肖振平，龍 慧,2，鄒 聰，蔣李平，何云武

(南華大學1. 附屬第二醫(yī)院疼痛康復科，湖南 衡陽 421003；2. 基礎醫(yī)學院，湖南 衡陽 421001)

骨質疏松(osteoporosis，OP)是脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)后的一種常見性繼發(fā)性并發(fā)癥。研究表明OP的臨床表現(xiàn)主要為骨量減少、骨微結構性退化并最終誘發(fā)骨脆性增加、骨折，甚至導致患者死亡，嚴重的危害患者的生命健康[1]。因此，積極探尋有效藥物治療對于改善OP尤為關鍵。

甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)是由甲狀旁腺分泌的一種多肽鏈激素分子，其能夠通過靶向骨骼肌、小腸以及腎臟等器官從而調節(jié)機體鈣、磷代謝平衡。以往文獻表明，PTH能夠增強破骨細胞活性、促進骨吸收、升高血鈣等[2]。另外，PTH也能夠通過促進骨髓間充質干細胞向骨細胞分化、增加機體骨形成，改善骨密度，從而改善骨骼肌功能[3]。但是目前有關PTH對OP的作用機制尚不完全清楚。以往研究顯示磷酸肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K)/蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶(protein kinase B，AKT)信號與SCI密切相關。與sham組大鼠相比，SCI組大鼠p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表達顯著降低，激活PI3K/Akt能夠改善SCI大鼠組織炎癥和細胞凋亡，緩解OP[4-5]。另外，在大鼠SCI模型中miR-146a表達顯著降低[6]，過表達miR-146a能夠通過TLR/NF-κB信號通路促進大鼠SCI的修復并減少炎癥反應[7]。以上研究表明通過激活PI3K/Akt或是促進miR-146a表達能夠改善大鼠SCI后OP。但是有關PTH能否通過促進miR-146a表達，從而激活PI3K/Akt信號改善大鼠SCI后OP尚不清楚。既往研究顯示心力衰竭大鼠左心腔內注射miR-146a能夠通過抑制PI3K/Akt信號通路抑制心肌細胞凋亡，促進疾病的發(fā)生與發(fā)展[8]，表明miR-146a是PI3K/Akt信號調控的上游因子。本研究在大鼠模型上證實了PTH在改善脊髓損傷后OP的同時也上調了骨組織miR-146a、PI3K和Akt的表達水平。而miR-146a抑制劑的使用不僅拮抗PTH對OP的改善，也同時拮抗PTH對miR-146a、PI3K和Akt表達的上調作用。說明PTH是通過上調miR-146a表達進而激活PI3K/Akt信號通路，即調控miR-146a/PI3K/Akt信號軸，從而改善大鼠OP的。我們的研究結果可為OP的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 ♂，6周齡，SPF級SD大鼠40只，體質量(18-200)g，購自于南華大學醫(yī)學院實驗動物學部，許可證號：SYXK(湘)2019-0025，動物實驗經(jīng)過南華大學附屬第二醫(yī)院動物倫理委員會審核批準(批準號：202002003)。

1.1.2藥品與試劑 甲狀旁腺激素1-34(批號：S110819-04，純度≥97%，100 μg/支，上海吉爾生化有限公司)；血鈣檢測試劑盒(批號：201935，南京建成生物技術公司)；堿性磷酸酶檢測試劑盒(批號：201934，南京建成生物技術公司)；蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒(批號：C0105S，上海碧云天生物技術)；逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq以及TRIzol Reagent(日本TAKARA公司)；Akt抗體(批號：ab8805，英國Abcam公司)；p-Akt抗體(批號：ab38449，英國Abcam公司)；PI3K抗體(批號：ab32536，英國Abcam公)；p-PI3K抗體(批號：ab76302，英國Abcam公司)；β-actin抗體(批號：AF5001，上海碧云天生物技術)；羊抗兔IgG抗體(批號：A0239，上海碧云天生物技術)；羊抗鼠IgG抗體(批號：A0192，上海碧云天生物技術)；極超敏ECL化學發(fā)光試劑盒(批號：P0018FS，上海碧云天生物技術)。

1.1.3儀器 TWK-FST32型組織勻漿儀(武漢泰普拓公司)；Micro17R型高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；GPJ9-TS100-F型倒置熒光顯微鏡(日本尼康(Nikon)公司)；FC型全自動多功能酶標檢測儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；7170A型全自動生化分析儀(日本日立公司)；LUNAR- Prodigy型雙能X線骨密度測定儀(美國GE公司)；1658033型電泳儀(美國伯樂Bio-Rad公司)；ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1動物建模與分組 實驗SD大鼠在25 ℃，相對濕度50%-70%的室內適應性喂養(yǎng)7 d，期間自由因飲水、飲食。實驗分為假手術組(Sham)、脊髓損傷組(SCI)、脊髓損傷+甲狀旁腺激素組(SCI+PTH)、SCI+PTH+轉染miR-146a無關片段組(SCI+PTH+NC)以及SCI+PTH+轉染miR-146a抑制劑組(SCI+PTH+miR-146a inhibitor)，每組各10只。其中SCI、SCI+PTH、SCI+PTH+NC和SCI+PTH+miR-146a inhibitor組大鼠構建脊髓損傷模型：大鼠腹腔麻醉，將其取仰臥位固定在大鼠板上，采用剃毛刀剔除大鼠背部手術部位毛發(fā)并對其進行消毒。之后利用手術剪刀剪開大鼠背部皮膚使其暴露T9～T11節(jié)椎間板與棘突，將T10節(jié)椎板切除，并將大鼠脊髓向外緣擴展大約2.5 mm直徑的圓形區(qū)域，在此區(qū)域內于硬膜表層處放置與脊髓表層彎曲度相同的塑料隔片，之后使用砝碼(10 g)順沿玻璃導管垂直下落，打擊隔片以制造出大鼠脊髓損傷，Sham組大鼠僅剪開背部皮膚使其暴露T9-T11節(jié)椎間板與棘突，之后封閉手術切口并給予青霉素鈉皮下注射(2萬U·d-1)。在造模成功的基礎上大鼠每3 d一次尾靜脈注射給予60 μg·kg-1PTH(SCI+PTH組)、60 μg·kg-1PTH及20 pm miR-146a NC(SCI+PTH+NC組)或60 μg·kg-1PTH及20 pm miR-146a inhibitor(SCI+PTH+miR-146a inhibtor組)，連續(xù)8周。Sham組和SCI組大鼠同法給予等量的生理鹽水。

1.2.2各組大鼠行為學評分 依據(jù)BBB評分法[9]對各組大鼠進行包括髖關節(jié)、踝關節(jié)、膝關節(jié)以及軀干運動和協(xié)調情況進行相關觀察，記錄手術后1 d、7 d、14 d、21 d、28 d、56 d大鼠行為運動評分，為保證實驗數(shù)據(jù)的準確性，實驗通過4人獨立觀察并打分。BBB評分標準：共21分，全癱即為0分，正常為21分。

1.2.3骨代謝相關生化指標檢測 各組大鼠處理8周后，進行心臟采血并于4 ℃，3 000 r·min-1，離心10 min，取其上清，采用7170A型全自動生化分析儀進行免疫比濁法測定血清鈣(calcium，Ca)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)含量。

1.2.4骨密度測定 實驗各組大鼠處理8周后，采用LUNAR- Prodigy型雙能X線骨密度測定儀對大鼠股骨近端以及脛骨近端的骨密度進行測定，每組共計10只SD大鼠。實驗操作由2人獨立完成，取其平均值即為實驗大鼠骨密度值。

1.2.5HE染色 各組大鼠麻醉后，迅速采用斷頭處死，剪取8周大鼠脊髓損傷部位的脊髓組織，采用4%的多聚甲醛固定各組大鼠脊髓組織，脫水、透明、包埋、石蠟切片，并按照HE染色試劑盒進行脊髓組織染色，顯微鏡下觀察各組大鼠脊髓組織形態(tài)學變化。

1.2.6實時熒光定量PCR檢測miR-146a表達 依據(jù)RNA提取試劑盒說明書步驟提取各組大鼠脊髓總RNA，并運用紫外分光光度計檢測總RNA的濃度與純度。以RNA為模板，參照逆轉錄試劑盒說明書步驟將其逆轉錄為單鏈cDNA。再以cDNA為模板，根據(jù)廣州銳博公司設計合成的PCR引物進行擴增。擴增條件：92 ℃，30 s；92 ℃，5 s；60 ℃，31 s，共進行30個循環(huán)。采用7300 System SDS Software 分析數(shù)據(jù)，根據(jù)2-ΔΔCt值相對定量樣本中目的基因表達水平。

Tab 1 Sequence of primer

1.2.7Western blot檢測PI3K、Akt蛋白表達 取8周各組大鼠手術截取的脊髓損傷部位的脊髓組織，組織碾磨，裂解；BCA法測定蛋白質濃度；凝膠電泳；濕轉轉膜；上樣；用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，孵育對應Akt抗體(1 ∶1 000)，p-Akt抗體(1 ∶1 000)，PI3K抗體(1 ∶1 000)，p-PI3K抗體)以及β-actin抗體(1 ∶2 000)，4 ℃過夜，孵育對應的羊抗兔IgG抗體或者羊抗鼠IgG抗體(1 ∶5 000)1～2 h，；搖床搖晃上加TPBS洗滌3次，5 min/次，然后加入顯影液，顯影并拍照。Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K蛋白表達水平則以目的蛋白條帶灰度值與β-actin灰度值相比反映。

2 結果

2.1 PTH對大鼠BBB評分的影響手術后1 d、7 d、14 d、21 d、28 d、56 d大鼠BBB行為運動評分顯示，與Sham組相比，SCI組大鼠BBB評分均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。與SCI組相比，SCI+PTH組大鼠均明顯升高(P<0.05或P<0.01)。與SCI+PTH組相比，SCI+PTH+miR-146a inhibitor組大鼠BBB評分明顯降低(P<0.05或P<0.01)(Tab 2)。

2.2 PTH對大鼠血清Ca和ALP含量的影響手術后8周，與Sham組相比，SCI組大鼠血清Ca含量明顯降低(P<0.01)，ALP含量明顯升高(P<0.01)。與SCI組相比，SCI+PTH組大鼠血清Ca含量均明顯升高(P<0.05或P<0.01)，ALP含量均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。與SCI+PTH組相比，SCI+PTH+miR-146a inhibitor組大鼠血清Ca含量降低(P<0.01)，ALP含量升高(P<0.01)(Fig 1)。

2.3 PTH對大鼠骨密度的影響手術后8周，與Sham組相比，SCI組大鼠股骨近端以及脛骨近端的骨密度均明顯降低(P<0.01)。與SCI組相比，SCI+PTH組大鼠股骨近端以及脛骨近端的骨密度均升高(P<0.05或P<0.01)。與SCI+PTH組相比，SCI+PTH+miR-146a inhibitor組大鼠股骨近端以及脛骨近端的骨密度均降低(P<0.05或P<0.01)(Fig 2)

2.4 PTH對大鼠脊髓形態(tài)學的影響手術后8周，HE染色顯示，Sham組大鼠骨組織結構完整，骨質密度粗壯，形態(tài)完整，連接緊密，骨細胞排列齊整，有大量的骨小梁存在。SCI組大鼠出現(xiàn)典型的骨質疏松癥狀，表現(xiàn)為骨小梁減少、稀疏，骨細胞間隙增寬并伴有骨板層結構疏松等，SCI+PTH和SCI+PTH+NC組大鼠骨組織結構相對完整，骨質密度變密，且骨小梁數(shù)目明顯高于SCI組，骨質細胞連續(xù)性較好，細胞排列基本齊整。SCI+PTH+miR-146a inhibitor組大鼠表現(xiàn)為骨細胞間隙增寬等且出現(xiàn)典型的骨質疏松現(xiàn)象(Fig 3)。

Tab 2 Comparison of BBB scores of rats in each

Fig 1 Comparison of serum Ca and ALP levels in rats of each n=10)

Fig 2 Effect of PTH on bone mineral density in n=10)

Fig 3 Observation of morphological changes of spinal cord of each group of rats by HE staining(400×)

2.5 PTH促進miR-146a表達手術后8周，RT-PCR檢測顯示，與Sham組相比，SCI組大鼠骨髓組織miR-146a表達下調(P<0.01)。與SCI組相比，SCI+PTH組大鼠骨髓組織miR-146a表達均明顯上調(P<0.05)。與SCI+PTH組相比，SCI+PTH+miR-146a inhibitor組大鼠骨髓組織miR-146a表達下調(P<0.01)(Fig 4)。

Fig 4 Expression level of miR-146ain each group of n=10)

2.6 PTH促進p-PI3K、p-Akt 蛋白表達手術后8周，Western blot檢測顯示，與Sham組相比，SCI組大鼠骨髓組織p-PI3K、p-Akt蛋白表達均明顯降低(P<0.01)。與SCI組相比，SCI+PTH組大鼠骨髓組織p-PI3K、p-Akt蛋白表達均升高(P<0.05或P<0.01)。與SCI+PTH組相比，SCI+PTH+miR-146a inhibitor組大鼠骨髓組織p-PI3K、p-Akt蛋白表達均降低(P<0.05或P<0.01)(Fig 5)。

3 討論

SCI是一種嚴重性致殘性傷害，可導致脊髓支配運動、感覺以及自主神經(jīng)功能障礙等多種并發(fā)癥的發(fā)生。因此，積極的治療SCI對于改善患者繼發(fā)性并發(fā)癥，減輕家庭負擔具有重要意義。目前有關SCI的臨床治療措施主要包括急性期保護措施、并發(fā)癥治療、康復治療、SCI修復治療如神經(jīng)因子、相關激素、組織干細胞移植治療等[10]。研究表明PTH作為SCI修復激素治療對于改善其臨床并發(fā)癥具有顯著療效[11]。另外，PTH在維持SCI后OP中具有雙重調節(jié)作用，一方面可以增加成骨細胞數(shù)量、促進骨生長因子釋放，進而促進骨形成。另一方PTH能夠增加破骨細胞活性，促進骨吸收[2]。血清Ca和ALP是骨代謝的關鍵性生化指標，其中Ca參與機

Fig 5 Effect of PTH on PI3K/Akt signal

體內礦物質平衡以及骨骼肌生長發(fā)育等。ALP是與骨形成和骨細胞活性密切相關的生化指標。通過檢測血清Ca和ALP含量能夠反映SCI后OP狀況?；谝陨媳狙芯渴紫韧ㄟ^構建SCI大鼠模型探究PTH能夠改善SCI并發(fā)OP。結果顯示，與Sham組相比，SCI組大鼠BBB評分均明顯降低，血清Ca降低、ALP升高，股骨近端以及脛骨近端的骨密度降低且脊髓組織出現(xiàn)典型的骨質疏松癥狀，表現(xiàn)為骨小梁減少、稀疏，骨細胞間隙增寬并伴有骨板層結構疏松，表明SCI大鼠模型構建成功。而SCI+PTH組大鼠上述癥狀得到明顯改善。以上研究初步表明PTH對SCI后OP大鼠具有一定治療作用，但是有關PTH對SCI的具體作用機制尚不完全清楚。

miRNA是一類廣泛存在于真核生物中的小分子非編碼RNA，其在SCI的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[12]。既往研究證實，miRNA能夠靶向抑制目標蛋白mRNA，抑制轉錄和翻譯過程，參與了機體細胞的增殖、分化以及代謝等病理生理過程，特別是在SCI的進展中起到至關重要的作用[13]。研究miR-146a是位于染色體5q24參與SCI骨髓細胞凋亡和炎癥反應。在SCI小鼠模型中通過基因芯片篩選顯示miR-146a表達明顯降低，其表達水平與SCI損傷程度呈負相關[14]。表明miR-146a可能是SCI病理過程中的重要調控因子。但是有關PTH能否通過影響miR-146a表達進而改善SCI尚不清楚。因此，本研究通過RT-PCR檢測各組大鼠脊髓組織miR-146a水平。結果顯示與Sham組相比，SCI組miR-146a表達明顯下調。與SCI組相比，SCI+PTH組大鼠骨髓組織miR-146a表達均明顯上調。以上研究結果表明PTH能夠通過促進miR-146a表達，繼而改善SCI后OP。PI3K/Akt信號是與SCI骨髓細胞增殖、凋亡、炎癥以及成骨等密切相關。以往文獻報道顯示激活PI3K/Akt能夠增加星形膠質神經(jīng)營養(yǎng)因子和粘附分子釋放，增強體外傷口修修復，從而促進SCI大鼠后肢運動功能恢復[15]。另外，PTH通過PTH受體激活下游PI3K/Akt/Bad通路從而發(fā)揮抗成骨樣細胞凋亡作用[16]。因此，本實驗通過Western blot檢測顯示與Sham組相比，SCI組大鼠骨髓組織p-PI3K、p-Akt蛋白表達均明顯降低。與SCI組相比，SCI+PTH組大鼠骨髓組織p-PI3K、p-Akt蛋白表達均顯著升高。本研究結果與Chen等[4]研究一致。表明PTH能夠通過促進PI3K/Akt信號活化，改善大鼠SCI后OP。為進一步明確miR-146a/PI3K/Akt信號在PTH治療SCI中的關鍵調控作用。本研究通過SCI大鼠尾靜脈注射miR-146a inhibitor，觀察PTH是否通過上調miR-146a，從而激活PI3K/Akt信號，并最終改善SCI后OP。結果顯示與SCI+PTH組相比，SCI+PTH+miR-146a inhibitor組大鼠骨髓組織p-PI3K、p-Akt蛋白表達均顯著降低，BBB評分明顯降低、血清Ca含量降低，ALP含量升高、股骨近端以及脛骨近端的骨密度均降低且伴有典型的骨質疏松癥狀。以上研究結果表明PTH能夠通過miR-146a/PI3K/Akt信號改善SCI后大鼠OP。既往研究顯示miR-146a能夠通過PI3K/Akt信號調控腫瘤細胞、巨噬細胞等增殖、遷移等[17-18]。因此，在PTH改善SCI大鼠OP時miR-146a可能是PI3K/Akt的關鍵上游調控因子。

綜上所述，本研究通過探究PTH對SCI后大鼠OP的影響及其作用機制。結果顯示PTH對SCI骨質疏松癥具有一定的治療作用，其機制可能通過調控miR-146a/PI3K/Akt信號實現(xiàn)。