唐 功，王柯然，朱 欣，朱晗燚

（阿壩師范學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院，四川 汶川 623002）

毛竹（學(xué)名：Phyllostachys heterocycla Mitford cv.Pubescens）是禾本科、剛竹屬單軸散生型常綠喬木狀竹類植物，其竹葉中黃酮含量高，具有清熱除煩、生津利尿等功效，又名竹葉抗氧化劑，是一種高效的生物抗氧化劑。毛竹葉屬于易取材的自然資源，價(jià)格低、資源豐富。因此，將其用作黃酮的提取原料具有很大的優(yōu)勢(shì)。

目前從竹葉中提取黃酮的方法查閱文獻(xiàn)有：直接提取法、熱回流法、堿溶液提取法[1-3]等。本實(shí)驗(yàn)主要以汶川縣水磨鎮(zhèn)產(chǎn)的毛竹葉為材料，采取乙醇熱回流提取法[4-5]，該提取法具有節(jié)省溶劑用量、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還輔助纖維素酶和果膠酶[6]，可提高提取率。運(yùn)用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)[7]測(cè)定其含量，此方法操作簡(jiǎn)單方便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為酶法輔助提取毛竹葉中黃酮的研究提供一定的理論參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 試劑與儀器

纖維素酶：50000U/g（成都市科龍化工有限公司）。

果膠酶：50000U/g（成都市科龍化工有限公司）UV-1800PC 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取工藝流程

毛竹葉50℃下烘干24h→粉碎→過(guò)40 目篩→纖維素酶、果膠酶預(yù)處理→75%乙醇加熱回流→抽濾得到濾液→蒸發(fā)濃縮。

1.2.2 操作步驟

稱取毛竹葉粉4g 于燒杯中，加40mL 蒸餾水，水浴加熱至50℃，加入試驗(yàn)用酶，酶解2.5h，升溫至85℃滅酶15min，加入75%乙醇加熱回流3h。抽濾，收集濾液，蒸發(fā)濃縮。

1.2.3 黃酮提取率的測(cè)定

加入75%乙醇溶解并轉(zhuǎn)移至50mL 的容量瓶中定容，充分搖勻備用[7]。分別從各組單因素試驗(yàn)得到的樣品溶液中移取1mL，加2mL 的10%硝酸鋁，再加75%乙醇定容至25mL，并以75%乙醇為參比液，于510nm 處測(cè)定吸光度[7]。

2 結(jié)果分析

2.1 酶種類對(duì)提取結(jié)果的影響

固定料液比1:25、酶解時(shí)間2.5h、酶解溫度50℃、回流時(shí)間3h 的條件下，考察毛竹葉中黃酮在纖維素酶、果膠酶、纖維素酶和果膠酶混合酶的不同條件下對(duì)提取率的影響，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 酶種類對(duì)黃酮吸光值的影響

由圖1 可知：使用果膠酶或者纖維素酶和果膠酶混合酶提取時(shí)，提取率不及使用纖維素酶的效果好，因?yàn)槔w維素酶可改善植物細(xì)胞壁的通透性，使得細(xì)胞壁內(nèi)的活性成分大量涌出[8]。因此在使用有機(jī)溶劑回流提取的前提下，使用纖維素酶輔助提取率更高。

2.2 料液比對(duì)提取結(jié)果的影響

固定纖維素酶0.08g、酶解時(shí)間2.5h、酶解溫度50℃、回流時(shí)間3h 的條件下，考察在料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 的不同條件下對(duì)竹葉中黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 料液比對(duì)黃酮吸光值的影響

由圖2 可知：料液比的值越大，其提取率越高，說(shuō)明料液比對(duì)毛竹葉中黃酮的提取率影響明顯。在料液比為1∶25（g/mL）時(shí)提取率達(dá)到了峰值，1∶25 后提取率又開(kāi)始降低。因此，最佳料液比為1∶25。

2.3 酶解時(shí)間對(duì)提取結(jié)果的影響

固定纖維素酶0.08g、料液比1∶25、酶解溫度50℃、回流時(shí)間3h 的條件下，考察在酶解時(shí)間為1h、1.5h、2h、2.5h、3h 的不同條件下對(duì)毛竹葉中黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)黃酮吸光值的影響

由圖3 可知：毛竹葉中黃酮提取率在隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，說(shuō)明酶解時(shí)間對(duì)其提取率的影響比較明顯。在酶解時(shí)間為2.5h 時(shí)提取率達(dá)到了峰值，之后提取率開(kāi)始降低。隨著酶解預(yù)處理時(shí)間的增加，溶劑與底物之間接觸時(shí)間更長(zhǎng)，纖維素酶可以使毛竹葉細(xì)胞壁纖維被降解，從而使毛竹葉中黃酮更多的釋放出來(lái)[9-11]，但達(dá)到峰值后，接觸面積不再增大。因此，最佳酶解時(shí)間為2.5h。

2.4 酶解溫度對(duì)提取結(jié)果的影響

固定纖維素酶0.08g、料液比1∶25、酶解時(shí)間2.5h、回流時(shí)間3h 的條件下，考察在酶解溫度為40℃、45℃、50℃、55℃、60℃的不同條件下對(duì)毛竹葉中黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 酶解溫度對(duì)黃酮吸光值的影響

由圖4 可知：酶解溫度越高，一定范圍內(nèi)其提取率升高。在酶解溫度為50℃時(shí)提取率最大，之后提取率開(kāi)始降低。隨著酶解溫度的升高，纖維素酶的酶活性開(kāi)始降低，甚至失活[8]。因此，最佳酶解溫度為50℃。

2.5 回流時(shí)間對(duì)提取結(jié)果的影響

固定纖維素酶0.08g、料液比1∶25、酶解時(shí)間2.5h、酶解溫度50℃的條件下，考察在回流時(shí)間為1h、2h、3h、4h、5h 的不同條件時(shí)對(duì)毛竹葉中黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 回流時(shí)間對(duì)黃酮吸光值的影響

由圖5 可知：回流時(shí)間越長(zhǎng)，其提取率越高，回流時(shí)間對(duì)毛竹葉中黃酮的提取影響較明顯。在回流時(shí)間為3h 時(shí)提取率最大，之后提取率不但沒(méi)有升高反而略有下降。因此，最佳回流時(shí)間為3h。

3 討論

分析纖維素酶法輔助提取毛竹葉中黃酮的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得：不同的提取條件對(duì)提取率的影響較為明顯。為保證提取結(jié)果最佳，提取條件可設(shè)置為：纖維素酶0.2%、料液比1∶25、酶解時(shí)間2.5h、酶解溫度50℃、回流時(shí)間3h。

通過(guò)文獻(xiàn)可知，研究人員大多單方面選擇有機(jī)溶劑熱回流法，或者纖維素酶法進(jìn)行提取，將二者合理結(jié)合實(shí)驗(yàn)后可知，采用了纖維素酶預(yù)處理的實(shí)驗(yàn)組，其提取率明顯高于其中任一組。因此采用纖維素酶輔助熱回流法對(duì)毛竹葉中黃酮的提取進(jìn)行了研究，可為后續(xù)采用純酶提取毛竹葉中黃酮的研究提供一定的理論依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要注意的是，加入酶時(shí)要保證竹葉粉和蒸餾水混合物的溫度應(yīng)達(dá)到最適合的酶解溫度50℃，避免溫度對(duì)酶活性產(chǎn)生影響從而降低黃酮的提取率。