曾許鵬,牛俊奇,2,Mahmood Aamir,陳炯宇,邢永秀,李楊瑞,3
(1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院,廣西 南寧 530004;2.玉林師范學(xué)院,廣西 玉林 537000;3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心/廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530007)
甘蔗是世界上最主要的糖料作物,我國(guó)的食糖總產(chǎn)量中有90%以上是來(lái)自蔗糖,而中國(guó)食糖總產(chǎn)量中則有60%以上的蔗糖產(chǎn)量來(lái)自廣西[1-3]。甘蔗新品種是糖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ),引進(jìn)、選育甘蔗新品種、開(kāi)展甘蔗基因克隆及轉(zhuǎn)基因育種是增加甘蔗種質(zhì)資源和強(qiáng)化種質(zhì)創(chuàng)新的重要途徑。采用傳統(tǒng)的甘蔗雜交育種是選育甘蔗優(yōu)良品種的重要途徑,但傳統(tǒng)甘蔗雜交育種周期長(zhǎng),人力物力耗費(fèi)量大。同時(shí),甘蔗是多倍體單子葉植物,遺傳背景復(fù)雜,雜交育種有時(shí)會(huì)出現(xiàn)某些性狀劣質(zhì)基因連鎖現(xiàn)象。因此,僅通過(guò)常規(guī)的雜交聚合各種甘蔗優(yōu)良性狀比較困難[4]。轉(zhuǎn)基因技術(shù)可對(duì)作物部分性狀進(jìn)行定向改良,能避免雜交育種過(guò)程出現(xiàn)的大量基因重組問(wèn)題,可以在很大程度上縮短育種時(shí)間,為培育具有優(yōu)良性狀甘蔗品種和高產(chǎn)高糖育種提供了有利手段[5-6]。蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SUT)負(fù)責(zé)蔗糖的跨膜運(yùn)輸,在韌皮部介導(dǎo)的源—庫(kù)蔗糖運(yùn)輸和庫(kù)器官的蔗糖供給中起著關(guān)鍵作用。在甘蔗葉片韌皮部,蔗糖的裝載主要是在質(zhì)外體中進(jìn)行,蔗糖在質(zhì)外體中的介導(dǎo)需要細(xì)胞膜的參與[7],而SUT在植物細(xì)胞質(zhì)膜上轉(zhuǎn)導(dǎo)蔗糖向韌皮部裝載的過(guò)程中起著非常重要的作用[8-9]。SUT與甘蔗蔗糖代謝密切相關(guān),其編碼的蛋白質(zhì)具有蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性[10]。但是,SoSUT5基因的功能還不清楚,通過(guò)轉(zhuǎn)基因并對(duì)其甘蔗后代的農(nóng)藝性狀及品質(zhì)進(jìn)行分析研究,可能為探討其功能提供參考依據(jù)。SUT在植物生長(zhǎng)和發(fā)育的過(guò)程中對(duì)蔗糖的運(yùn)輸和積累起著非常重要的作用。Riesmeier等首次從菠菜中克隆得到了第一個(gè)SUT蛋白,并證實(shí)了植物體內(nèi)SUT的存在[11]。目前,已經(jīng)從不同的甘蔗品種中克隆出了不同的SUT基因ShSUT4[12]、SoSUT1、SoSUT2、SoSUT3和SoUT5[13],并對(duì)基因的相關(guān)功能進(jìn)行了初步研究。相關(guān)聚類分析表明,蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分為SUT1、SUT2、SUT3、SUT4和SUT5共5個(gè)亞族[14],不同的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因行使著不同的功能,同一蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在不同的部位和不同生長(zhǎng)階段的表達(dá)量不同,對(duì)植物作用效果也不相同[15]。相關(guān)研究表明,將水稻中的OsSUT5轉(zhuǎn)化到馬鈴薯后,轉(zhuǎn)基因植株的淀粉和產(chǎn)量都比對(duì)照高[16]。本課題組??∑媸状螐母收嶂锌寺~@得SoSUT5基因,并通過(guò)轉(zhuǎn)SoSUT5酵母的生長(zhǎng)特性分析及SoSUT5基因表達(dá)與甘蔗糖分相關(guān)性分析證明SoSUT5基因能編碼有功能的SoSUT5蛋白,并參與植物糖分的積累和代謝調(diào)控[10]。B8是巴西推廣應(yīng)用面積較大的糖能兼用甘蔗品種,其田間表現(xiàn)為出苗率高和宿根發(fā)株率高,分蘗力強(qiáng),但蔗糖分相對(duì)比ROC22等甘蔗品種低[17]。Manickavasagam等利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將Bar基因?qū)敫收嶂?,獲得抗Basta除草劑甘蔗植株[18]。趙文慧通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將SoSUT5基因轉(zhuǎn)入低糖甘蔗品種B8,經(jīng)抗性篩選和檢測(cè)獲得了轉(zhuǎn)SoSUT5基因各陽(yáng)性單株(T0代)[19]。王露蓉分析了轉(zhuǎn)SoSUT5基因B8的第一代(T1)株系成熟期甘蔗+1葉葉面積、莖徑、株高和蔗莖中部可溶性總糖,發(fā)現(xiàn)SoSUT5基因在甘蔗中過(guò)表達(dá)可在一定程度上促進(jìn)甘蔗生長(zhǎng),提高蔗莖中部的可溶性總糖含量[20]。本研究于2018年至2019年分別調(diào)查了轉(zhuǎn)SoSUT5基因甘蔗株系和非轉(zhuǎn)基因甘蔗在T2和T3的部分農(nóng)藝性狀,測(cè)定了他們?cè)赥2、T3、T2R1、T2R2時(shí)的部分甘蔗品質(zhì),從表型上觀察甘蔗B8中轉(zhuǎn)入SoSUT5基因后甘蔗在第二代新植蔗(T2)、第三代新植蔗(T3)、第二代第一季宿根蔗(T2R1)和第二代第二季宿根蔗(T2R2)的生長(zhǎng)、農(nóng)藝性狀、蔗莖出汁率、蔗汁重力純度、蔗糖分積累等方面的表現(xiàn)情況,為轉(zhuǎn)基因甘蔗研究提供參考依據(jù)。
供試材料為從本課題組T1代轉(zhuǎn)SoSUT5基因甘蔗B8中經(jīng)檢測(cè)篩選出性狀較好的4個(gè)轉(zhuǎn)基因甘蔗株系(L1、L2、L3和L6),對(duì)照與轉(zhuǎn)基因甘蔗為同一批次組培苗后代的非轉(zhuǎn)基因野生型(WT)甘蔗B8株系[20]。所使用的肥料為金正大公司生產(chǎn)的控釋參混復(fù)合肥(N-P2O5-K2O=22-8-12),總養(yǎng)分大于等于42%。
試驗(yàn)于2018年3月至2019年12月在廣西大學(xué)甘蔗資源圃內(nèi)進(jìn)行(N22°50′,E108°17′),地處亞熱帶季風(fēng)季候,每年的降雨量主要集中在6~8月。試驗(yàn)地為旱地,紅壤土,地勢(shì)平坦,肥力中等,前季作物是甘蔗。對(duì)照和各轉(zhuǎn)基因品系甘蔗分別單行種植,同行排列,行長(zhǎng)13m,行距1.2m。選擇健康的甘蔗,砍成雙芽段,經(jīng)52℃處理4h后,再用50%多菌靈可稀釋粉劑800倍液浸種15min后下種。蔗種行雙行品字形排列,下種量為80芽/行。甘蔗兩側(cè)撒施復(fù)合肥(1200kg/hm2)及防治低下害蟲(chóng)農(nóng)藥。覆5~10cm土層蓋種,蓋上厚度為0.005~0.008mm地膜后噴施“甲·滅·敵草隆”選擇性除草劑。第二代新植蔗(T2)于2018年3月15日、第三代新植蔗(T3)于2019年3月17日進(jìn)行種植。試驗(yàn)分別于2018年6月25日和2019年6月30日進(jìn)行大培土。T2每行甘蔗于2019年1月30日砍除掉行長(zhǎng)為6.5m的甘蔗后及時(shí)進(jìn)行蔗園清理,留作宿根蔗(T2R1)栽培,余下的6.5m甘蔗作為第二代第二次宿根蔗(T2R2)栽培。第二代第一次宿根蔗(T2R1)和第二次宿根蔗(T2R2)于2019年3月20日進(jìn)行開(kāi)壟松兜,于4月16日與新植蔗施同量復(fù)合肥及農(nóng)藥后進(jìn)行大培土。
1.3.1 新植蔗出苗數(shù)、分蘗苗數(shù)、黑穗病苗數(shù)調(diào)查
試驗(yàn)分別在2018年4月28日和2019年4月30日調(diào)查甘蔗的出苗數(shù),在2018年6月11日和2019年6月30日調(diào)查甘蔗的分蘗苗數(shù)及黑穗病發(fā)病苗數(shù),并分別計(jì)算出苗率、分蘗率和黑穗病發(fā)生率。甘蔗黑穗病發(fā)病苗數(shù)調(diào)查后,對(duì)黑穗病株及時(shí)套袋砍除清理。出苗率=出苗出土總數(shù)/下種總芽數(shù)×100%,分蘗率=分蘗苗數(shù)/總苗數(shù)×100%,分蘗苗數(shù)=當(dāng)期總苗數(shù)-主莖苗數(shù),黑穗病發(fā)生率=黑穗病苗數(shù)/當(dāng)期總苗數(shù)×100%。
1.3.2 莖徑、株高、有效莖數(shù)調(diào)查
于每年甘蔗的成熟期時(shí)隨機(jī)選取15株健康主苗作為觀測(cè)株進(jìn)行莖徑和株高的調(diào)查。
1.3.3 單莖重調(diào)查和甘蔗品質(zhì)的測(cè)定
試驗(yàn)分別于每年甘蔗成熟期時(shí)進(jìn)行采樣,采樣時(shí)選擇無(wú)黑穗病癥狀和無(wú)蟲(chóng)害的健康甘蔗植株,統(tǒng)一砍除掉+6葉所對(duì)應(yīng)蔗莖節(jié)的上半部分,取下半部分進(jìn)行甘蔗品質(zhì)的測(cè)定[21]。每個(gè)品系每次隨機(jī)選取6株稱重后,送廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所進(jìn)行甘蔗品質(zhì)的測(cè)定。T2進(jìn)行3次甘蔗的單莖重調(diào)查和品質(zhì) 測(cè) 定(2018/11/19、2018/12/25、2019/01/26),T3、T2R1和T2R2進(jìn)行2次甘蔗的單莖重調(diào)查和品質(zhì)測(cè)定(2019/11/18、2019/12/11)。
使用Excel 2003軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的整理,運(yùn)用Spss 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和單因素方差分析。
從表1可以看出,轉(zhuǎn)SoSUT5基因甘蔗的出苗率、分蘗率和黑穗病發(fā)生率總體均值上與WT出現(xiàn)較大差異,但在T2和T3時(shí)趨勢(shì)相同。轉(zhuǎn)基因甘蔗出苗率均比非轉(zhuǎn)基因甘蔗低;分蘗率除L6比WT低之外,其余的三個(gè)轉(zhuǎn)基因甘蔗品系L1、L2和L3均比WT的高;轉(zhuǎn)基因甘蔗的黑穗病發(fā)生率明顯比非轉(zhuǎn)基因甘蔗高,特別是L6轉(zhuǎn)基因甘蔗品系,其黑穗病發(fā)生率是WT的2倍以上。各轉(zhuǎn)基因甘蔗品系,結(jié)果能得到重演。綜上可見(jiàn),甘蔗B8中轉(zhuǎn)進(jìn)SoSUT5基因?qū)Ω收岢雒缏省⒎痔Y率及黑穗病發(fā)病率等農(nóng)藝性狀影響非常大,不同轉(zhuǎn)基因甘蔗品系表現(xiàn)不同。
表1 轉(zhuǎn)基因甘蔗T2和T3代新植蔗出苗率、分蘗率及黑穗病發(fā)病情況
從表2中可以看出,與非轉(zhuǎn)基因甘蔗相比,4個(gè)轉(zhuǎn)基因品系甘蔗的莖徑在T2和T3時(shí)表現(xiàn)相同,總體均值明顯小于非轉(zhuǎn)基因甘蔗,差異顯著(P<0.05,下同),其中L6的莖徑與非轉(zhuǎn)基因甘蔗的差異最大,相差17.22%;而L1、L2和L3分別與WT相差12.91%、12.44%和13.88%。同樣,各轉(zhuǎn)基因甘蔗株系的莖徑小于非轉(zhuǎn)基因甘蔗,以L6的最小。轉(zhuǎn)基因甘蔗的株高均值稍低于非轉(zhuǎn)基因甘蔗,但差異并不顯著。轉(zhuǎn)基因甘蔗的單莖重比非轉(zhuǎn)基因甘蔗的低,其中L1、L2、L3和L6分別比WT小30.2%、30.1%、28.7%和29.4%。不同轉(zhuǎn)基因甘蔗品系和非轉(zhuǎn)基因甘蔗分別在T2、T3、T2R1和T2R2時(shí)的單莖重同樣表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因甘蔗小于非轉(zhuǎn)基因甘蔗??傮w上,轉(zhuǎn)基因甘蔗的有效莖數(shù)比非轉(zhuǎn)基因甘蔗有效莖數(shù)多,轉(zhuǎn)基因甘蔗品系L1、L2和L3的有效莖數(shù)分別比非轉(zhuǎn)基因甘蔗WT多34.2%、31.7%和26.2%,而L6與WT的差別不大,且T2和T3表現(xiàn)一致。綜上可見(jiàn),甘蔗品種B8中轉(zhuǎn)入SoSUT5基因后會(huì)使甘蔗的莖徑變小,單莖重降低,有效莖數(shù)大多增加,但對(duì)甘蔗的株高影響不明顯。
表2 轉(zhuǎn)基因甘蔗T2和T3代新植蔗成熟期的莖徑、株高、單莖重和有效莖數(shù)
甘蔗蔗汁糖分是蔗糖分最重要的決定性因素。由表3可知,總體上在成熟期時(shí)相同的轉(zhuǎn)基因甘蔗品系蔗汁糖分有所變化,各轉(zhuǎn)基因甘蔗品系的蔗汁糖分均低于非轉(zhuǎn)基因甘蔗。T2、T3、T2R1和T2R2各轉(zhuǎn)基因甘蔗品系的甘蔗蔗汁糖分總體均值上要比非轉(zhuǎn)基因甘蔗的低5%以上,其中以L1的最低。
表3 成熟期轉(zhuǎn)基因甘蔗的蔗汁蔗糖分
由表4可知,與甘蔗蔗汁蔗糖分類似,非轉(zhuǎn)基因甘蔗的蔗渣蔗糖分總體上要比各轉(zhuǎn)基因甘蔗品系高。不同轉(zhuǎn)基因甘蔗品系的蔗渣蔗糖分有所差別,但L3和L6的比L1和L2的高。
表4 成熟期轉(zhuǎn)基因甘蔗的蔗渣蔗糖分
由表5可知,成熟期甘蔗蔗糖分總體上表現(xiàn)為各轉(zhuǎn)基因甘蔗品系較非轉(zhuǎn)基因甘蔗低,但不同品系蔗糖分降低幅度有所差別。在T2時(shí),非轉(zhuǎn)基因甘蔗WT的甘蔗蔗糖分總體均值比轉(zhuǎn)基因甘蔗品系L1、L2、L3和L6分別高38.9%、40.0%、19.8%和13.7%;在T3時(shí),非轉(zhuǎn)基因甘蔗WT的甘蔗蔗糖分總體均值比轉(zhuǎn)基因甘蔗品系L1、L2、L3和L6分別高35.6%、51.0%、49.5%和43.4%;在T2代宿根蔗,非轉(zhuǎn)基因甘蔗WT的甘蔗蔗糖分總體均值比轉(zhuǎn)基因甘蔗品系L1、L2、L3和L6分別高18.8%、24.0%、14.5%和5.2%;在T2R2時(shí),非轉(zhuǎn)基因甘蔗WT的甘蔗蔗糖分總體均值比轉(zhuǎn)基因甘蔗品系L1、L2、L3和L6分別提高26.9%、27.3%、23.2%和16.0%。
表5 成熟期轉(zhuǎn)基因甘蔗的蔗糖分
從2年的研究數(shù)據(jù)結(jié)果表6來(lái)看,各轉(zhuǎn)基因甘蔗品系甘蔗的出汁率除L1在T2代第一季宿根蔗時(shí)低于WT外,其余轉(zhuǎn)基因甘蔗品系在不同年份和不同的月份時(shí)都比非轉(zhuǎn)基因甘蔗高,說(shuō)明甘蔗B8中轉(zhuǎn)入SoSUT5基因后甘蔗能增加新植蔗的甘蔗蔗汁含量,與不同轉(zhuǎn)基因品系降低蔗莖的蒲心程度表現(xiàn)一致。
表6 成熟期轉(zhuǎn)基因甘蔗的出汁率
蔗汁重力純度測(cè)定數(shù)據(jù)結(jié)果表7顯示,不同年份和不同月份下非轉(zhuǎn)基因甘蔗的蔗汁重力純度都比各轉(zhuǎn)基因甘蔗品系蔗汁重力純度高,其中與L1、L2相差較大,而與L3、L6相差較小。
表7 成熟期轉(zhuǎn)基因甘蔗的蔗汁重力純度
前人已經(jīng)從甘蔗中克隆獲得了SoSUT5基因,并證明了SoSUT5基因參與植物糖分的積累和代謝[10]。通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將SoSUT5基因轉(zhuǎn)入甘蔗中,獲得了SoSUT5基因陽(yáng)性甘蔗單株T0[19];隨后又對(duì)T1代轉(zhuǎn)SoSUT5基因甘蔗的部分農(nóng)藝性狀和相關(guān)生理生化特性進(jìn)行研究[20],發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)SoSUT5基因在T1代甘蔗中過(guò)表達(dá)時(shí)一定程度上促進(jìn)了甘蔗的生長(zhǎng),提高蔗莖的可溶性總糖含量。本研究在這些研究的基礎(chǔ)上分別觀察其T2、T3、T2R1和T2R2時(shí)甘蔗農(nóng)藝性狀、抗病性和品質(zhì)等各方面的綜合表現(xiàn)。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)甘蔗B8中轉(zhuǎn)入SoSUT5基因的后代性狀發(fā)生了一系列改變,各轉(zhuǎn)基因甘蔗的出苗率均低于非轉(zhuǎn)基因甘蔗,而分蘗率大多高于對(duì)照。出苗率對(duì)甘蔗收獲時(shí)的有效莖數(shù)影響很大,是甘蔗蔗莖產(chǎn)量形成的重要基礎(chǔ)。前人在對(duì)轉(zhuǎn)抗除草劑Bar基因甘蔗試驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),各轉(zhuǎn)基因甘蔗株系的出苗率均低于對(duì)照植株,部分轉(zhuǎn)基因甘蔗株系的分蘗率高于對(duì)照,認(rèn)為Bar基因的導(dǎo)入影響甘蔗的生長(zhǎng),主要表現(xiàn)在出苗率降低,對(duì)其他農(nóng)藝性狀影響較?。?2]。本研究所使用的轉(zhuǎn)基因甘蔗原始材料是通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將攜帶有選擇標(biāo)記基因Bar的pUBTC-SoSUT5表達(dá)載體整合到甘蔗B8中,很可能受甘蔗中導(dǎo)入Bar的影響。王繼華等認(rèn)為,在甘蔗中導(dǎo)入外源基因容易使甘蔗農(nóng)藝性狀發(fā)生改變,甚至?xí)共糠謨?yōu)良性狀喪失,影響甘蔗的產(chǎn)量。在本研究中,轉(zhuǎn)基因甘蔗的黑穗病發(fā)病率明顯比非轉(zhuǎn)基因甘蔗高,轉(zhuǎn)基因甘蔗抗病性減弱[22]。相關(guān)研究表明,植物與病原物互作的抗性反應(yīng)受自身的遺傳基礎(chǔ)決定[23],植物抗病與觸發(fā)特定信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路網(wǎng)相關(guān)[24]。在寄主受病原物感染時(shí),細(xì)胞表面分子把信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi),并觸發(fā)一系列生理生化反應(yīng),從而改變寄主體內(nèi)的代謝活動(dòng),提高對(duì)病原物的抵抗作用[25]。甘蔗遺傳背景的復(fù)雜性,其抗病性受多基因共同調(diào)控,防御機(jī)制和能力因不同甘蔗品種而異[26]。本研究中轉(zhuǎn)基因甘蔗抗病性減弱很可能是受到了基因遺傳基礎(chǔ)發(fā)生改變的影響所致。使用攜帶甘蔗黑穗病菌的蔗種進(jìn)行種植,在甘蔗生長(zhǎng)過(guò)程中如果主莖黑穗病發(fā)病較晚沒(méi)有長(zhǎng)出黑鞭或不發(fā)病,對(duì)莖粗的影響很?。?7]。本研究中甘蔗B8中轉(zhuǎn)入SoSUT5基因后莖徑也發(fā)生了變化,轉(zhuǎn)基因甘蔗的莖徑均小于對(duì)照,這與前人的研究結(jié)果類似[22]。
甘蔗的單莖重主要是由莖徑、株高和蔗汁含量決定的。在本研究中,轉(zhuǎn)基因甘蔗的單莖重都小于非轉(zhuǎn)基因甘蔗,而轉(zhuǎn)基因甘蔗的出汁率卻均比非轉(zhuǎn)基因甘蔗高??梢?jiàn),在株高相差不大的情況下轉(zhuǎn)基因甘蔗的單莖重小于非轉(zhuǎn)基因甘蔗,這主要受轉(zhuǎn)基因甘蔗的莖徑變小的影響。甘蔗單位面積內(nèi)的有效莖數(shù)往往取決于下種量、出苗率和分蘗率,與前期甘蔗的群體質(zhì)量有很大的關(guān)系[28]。甘蔗生長(zhǎng)前期的農(nóng)藝性狀質(zhì)量,會(huì)直接影響甘蔗的產(chǎn)量形成。在本研究中,轉(zhuǎn)基因甘蔗的出苗率較非轉(zhuǎn)基因低,但除L6外有效莖數(shù)與分蘗率都較非轉(zhuǎn)基因甘蔗高。
在本研究中,轉(zhuǎn)基因甘蔗T2、T3、T2R1和T2R2總體生長(zhǎng)狀況和甘蔗蔗糖分均顯著較非轉(zhuǎn)基因甘蔗表現(xiàn)差,推測(cè)SoSUT5基因可能對(duì)甘蔗的生長(zhǎng)和糖分積累起負(fù)調(diào)控作用,如果通過(guò)基因工程手段敲除該基因,有可能促進(jìn)甘蔗的生長(zhǎng)和糖分積累。
甘蔗品種B8導(dǎo)入SoSUT5基因后不同程度上抑制了甘蔗的生長(zhǎng)和糖分積累,降低甘蔗蔗糖分、蔗汁蔗糖分、蔗渣蔗糖分和蔗汁重力純度等,使甘蔗的品質(zhì)變劣,同時(shí)還使甘蔗莖徑變小,增加黑穗病發(fā)病率,反映其對(duì)甘蔗生長(zhǎng)和糖分積累可能起負(fù)調(diào)控作用。