冉春龍 ， 趙欣杰，李文輝，白 琛， 李夢(mèng)君，劉向哲

(1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046；2.河南省科學(xué)院生物研究所，河南 鄭州 450008； 3.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病一區(qū)，河南 鄭州 450000)

緊張型頭痛 (tension-type headache，TTH) 是1988年國(guó)際頭痛協(xié)會(huì)制定的診斷名稱,TTH以往稱緊張性頭痛或肌收縮性頭痛，臨床也稱為神經(jīng)性頭痛,指雙側(cè)枕部或全頭部的緊縮性或壓迫性頭痛,多數(shù)為發(fā)作性，也可表現(xiàn)為持續(xù)性鈍疼, 一般可伴有頭昏、失眠、焦慮或(和)抑郁等癥狀，也可出現(xiàn)懼光怕聲、惡心嘔吐等植物神經(jīng)癥狀。本病約占頭痛患者的40%[1]，是臨床常見的原發(fā)性頭痛。近年來(lái)其患病率有明顯上升的趨勢(shì)，且應(yīng)激、緊張、抑郁等情緒波動(dòng)也可加重其癥狀。目前應(yīng)用的治療藥物雖然有效但有較大的依賴性，甚者還可能造成抑郁障礙、嗜睡等副作用[2]。中醫(yī)藥對(duì)于頭痛有著完整的理論體系及豐富的治療經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)出川芎茶調(diào)散、芎芷石膏湯等諸多經(jīng)典方劑，并在臨床上被廣泛應(yīng)用且療效顯著[3-5]。川芎在其中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

川芎(LigusticumchuanxiongHort)，別名芎藭、生川軍、香果，為傘形科，阿米芹族，藁本屬[6]，性味辛溫，有“血中之氣藥”之稱，因其善于活血祛風(fēng)而止頭痛，亦稱之為“諸經(jīng)頭痛要藥”。臨床上更有“頭痛不離川芎”一說(shuō)，目前已發(fā)現(xiàn)川芎具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、 抗凝血、抗抑郁、抗衰老、抗動(dòng)脈粥樣硬化、細(xì)胞保護(hù)、改善心功能等作用[7]。然而，雖然川芎作為經(jīng)驗(yàn)用藥在臨床上被廣泛應(yīng)用于治療頭痛，且效果明顯，但大多數(shù)研究只停留在臨床或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等宏觀效果,而對(duì)于其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及分子水平作用機(jī)制等方面尚不明確。本文欲通過(guò)中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接，對(duì)川芎治療TTH可能的靶點(diǎn)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，解析其對(duì)TTH具體的分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)中草藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)(TCMSP)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)；疾病數(shù)據(jù)庫(kù)Genecard(https://www.genecards.org/)；Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org)；反向藥效團(tuán)匹配數(shù)據(jù)庫(kù)PharmMapper (http://59.78.98. 102 /pharmmapper/submit_file.php )；蛋白互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù) String (https://string-db. org/cgi/network.pl)；Cytoscape軟件 3.8.0(https://cytoscape.org/)；GO、KEGG 富集分析數(shù)據(jù)庫(kù)(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)；Venny2.1；Rx64 3.6.0；ChemBio3D Ultra 17.0；RCSB Protein Data Bank (www.rcsb.org)；AutodockTools 1.5.6；Free Maestro 11.9。

1.2 篩選川芎的有效活性成分及靶點(diǎn)在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中以“川芎”為關(guān)鍵詞，挖掘出與川芎有關(guān)的所有活性成分，根據(jù)藥物代謝動(dòng)力學(xué)(ADME-吸收、分布、代謝、排泄)原理，規(guī)定藥物口服生物利用度≥30%，類藥性≥0.18的化合物為川芎的有效活性成分，再通過(guò)PharmMapper平臺(tái)，檢索出每個(gè)活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)，然后使用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)中記錄的Human的相關(guān)基因，將篩選出的川芎活性成分靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的Gene symbol,為接下來(lái)構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)做準(zhǔn)備。

1.3 獲取TTH相關(guān)基因，并與川芎活性成分的靶基因做交集處理，構(gòu)建Venn圖以“Tension type headache”為關(guān)鍵詞，檢索Genecard 疾病數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取相關(guān)疾病基因。將得到的疾病基因與活性成分的靶基因錄入，利用Venny2.1軟件，取兩者交集基因，得到川芎-TTH靶點(diǎn)，并繪制Venn圖。

1.4 構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)將1.2獲得的川芎靶點(diǎn)和1.3獲得的川芎-TTH靶點(diǎn)運(yùn)用 Cytoscape 軟件進(jìn)行拓?fù)溆?jì)算，得到“藥物-活性成分-靶點(diǎn)基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)，不同的節(jié)點(diǎn)分別代表“藥物、活性成分、靶點(diǎn)基因、疾病”，并描述各節(jié)點(diǎn)之間的聯(lián)系。

1.5 構(gòu)建中藥-疾病靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)利用STRING在線軟件將中藥-疾病靶點(diǎn)輸入軟件，以種屬選擇homo sapiens為篩選條件，構(gòu)建川芎-TTH的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，又稱PPI網(wǎng)絡(luò)。最低互動(dòng)評(píng)分設(shè)定為0.4。網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)度值代表該蛋白在相互作用中的地位，并用柱狀圖直觀表示前25名蛋白及節(jié)點(diǎn)連接數(shù)量，各個(gè)節(jié)點(diǎn)互相連接數(shù)量的大小可直接代表其在PPI網(wǎng)絡(luò)中的重要程度。

1.6 關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO功能和KEGG通路富集分析GO功能富集分析是為了進(jìn)一步分析中藥化合物的靶點(diǎn)蛋白在基因功能中的作用，并對(duì)其差異基因富集在哪些生物學(xué)功能、途徑或者細(xì)胞定位上有一個(gè)粗略了解。KEGG通路富集分析是對(duì)基因進(jìn)行pathway分析，可以了解實(shí)驗(yàn)條件下顯著改變的代謝通路。將“藥物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)中的蛋白利用metascape數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析。以P<0.01為標(biāo)準(zhǔn)，并繪制氣泡圖。

1.7 分子對(duì)接采用ChemBioDraw Ultra 17.0畫出化合物的結(jié)構(gòu)，然后用ChemBio3D Ultra 17.0轉(zhuǎn)化為三維結(jié)構(gòu)，并使用MMFF94力場(chǎng)進(jìn)行優(yōu)化。靶點(diǎn)蛋白的三維結(jié)構(gòu)從RCSB Protein Data Bank 下載得到，選取各個(gè)蛋白三維結(jié)構(gòu)的PDB ID。本研究采用Autodock vina 1.1.2進(jìn)行分子對(duì)接研究。為了增加計(jì)算的準(zhǔn)確度，將參數(shù)exhaustiveness設(shè)置為20。除了特別說(shuō)明，其他參數(shù)均采用原始默認(rèn)數(shù)值。最后，選取打分值最高的構(gòu)象用Free Maestro 11.9進(jìn)行結(jié)果分析。

2 結(jié)果

2.1 川芎中有效活性成分篩選通過(guò)對(duì)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中川芎所有有效活性成分及其相關(guān)靶點(diǎn)篩選，共搜索到有效成分 189個(gè)。以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，共獲得有效成分7個(gè)。詳見Tab 1。

Tab 1 Effective active ingredients of Ligusticum Chuanxiong

2.2 獲取有效成分靶點(diǎn)及轉(zhuǎn)換Gene symbol使用PharmMapper平臺(tái)，以川芎有效成分的MOLID為關(guān)鍵詞，逐一挖掘有效活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)，排除沒有相對(duì)應(yīng)基因和重復(fù)存在的靶點(diǎn)，以擬合標(biāo)準(zhǔn)≥0.8為要求，最終獲取川芎有效活性成分作用靶點(diǎn)105個(gè)。然后將篩選出來(lái)的靶點(diǎn)基因名利用Uniport數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)換成Gene symbol。

2.3 繪制Venn圖利用 GeneCard 疾病數(shù)據(jù)庫(kù),篩選出TTH相關(guān)的疾病靶點(diǎn)信息，共獲取靶點(diǎn)2 139個(gè)，與川芎最終獲得的105個(gè)有效活性成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因作取交集處理，獲得57個(gè)共同基因靶點(diǎn)，為川芎治療TTH的關(guān)鍵靶點(diǎn)。利用Venny2.1軟件繪制Veen圖，如Fig 1。

Fig 1 Veen diagram of key target points

2.4 構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)使用Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建川芎治療TTH的“藥物-活性成分-靶點(diǎn)基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，節(jié)點(diǎn)之間連線表明成分-靶點(diǎn)-通路之間的靶向關(guān)系，連線兩端分別代表著藥物的活性成分和疾病靶點(diǎn)，線條的數(shù)量代表著對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)數(shù)量，連線越多越密集，節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越占據(jù)核心地位。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)圖可知，谷甾醇與疾病靶點(diǎn)之間有1條連線，楊梅酮、洋川芎醌、川芎哚均有5條連線，川芎萘呋內(nèi)酯有12條連線，F(xiàn)A有13條連線，而扁桃醇有16條連線。這表明川芎的7個(gè)有效成分均能對(duì)疾病靶點(diǎn)產(chǎn)生作用，其中以扁桃醇和川芎萘呋內(nèi)酯與疾病關(guān)系最為密切，在網(wǎng)絡(luò)圖中居于核心位置。

2.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)在String 數(shù)據(jù)庫(kù)中以combined_score(關(guān)聯(lián)評(píng)分)設(shè)定為0.4為標(biāo)準(zhǔn)，得到靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(Fig 2)，其中“邊”代表作用靶點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)，節(jié)點(diǎn)代表作用靶點(diǎn)。由圖可知，共有54個(gè)互相關(guān)聯(lián)的節(jié)點(diǎn)、235條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為8.25，平均局部聚類系數(shù)為0.688。在網(wǎng)絡(luò)中，鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)目越多，成為核心基因的概率越大。根據(jù)degree大于中位數(shù)值6，制作前25名的柱狀圖(Fig 3)。對(duì) PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，以BC大于中位數(shù)0.001 666 625，CC大于中位數(shù)0.516 129 032，degree大于2倍中位數(shù)值12，篩選得到ALB、MAPK1、SRC、EGFR、CASP3、MAPK14、MAPK8、ESR1、PGR、AR、IGF1R、ANXA5、PLG、MMP3、BMP2等15個(gè)核心靶點(diǎn)(Tab 2)。其中ALB度值最高，處在核心地位。這些靶點(diǎn)可能在川芎治療TTH中發(fā)揮重要作用。

Tab 2 Topological properties of 15 core targets

Fig 2 Interaction network of key target proteins

Fig 3 Bar chart of node degree value

2.6 GO富集分析基因組中的所有基因都被用作富集背景。收集P<0.01、最小計(jì)數(shù)為3、富集系數(shù)為1.5%。GO富集分析得到相關(guān)條目共215條，其中生物學(xué)過(guò)程(biological process,BP)143條，主要表現(xiàn)在蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調(diào)節(jié)、生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育、肽基絲氨酸磷酸化、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織、蛋白質(zhì)定位建立的積極調(diào)控、氮化合物的細(xì)胞反應(yīng)等方面；細(xì)胞定位(cellular compon,CC) 23條，主要表現(xiàn)在血液微粒、谷氨酸能突觸、薄膜筏、質(zhì)膜蛋白復(fù)合物、軸突等方面；分子功能(molecular function,MF) 49條，主要表現(xiàn)在蛋白激酶活性、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、磷酸腺苷激酶活性、α-淀粉酶活性、激活素結(jié)合、胰島素受體結(jié)合等方面。根據(jù)P<0.01，取3個(gè)分支各自數(shù)量排名前20位相關(guān)條目信息制作氣泡圖，見Fig 4。

2.7 KEGG通路富集分析KEGG通路富集分析，根據(jù)P<0.01，共獲得68條通路，結(jié)果中主要涉及松弛素信號(hào)通路、前列腺癌、粘附結(jié)、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、病毒致癌作用、淀粉和蔗糖代謝、foxo信號(hào)通路、白介素-17信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化等。取前20位信號(hào)通路制作氣泡圖，見Fig 4。

2.8 分子對(duì)接驗(yàn)證對(duì)篩選得到的7個(gè)有效成分和15個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，配體及蛋白基本信息見Tab 3。為了從分子水平闡明蛋白和化合物的作用模式，將化合物對(duì)接至蛋白的活性口袋，其親和力見熱圖(Fig 5)，并取打分較高的結(jié)合較好的蛋白和小分子作圖分析，CASP3-MOL000433、CASP3-MOL002151、MAPK1-MOL000359、MAPK14-MOL002 140,見Fig 6。

MOL000433結(jié)合到CASP3蛋白活性位點(diǎn)，并且和LYS 155、ASN 73、SER 85 3個(gè)氨基酸形成氫鍵相互作用，此外與LYS形成一個(gè)PI-cation相互作用。MOL002151結(jié)合到CASP3蛋白活性位點(diǎn)，并且和LYS 174和TYR 239兩個(gè)氨基酸形成氫鍵相互作用。MOL000359結(jié)合到MAPK1蛋白活性位點(diǎn)，并和MET 108形成氫鍵相互作用。MOL002140結(jié)合到MAPK14蛋白活性位點(diǎn)，并和MET 108形成氫鍵相互作用，此外與TRP 197形成多個(gè)PI-PI相互作用和PI-cation相互作用。這些氫鍵相互作用是蛋白和化合物之間最主要的作用力。所有的這些相互作用使得蛋白3CL pro和化合物形成穩(wěn)定的復(fù)合物。

總之，分子對(duì)接研究表明MOL000433(FA)、MOL002151(洋川芎醌)、MOL000359(谷甾醇)、MOL002140(川芎哚)與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合較好，可能是川芎治療TTH過(guò)程中發(fā)揮療效的關(guān)鍵成分。

Tab 3 Molecular docking protein information table

3 討論

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)初步探討了川芎治療TTH的作用機(jī)制，通過(guò)活性成分篩選及PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龅贸鱿嚓P(guān)的7個(gè)有效成分與15

Fig 5 Molecular docking thermogram

個(gè)核心靶點(diǎn)。其中主要活性成分有川芎萘呋內(nèi)酯、楊梅酮、扁桃醇、川芎哚、洋川芎醌、谷甾醇、FA等，涉及 ALB、MAPK1、SRC、EGFR、CASP3、MAPK14、MAPK8、ESR1、PGR、AR、IGF1R、ANXA5、PLG、MMP3、BMP2等15主要靶點(diǎn)。

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為緊張型頭痛的發(fā)病與心理壓力、焦慮或(和)抑郁等精神因素、血管痙攣、肌肉緊張等有關(guān)。相關(guān)研究指出,焦慮及抑郁是TTH的常見心理因素,氧化應(yīng)激與抑郁及(或)焦慮的關(guān)系匪淺,而谷甾醇具有抗氧化作用[8]，可通過(guò)氧化應(yīng)激對(duì)抑郁及(或)焦慮的緩解從而達(dá)到減輕TTH疼痛的作用。另有實(shí)驗(yàn)證明[9]，川芎在抗抑郁方面有顯著效果。改善腦部循環(huán)，解除血管痙攣同樣可以有效地緩解TTH[10]，而洋川芎醌具有顯著的擴(kuò)張血管作用[11]，可通過(guò)改善腦部灌注, 糾正腦血管痙攣，從而達(dá)到治療TTH的作用。川芎哚除了具有通過(guò)增加血小板內(nèi)cAMP和cGMP含量、解除血小板聚集等環(huán)節(jié)發(fā)揮抗凝作用，從而達(dá)到疏通血管的作用。馬寧寧等[12]實(shí)驗(yàn)研究確定了川芎發(fā)揮抗炎功效的有效成分為其所含有的洋川芎內(nèi)酯，可有效抑制炎性信號(hào)的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而干預(yù)其下游因子的表達(dá)，并有效發(fā)揮抗炎的作用。孫存霞等[13]亦指出川芎中所含有的洋川芎內(nèi)酯A和洋川芎內(nèi)酯C具有較好的抗炎功效，可用于減輕各種疾病中的炎癥反應(yīng)，故推測(cè)通過(guò)減少炎癥因子異常分泌可起到治療TTH的療效。

Fig 6 Molecular docking diagram

PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，15個(gè)核心靶點(diǎn)中以CASP3、MAPK1、MAPK14與川芎有效成分結(jié)合活性最強(qiáng)烈。CASP3是細(xì)胞凋亡中關(guān)鍵的蛋白酶，在細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)中處于核心地位。MAPK1是MAPK信號(hào)通路中的關(guān)鍵激酶。MAPK1在突觸可塑性、神經(jīng)活動(dòng)和連接中起著關(guān)鍵作用。此外, MAPK1能通過(guò)激活MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)在缺血神經(jīng)元和完整腦細(xì)胞的凋亡中發(fā)揮重要作用[14]。MAPK14表達(dá)異常與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，當(dāng)機(jī)體受到刺激后，可通過(guò)活化MAPK14蛋白來(lái)啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[15]。MAPK信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)信息傳遞的主要信號(hào)通路之一，可調(diào)節(jié)細(xì)胞多種病理生理過(guò)程，其過(guò)度激活或表達(dá)減少會(huì)導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生發(fā)展[16]。松弛素可通過(guò)其相應(yīng)的受體-G蛋白偶聯(lián)受體7和8發(fā)揮舒血管效應(yīng)[17]，還可通過(guò)抑制前纖維化因子, 刺激金屬蛋白酶誘導(dǎo)基質(zhì)降解, 起到抗纖維化作用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)血管的保護(hù)，保證腦部循環(huán)的充盈，以緩解TTH的發(fā)作。白介素-17是一種致炎細(xì)胞因子，可通過(guò)活化的T細(xì)胞產(chǎn)生，并可促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的釋放來(lái)放大炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本研究以臨床常用藥物-川芎為探討對(duì)象，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接分析，初步論證了川芎主要通過(guò)谷甾醇以抗氧化；川芎哚及洋川芎醌以疏通血管；抑制CASP3以實(shí)驗(yàn)細(xì)胞保護(hù)；調(diào)節(jié)松弛素信號(hào)通路以抗纖維化；調(diào)控白介素-17信號(hào)通路及MAPK信號(hào)通路，作用于MAPK1和MAPK14等靶點(diǎn)以抗炎等可能。提示川芎可能通過(guò)抗炎、抗氧化及細(xì)胞保護(hù)作用對(duì)緊張型頭痛發(fā)揮治療作用，為進(jìn)一步的研究奠定了基礎(chǔ)。但該研究沒有具體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，有效成分的責(zé)任靶點(diǎn)及關(guān)鍵療效通路尚不明確，且臨床中川芎多配伍其他藥物使用，其他藥物的作用及相互之間的協(xié)同作用亦需要進(jìn)一步分析，這也是作者及其團(tuán)隊(duì)接下來(lái)研究的一個(gè)出發(fā)點(diǎn)。