率的影響

由圖6可以看出，水解度在pH值7.0時達到最大，這與風(fēng)味蛋白酶的最適水解pH值（6.0）有所偏差，表明以牡蠣蛋白作為底物時，風(fēng)味蛋白酶的最適pH值為7.0。同時，鈣離子螯合率在pH值7.0時也達到最大。通過單因素優(yōu)化試驗，確定當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，E/S=1∶66.7時，在溫度50℃，pH值7.0條件下水解4 h，此時鈣離子螯合率達到38.98%，水解度達到43.6%。

2.3 牡蠣肽的分子量分布

牡蠣肽的分子量分布圖見圖7。

圖7 牡蠣肽的分子量分布圖

通過高效液相排阻色譜法測定了牡蠣肽的分子量分布。根據(jù)液相色譜結(jié)果，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算曲線下面積得到了牡蠣肽的具體分子量分布范圍（見表2），結(jié)果表明絕大部分的牡蠣肽的分子量小于1 kDa，從而表明水解后的多肽以約八肽或更小的多肽為主。研究表明，分子量分布與鈣離子結(jié)合能力有關(guān)，具有鈣離子結(jié)合能力的肽的分子量通常小于2 kDa，這從一個方面解釋了試驗中所獲得的牡蠣肽的高鈣離子結(jié)合能力[20]。

牡蠣肽的分子量分布見表2。

表2 牡蠣肽的分子量分布

2.4 DPPH自由基清除活性

鈣離子螯合肽的DPPH自由基清除能力見圖8。

圖8 鈣離子螯合肽的DPPH自由基清除能力

由圖8可以看出，所制備的牡蠣肽除能夠與鈣離子螯合外，其還具有一定的抗氧化能力，在1.0 mg/mL條件下，其DPPH自由基清除率達到33.5%，因此具有良好的應(yīng)用價值。

3 結(jié)論

（1）以水解度和螯合率為指標(biāo)，通過水解試驗，篩選出風(fēng)味蛋白酶作為最適于制備牡蠣蛋白源鈣離子螯合肽的蛋白酶。

（2）通過單因素試驗研究了使用風(fēng)味蛋白酶從牡蠣蛋白制備鈣離子螯合肽的方法，結(jié)果表明當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，酶∶底物（E/S）比為1∶66.7時，在溫度50℃，pH值7.0條件下水解4 h，鈣離子螯合率達到38.98%，水解度達到43.6%。

（3）通過高效液相排阻色譜法測定了鈣離子螯合肽的分子量分布，結(jié)果顯示絕大部分牡蠣肽的分子量分布范圍在1 kDa以下，表明水解后所獲得的多肽以八肽或更小的多肽為主。

（4）通過DPPH自由基清除試驗顯示，1 mg/mL的鈣離子螯合肽的DPPH自由基清除率達到33.5%，表明試驗所制備的牡蠣蛋白源鈣離子螯合肽不僅可以作為鈣補充劑使用，同時還具有一定的抗氧化作用。