魏媛，朱雅男，楊衛(wèi)東

南京大學醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院，南京市口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，江蘇 南京（210008）

重度牙周炎是目前牙齒缺失的主要原因。目前臨床上基礎治療與手術治療的效果仍不理想，重度牙周炎需要增加新的輔助治療手段。Toll樣受體-4（Toll like receptor-4，TLR-4）是連接固有免疫和適應性免疫的關鍵橋梁［1］，在重度牙周炎發(fā)生發(fā)展中起雙刃劍的作用：疾病初期維護牙周組織的健康，炎癥后期加速牙周組織的破壞［2］。TAK-242是一種TLR-4信號的特異性抑制劑，通過與TLR-4胞內結構域中Cys747結合，抑制MyD88和TRIF途徑，抑制下游核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NFκB）信號激活，抑制下游細胞因子的釋放。眾多關于TLR-4調控的相關疾病的動物研究如風濕性關節(jié)炎、新生兒缺氧缺血性腦病、內毒素相關的骨骼肌萎縮均采用TAK-242作為TLR-4抑制劑，發(fā)現(xiàn)TAK-242通過抑制TLR-4/MyD88/NF-κB信號通路對疾病的癥狀起到緩解作用，具有作為藥物的開發(fā)潛力［3-5］。但TAK-242對牙周炎的療效尚不明確。本研究通過尾靜脈注射TLR-4抑制劑TAK-242觀察其對大鼠重度牙周炎骨質吸收的影響，為重度牙周炎輔助治療提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 18只3周齡雄性Wistar大鼠，體質量（200±10）g，購于四川大學華西實驗動物中心（合格證號：SCXK（川）2009-009）。

1.1.2 主要材料和儀器P.gingivalisATCC33277（口腔疾病研究國家重點實驗室提供）；甲基綠試劑盒（Sigma，美國）；抗酒石酸酸性磷酸酶試劑盒（Sigma，美國）；TAK-242（MCE，美國）；氯化血紅素；維生素K；酵母提取物；TSB培養(yǎng)基（成都達碩實驗有限公司，中國）；5-0無菌醫(yī)用絲線；Quantum FXμCT儀器（Perkin Elmer，美國）；光學顯微鏡（IX70-141，Olympus，日本）；顯微攝像系統(tǒng)（Olympus，日本）。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠重度牙周炎建模及尾靜脈注射TAK-242 將復蘇的牙齦卟啉單胞菌（P.gingivalis）ATCC33277接種至含有氯化血紅素（5μg/mL）、維生素K（0.5μg/mL）、酵母提取物（1 mg/mL）、5%無菌脫纖維羊血的TSB平板，37℃厭氧培養(yǎng)（10%H2+10%CO2+80%N2）5～7 d，挑取單克隆接種至上述TSB液體培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)過夜后將菌液稀釋至600 nm處光密度值（OD600）為0.1，加入5-0絲線厭氧培養(yǎng)至OD600為1，取絲線備用結扎。

18只三周齡雄性Wistar大鼠飼養(yǎng)于無菌（SPF級）環(huán)境中，1周適應性飼養(yǎng)后隨機分為3組（n=6），分別為：對照組、牙周炎組、TAK-242組。將牙周炎組及TAK-242組大鼠以5%水合氯醛溶液（劑量5 mL/kg）腹腔注射麻醉，取仰臥位，固定于鼠板，用含有P.gingivalisATCC33277菌的5-0絲線結扎大鼠雙側上頜磨牙牙頸部兩圈行重度牙周炎建模（圖1）。TAK-242組從絲線結扎第1天起，通過尾靜脈隔天注射1次溶于DMSO的TAK-242（2 mg/kg），對照組及牙周炎組則注射相同體質量比例的DMSO溶劑。第8周末脫頸處死大鼠，獲取大鼠上頜骨標本，4%多聚甲醛固定。本實驗已獲得四川大學實驗動物倫理委員會的批準（批準號：WCCSIRB-D-2015-104）。

1.2.2 牙槽骨micro-CT三維影像學分析 參照已有研究的方法［6］在掃描體素分辨率為10μm下對標本進行micro-CT掃描重建。測量上頜第一磨牙區(qū)6個位點釉牙骨質界（cementoenamel junction，CEJ）與牙槽骨嵴頂（alveolar bone crest，ABC）之間的距離。將牙體長軸與Y軸平行，近遠中向長軸與X軸平行，頜面與Z軸平行。由于腭側骨板較多，骨質較完整，分別測量第一磨牙腭側面近中根近中尖、近腭尖、近中腭溝3個位點的平均值與遠中根遠中尖、遠腭尖、遠中腭溝3個位點的平均值分別作為近遠中根CEJ-ABC的值。選取上頜第一磨牙根分叉區(qū)骨質作為興趣區(qū)（region of interest，ROI），CT-Analyser1.13軟件分析，進行三維重建及偽彩色編碼［7］。測量骨質參數(shù)：骨密度（mg/cm）、骨體積/總體積分數(shù)（%）、骨小梁數(shù)目（1/mm）、骨小梁分離度（mm）、骨小梁厚度（mm）和骨小梁結構模式指數(shù)（structure model index，SMI）。

1.2.3 牙槽骨HE染色組織學觀察 取固定的上頜骨標本常規(guī)脫鈣、脫水、浸蠟、包埋處理，制作硬組織切片，行HE染色，光學顯微鏡下觀察各組牙槽骨吸收的情況。

1.2.4 甲基綠染色與抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色定量分析 制備好的上頜骨切片行MG染色觀察骨組織吸收情況。TRAP染色觀察破骨細胞分布情況。光學顯微鏡下觀察，紫色多核巨細胞（細胞核3個及以上）即為破骨細胞，染色結果采用Image-Pro Plus 6.0進行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有計量資料數(shù)據(jù)用表示。組間差異使用獨立樣本t檢驗，單因素方差分析（one-way analysis of variance ANOVA）及Tukey's方法進行檢驗比較（P＜0.05）。

2 結 果

2.1 Micro-CT掃描結果

通過micro-CT掃描上頜骨后的三維重建可以清晰地看到：牙周炎組的上頜第一磨牙牙槽骨骨缺損量都是最高的，TAK-242組牙槽骨的喪失顯著降低（圖2a～2c）。矢狀位切面圖顯示了上頜第一磨牙根分叉區(qū)牙槽骨的形態(tài)，各組之間根分叉區(qū)牙槽骨骨吸收變化呈現(xiàn)三維圖的相同趨勢（圖2d～2f）。

Figure 2 Three-dimensional reconstruction of alveolar bone by micro-CT圖2 牙槽骨micro-CT三維重建圖像

定量分析顯示：TAK-242組大鼠上頜第一磨牙近、遠中根吸收位點的骨喪失相對牙周炎組均顯著減輕，各組近中根位點吸收差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。通過micro-CT進行的骨參數(shù)分析顯示，與牙周炎組比較，TAK-242組骨礦物質密度顯著增加（P＜0.05），骨體積分數(shù)顯著高于牙周炎組（P＜0.01），而骨小梁數(shù)量與牙周炎組比較無顯著差異，骨小梁厚度值顯著增加（P＜0.01），骨小梁分離度顯著下降（P＜0.01），骨小梁結構模式指數(shù)降低，但差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 各組micro-CT測量參數(shù)值Table 1 The micro-CT measure parameter values in each group ±s,n＝6

表1 各組micro-CT測量參數(shù)值Table 1 The micro-CT measure parameter values in each group ±s,n＝6

MP:mesial palatal root;DP:distal palatal root;BMD:bone mineral density;BV/TV:bone volume/total volume fraction;Tb.N.:number of trabeculae;Tb.Th.:trabeculae thickness;Tb.Sp.:trabecular separation;SMI:structure model index;P1:control group vs.periodontitis group;P2:control group vs.TAK-242 group;P3:periodontitis group vs.TAK-242 group

Group Bone loss/mm BMD/(mg/cm)BV/TV Tb.N./(1/mm)Tb.Th./mm Tb.Sp./mm SMI P1 P2 P3 MP DP Control 1.170±0.162 0.661±0.102 977.28±29.09 0.630±0.058 6.990±1.187 0.152±0.029 0.094±0.018 0.68±0.92 Periodontitis 1.685±0.068 1.600±0.200 868.25±32.09 0.389±0.116 7.559±1.100 0.099±0.009 0.130±0.039 1.32±0.90 TAK-242 1.464±0.114 1.362±0.144 951.01±59.85 0.576±0.065 8.188±1.813 0.117±0.008 0.077±0.013 0.88±1.38＜0.001 1.878＜0.001 0.001 0.409 0.002 0.062 0.031 0.011 3.241 0.356 0.162 0.066 0.016 0.089 0.743 0.011 0.062 0.014 0.006 0.308 0.004 0.009 0.130

2.2 骨小梁結構重建結果

ROI區(qū)域內區(qū)骨小梁結構三維重建偽彩色編碼分析圖（骨小梁厚度圖與離散圖）如圖3所示。圖中藍色/綠色表示骨小梁厚度圖中較小的厚度和骨小梁離散圖中較小的離散度，紅色表示骨小梁厚度圖中的較大厚度和骨小梁分散圖中較大的離散度。與對照組和TAK-242組的板狀骨小梁結構相比，牙周炎的骨小梁呈現(xiàn)疏松多孔的蜂窩狀結構。骨小梁厚度圖中牙周炎組高質量厚度的骨小梁紅色區(qū)域不明顯，TAK-242組骨小梁厚度紅色區(qū)域分布顯著增多；與此相反，骨小梁離散圖中牙周炎組緊密排列的骨小梁綠色區(qū)域分布松散，密度低，TAK-242組綠色區(qū)分布致密，密度高。由以上結果可見，牙周炎組骨小梁厚度降低，骨小梁間距增加，小梁骨結構惡化；TAK-242組牙槽骨骨質微結構改善，骨量改善，骨小梁分布相對更致密，骨小梁結構與對照組更相似。

Figure 3 Three-dimensional reconstruction pseudocolor coding map of the microstructure of alveolar bone trabecular bone in ROI圖3 ROI區(qū)域骨小梁結構三維重建偽彩色編碼圖

2.3 HE染色結果

HE染色后的組織病理切片顯示對照組結合上皮位于釉牙骨質界處，無明顯炎性細胞浸潤，牙槽嵴未見吸收。牙周炎組大鼠牙齦結合上皮向根方增殖，附著喪失，炎性細胞浸潤，牙槽嵴高度降低，牙槽骨吸收明顯，表明牙周炎模型建模成功。而與牙周炎組相比，牙周炎TAK-242處理組牙周附著喪失與牙槽嵴吸收高度均降低。見圖4。

Figure 4 Pathological observation of each group of periodontal tissue by HE staining（×40）圖4 HE染色觀察各組牙周組織病理學改變（×40）

2.4 甲基綠染色與TRAP染色定量分析結果

甲基綠染色結果顯示對照組大鼠根分叉區(qū)牙槽骨形態(tài)規(guī)則，由完整連續(xù)的纖維連接牙根部，骨邊緣光滑完整，邊界清晰，未見明顯吸收陷窩。相較對照組，牙周炎組大鼠根分叉區(qū)牙槽骨吸收至根尖，僅見根尖1/3處分布少量牙槽骨，形態(tài)不規(guī)則，邊緣界限不規(guī)則，明顯的骨吸收陷窩和更豐富的骨髓腔結構。TAK-242組牙槽骨高度降低程度減輕，骨吸收在根上1/3，骨邊緣尚規(guī)整，界限清晰，骨吸收局限。見圖5。

Figure 5 Observation of alveolar bone resorption in the root furcation zone in each group by Methyl Green staining圖5 甲基綠染色觀察各組根分叉區(qū)牙槽骨吸收情況

TRAP染色顯示牙周炎組骨吸收彌散分布，骨吸收陷窩、骨髓腔間隙和牙周膜附著的骨表面均觀察到活躍的破骨細胞。TAK-242組可見骨吸收陷窩，少量破骨細胞浸潤，炎性細胞浸潤少。定量分析顯示：與牙周炎組相比，TAK-242組破骨細胞數(shù)量顯著減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。見圖6。

Figure 6 Observation and quantitative analysis of osteoclasts on the bone resorption site in each group by TRAPstaining圖6 抗酒石酸酸性磷酸酶染色觀察和定量分析各組破骨細胞分布情況

3 討 論

牙周致病菌通過LPS-TLR-4途徑長期刺激機體，一方面促進牙周組織細胞與免疫細胞表面核因子κB受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）的表達；同時介導細胞反應釋放的促炎因子如白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），進一步促進T細胞與B細胞表達核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL），顯著增加局部RANKL的表達。RANKL與破骨細胞或破骨細胞表面的RANK結合激活破骨細胞，引起骨吸收。研究發(fā)現(xiàn)TLR-4通過調節(jié)CD45+細胞浸潤、RANKL/骨保護素（osteoprotegerin，OPG）及炎性因子的產(chǎn)生，參與調控種植體周圍炎［8］。在動物實驗研究中，TLR-4基因敲除小鼠的根尖周炎的頜骨吸收減少，TLR-4功能缺陷小鼠實驗性牙周炎引起的牙槽骨吸收相對減少［9-10］。本實驗采用P.gingivalis菌液培養(yǎng)的絲線結扎構建重度牙周炎模型，P.gingivalis菌液培養(yǎng)的絲線促進局部菌斑的聚集并維持長期脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）-TLR-4反應，有利于構建重度牙周炎模型。

TLR-4不僅存在于單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等免疫細胞，也存在于牙齦成纖維細胞、牙周膜細胞、間充質干細胞、成牙骨質細胞、成骨和破骨細胞表面，表明TLR-4調控炎性反應骨吸收是涉及多種機制的復雜過程。TLR-4信號途徑不僅通過調控RANKL/RANK信號通路促進骨吸收，也通過免疫細胞如T細胞和B細胞雙向調控炎性反應中的破骨活動［11］。首先T細胞與B細胞均是牙周炎中RANKL的主要來源，干擾RANKL/OPG的比例，同時T細胞釋放和募集的抗炎因子，抑制局部過度免疫反應，促進組織穩(wěn)態(tài)恢復。體內研究表明牙周炎性位點募集大量的T細胞，降低局部炎性破壞，限制骨吸收，促進局部穩(wěn)態(tài)的建立［12］。研究證實在固有免疫和適應性免疫反應中P.gingivalis表面LPS通過激活TLR-4，誘導小鼠B10細胞的擴增和IL-10的分泌［13］。在小鼠牙周炎模型中，局部炎癥與骨吸收的控制與誘導組織局部B10細胞IL-10的分泌有關［14］。TLR-4激活不僅影響著破骨過程，也改變了成骨向性能。研究發(fā)現(xiàn)牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）表達有活性的TLR-4，TLR-4過度激活Wnt/β-catenin通路與NF-κB通路，減弱炎癥來源的PDLSCs成骨向分化過程與成骨能力。體外阻斷上述通路后，PDLSCs的成骨能力可以部分恢復；體內阻斷NFκB通路，LPS誘導的牙周骨缺損降低，牙周組織成骨能力增強，破骨向無顯著差異，提示NF-κB通路與牙周組織成骨能力有關［15］。近期研究也發(fā)現(xiàn)TLR-4介導的免疫反應釋放的細胞因子轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），通過調控免疫反應與細胞外基質代謝，促進牙骨質和牙槽骨重建。炎癥性骨吸收位點形成的低pH環(huán)境，通過破骨細胞分泌蛋白激酶活化大量的TGFβ，活化的TGF-β通過Smad2/3信號通路募集骨髓間充質干細胞遷移至骨改建區(qū)，誘導其成骨向分化［16］。而體外研究TLR-4激活后促進骨髓間充質干細胞增殖，減弱其遷移能力，對其成骨與免疫調節(jié)能力影響不大［15］。由此可見TLR-4通路調控成骨向活動亦是涉及多因子的復雜的雙向調控。

TAK-242作為特異性的TLR-4小分子抑制劑，選擇性抑制TLR-4下游信號通路和炎性因子的釋放，具有廣泛抗炎作用，在多種疾病研究中均發(fā)現(xiàn)TAK-242具有一定的藥物開發(fā)潛力。研究發(fā)現(xiàn)TAK-242在體外對卵巢癌細胞與急性髓系白血病癌細胞增殖具有抑制作用［17-18］。同時動物實驗研究也發(fā)現(xiàn)，TAK-242通過抑制TLR-4/NF-κB信號通路，可緩解過敏性鼻炎小鼠的嗅覺功能障礙［19］，減輕擠壓損傷誘導的大鼠急性腎損傷［20］。TAK-242對于TLR-4信號通路參與調控的疾病是一個很有價值的方向。

本研究發(fā)現(xiàn)TLR-4抑制劑TAK-242對大鼠重度牙周炎骨質吸收有顯著的影響，micro-CT系統(tǒng)定量分析骨質參數(shù)顯示：與對照組相比，牙周炎組骨密度、骨體積/總體積分數(shù)、骨小梁厚度均下降，骨小梁分離度增加，而骨小梁數(shù)目變化不大，提示牙周炎骨吸收可能是破骨向主導骨吸收，導致骨板質量下降所致；與牙周炎組相比，TAK-242組骨體積/總體積分數(shù)與骨密度，骨小梁厚度均增加，骨小梁數(shù)目相對增加不顯著，骨小梁分離度顯著縮小，表明新生骨小梁不增加，骨質密度增加是由于骨小梁骨板厚度的增加，腔隙的縮小改變所致。

通過骨小梁色彩編碼定性分析發(fā)現(xiàn)牙周炎組骨小梁結構嚴重變形，連接性顯著下降，排列紊亂，骨質結構紊亂惡化。骨小梁主要有3種顯微結構：桿狀、板狀和球形結構。骨小梁結構模式指數(shù)是用于評估桿狀和板狀結構比值的參數(shù)。牙周炎組骨小梁結構模式指數(shù)的增加表明骨小梁形態(tài)從板層向桿狀骨轉變，該種病理學改變導致骨力學功能的降低。炎癥后期骨質可能無法承受正常的咬合力，誘發(fā)壓力性骨喪失。TAK-242可以減少炎癥中板層骨斷裂，減少力學性能較低的低質量的桿狀骨、錐形骨的形成，改善炎癥骨的力學結構與性能。HE染色結果顯示，牙周炎組與TAK-242組牙周附著喪失與牙槽骨吸收較對照組顯著；甲基綠染色結果顯示，與牙周炎組相比，TAK-242組骨吸收減輕；TRAP染色顯示破骨細胞浸潤減少，骨吸收改善，TAK-242減輕重度牙周炎骨吸收。以上結果提示在炎性骨吸收中，TLR-4抑制劑TAK-242可能主要通過調控牙周組織破骨向能力影響骨吸收。

總之，本實驗通過構建大鼠重度牙周炎模型，發(fā)現(xiàn)TAK-242可能通過降低牙周異常增強的破骨向活動減輕牙周骨缺損，促進骨質改建，延緩牙周組織破壞，具有輔助治療重度牙周炎的潛力。TAK-242在骨質結構的改變中成骨與破骨向活動具體的主導機制及TLR-4的阻斷效果及其下游信號通路的調控機制仍需進一步研究。