程穎穎，於子翔，徐露佳，高夢葉，劉勝兵

(嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 嘉興 314000)

0 引言

作為婦科惡性腫瘤，卵巢癌嚴(yán)重危害女性生命健康。化療是目前卵巢癌治療的重要手段，雖然化療可以提高卵巢癌患者生存率，但隨著用藥時間的延長，化療抗性難以避免[1]，降低化療抗性，則可以提高臨床療效。Hippo信號通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡，以及對干細(xì)胞調(diào)控中都有重要作用，Hippo信號通路與癌癥發(fā)生發(fā)展有緊密聯(lián)系。Hippo信號通路中，Mst1/2激酶與SAV1形成復(fù)合物，繼而磷酸化LATS1/2，隨后磷酸化的LATS1/2激酶可以磷酸化Hippo信號通路下游關(guān)鍵效應(yīng)分YAP/TAZ，抑制YAP/TAZ轉(zhuǎn)錄活性。研究發(fā)現(xiàn)，LATS1/2基因敲除可抑制卵巢癌細(xì)胞ES-2的增殖，克隆形成和遷移，人卵巢癌細(xì)胞ES-2中敲除LATS1/2可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，影響細(xì)胞周期。關(guān)于ES-2中敲除LATS1/2后，對卵巢癌細(xì)胞的化療效果和耐藥性的影響，未做進(jìn)一步研究。本研究以LATS1/2敲除的卵巢癌細(xì)胞ES-2為研究對象，以順鉑處理卵巢癌細(xì)胞，通過檢測化療藥物處理后的卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力、化療抗性檢測以及通路中的YAP蛋白的表達(dá)情況，初步闡明LATS1/2在卵巢癌細(xì)胞化療中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青鏈霉素購自Hyclone公司；胎牛血清購于Gibco公司；β-actin、LATS1、LATS2、p-YAP抗體購自Cellsignaling公司；YAP、p-Taz和Taz抗體購自SantaCruze。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

卵巢癌ES-2細(xì)胞和LATS1/2敲除的ES-2細(xì)胞由本實驗室保存于-80℃冰箱，取ES-2細(xì)胞復(fù)蘇至，用加1%青鏈霉素的含10%胎牛血清的DMEM，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)環(huán)境培養(yǎng)。隔天換液至細(xì)胞密度到90%后，分盤接種到10cm培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 CCK8檢測細(xì)胞增殖

將對數(shù)生長期ES-2細(xì)胞懸液和LATS1/2敲除的ES-2細(xì)胞懸液分別以每孔100μL接種于 96 孔板，實驗組分別加入DDP 5、20和100μg/mL。各組細(xì)胞設(shè) 3 個復(fù)孔，細(xì)胞密度為10000個/孔，96 孔板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后每孔加入20μL CCK-8 溶液和80μL培養(yǎng)基后避光置于培養(yǎng)箱中，2h 取材96孔板，酶標(biāo)儀檢測 450nm 處的吸光度(OD)值。

1.4 細(xì)胞遷移實驗

培養(yǎng)到對數(shù)生殖期的將WT組與LATS1/2 KO的ES-2細(xì)胞各分為對照組和實驗組，實驗組加DDP 0.5μg/mL 24小時，各組細(xì)胞計數(shù)，取細(xì)胞懸液(3×103)100μL加置培養(yǎng)板，并加入無血清培養(yǎng)基200μL。培養(yǎng)板下室加入500μL無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)12h后用預(yù)冷后的甲醇固定細(xì)胞30min后進(jìn)行蘇木精染色，染色時間30s，顯微鏡下取10個視野計數(shù)。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測

將WT與LATS1/2 KO的ES-2細(xì)胞各分為對照組和實驗組，實驗組加DDP 0.5μg/mL，24小時，計數(shù)取1×106個細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌3次后重懸細(xì)胞，取100μL置于1.5mL離心管(細(xì)胞濃度1×105)，室溫下避光15min后流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 western blotting 檢測

將WT與LATS1/2 KO的ES-2細(xì)胞各分為對照組和實驗組，實驗組加DDP 0.5μg/mL，24小時后收各組細(xì)胞后加入適量RIPA蛋白質(zhì)裂解液冰上消化30min，后高速離心機(jī)4℃下10000rpm15min，取上清，BCA試劑盒檢測蛋白濃度后，調(diào)整各組蛋白濃度加5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液，充分混合后95℃水浴加熱5min，水浴后置于冰上冷卻。各組樣品10μL加至濃縮膠上樣孔中，100min后結(jié)束電泳，濕轉(zhuǎn)90min后取膜，室溫下用5%脫脂奶粉封閉1h，PBST洗3次/5min。4℃一抗孵育過夜后用PBST洗膜，3次/5min。室溫二抗處理1h后PBST洗膜3次/10min，ECL發(fā)光試劑盒顯影。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的統(tǒng)計學(xué)方法處理數(shù)據(jù)，組別之間通過t檢驗分析和One-wayANOVA檢驗分析。當(dāng)P＜0.05時表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Lats1/2 KO的ES-2細(xì)胞鑒定

本實驗室之前通過慢病毒載體構(gòu)建Lats1/2KO的卵巢癌ES-2細(xì)胞，通過western檢測Lats1/2 KO的ES-2細(xì)胞，結(jié)果顯示，Lats1/2 KO的ES-2細(xì)胞中Lats1/2表達(dá)明顯減少(圖1A)。

2.2 DDP對Lats1/2 KO的ES-2細(xì)胞增殖的影響

CCK8實驗結(jié)果顯示，DDP處理后的LATS1/2敲除細(xì)胞增能力降低(圖1B)。

圖1 A western檢測LAST1/2 敲除效果圖1B CCK8檢測LAST1/2敲除后對DDP作用的影響

2.3 DDP對Lats1/2 KO的ES-2細(xì)胞遷移的影響

Transwell小室實驗檢測LATS1/2 KO后的ES-2細(xì)胞遷移，DDP處理前后，野生型ES-2細(xì)胞遷移效率明顯高于LATS1/2 KO組和兩組DDP加藥組(P＜0.05)，LATS1/2 KO 細(xì)胞在加藥前后遷移沒有明顯變化(圖2)。

圖2 Transwell實驗檢測DDP對ES-2細(xì)胞LATS1/2 敲除后的遷移的影響(＊P＜0.05)

2.4 DDP對Lats1/2 KO的ES-2細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測DDP對Lats1/2 KO的ES-2細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，Lats1/2 KO后對細(xì)胞凋亡無明顯影響(圖3)。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測DDP對ES-2細(xì)胞LATS1/2敲除后的凋亡的影響

2.5 DDP對Lats1/2 KO的ES-2細(xì)胞中YAP和p-YAP的表達(dá)影響

western blotting檢測Lats1/2 KO的ES-2細(xì)胞中YAP和p-YAP在DDP處理前后的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DDP處理Lats1/2 KO的ES-2細(xì)胞中，YAP和p-YAP的表達(dá)無明顯變化(圖4)。

圖4 western檢測DDP對LATS1/2敲除后的ES-2細(xì)胞中YAP和PYAP表達(dá)的影響

3 討論

Hippo通路最初是在黑腹果蠅中發(fā)現(xiàn)的，Hippo通路在組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮核心作用。Hippo通路調(diào)節(jié)許多生物過程，包括細(xì)胞生長和命運(yùn)決定，器官大小控制和再生。哺乳動物Hippo通路的核心包括激酶級聯(lián)，MST1/2和LATS1/2，以及下游效應(yīng)物，轉(zhuǎn)錄共激活物YAP和TAZ[2]。Hippo通路其失調(diào)可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，其核心成分(MST1/2、LATS1/2、YAP和TAZ)的突變和表達(dá)改變促進(jìn)了癌細(xì)胞的遷移、侵襲和惡性[3]。LATS1/2是一種腫瘤抑制因子，在包括白血病、肺癌、前列腺癌和乳腺癌在內(nèi)的幾種人類癌癥中已顯示出突變或下調(diào)，LATS1/2可以作為腫瘤抑制基因發(fā)揮作用，LATS1/2被敲除后可導(dǎo)致細(xì)胞增殖增強(qiáng)，對藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的抗性，以及細(xì)胞遷移的增加，LATS1/2通過多種機(jī)制和多種信號通路發(fā)揮作用，包括Hippo信號通路，以及p53、Ras-ERK或WNT網(wǎng)絡(luò)，以抑制腫瘤進(jìn)展[4]。LATS1/2磷酸化并抑制Hippo途徑的主要效應(yīng)因子YAP/TAZ，近來也有研究發(fā)現(xiàn)MST1/2不是調(diào)節(jié)YAP/TAZ所必需的[5]。胃癌中LATS1/2、CD8和FOXP3聯(lián)合分析比單獨(dú)使用單項指標(biāo)有更好的預(yù)后準(zhǔn)確性，LATS1/2作為Hippo通路的核心激酶，與CD8和FOXP3密切相關(guān)[6]。LATS1/2缺失可增強(qiáng)了腫瘤疫苗的有效性。在腫瘤中缺失LATS1/2可提高腫瘤的免疫原性，通過增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答而破壞腫瘤，靶向LATS1/2在癌癥免疫治療有一定的意義[7]。LATS1/2通過調(diào)控Hippo通路、EMT和細(xì)胞分裂來觸發(fā)腫瘤干細(xì)胞的自我更新[8]。YAP和下游TEAD家族是維持可能參與卵巢癌干細(xì)胞干性和化療耐藥的特定基因表達(dá)所必需的，YAP/TEAD共激活劑調(diào)節(jié)卵巢癌起始細(xì)胞多能性和化療耐藥[9]。YAP/TAZ與TEAD家族共激活因子結(jié)合，促進(jìn)癌細(xì)胞存活、增殖、侵襲性遷移和轉(zhuǎn)移。YAP/TAZ激活也可能導(dǎo)致對化療、放療或免疫治療的耐藥性[10]。

甲氨蝶呤和阿霉素提高了哺乳動物MST1的降解，降低了LATS1/2的總蛋白水平，增加了YAP的激活和核轉(zhuǎn)位。YAP能增強(qiáng)MG63細(xì)胞的增殖能力和耐藥能力[11]。研究發(fā)現(xiàn)絲氨酸/蘇氨酸激酶MK5是YAP的正調(diào)節(jié)因子。MK5與YAP發(fā)生物理作用，不依賴于LATS1/2抑制CK1δ/ε介導(dǎo)的YAP泛素化和降解。MK5可作為新的調(diào)控YAP穩(wěn)定性的因子，獨(dú)立于LATS1/2調(diào)控YAP，可作為癌癥治療的靶點(diǎn)[12]。關(guān)于LATS1/2在卵巢癌化療中的作用，本實驗通過DDP處理LATS1/2 KO的卵巢癌ES-2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)LATS1/2 KO后對細(xì)胞的遷移有一定的影響，這與前期的實驗結(jié)果一致[13]。而DDP對LATS1/2 KO前后的增殖、遷移和凋亡并未有影響，通過western blotting實驗，對DDP作用于野生型卵巢癌ES-2細(xì)胞后，YAP和p-YAP表達(dá)明顯下降，LATS1/2 KO后，DDP處理前后，YAP表達(dá)變化不明顯，初步說明在卵巢癌化療抵抗中LATS1/2的作用不明顯，YAP在DDP處理后的表達(dá)變化或許有其它的機(jī)制作用。