石振金，張瑞林，王一航，吳亞梅，楊根夢，沈?qū)氂?，?上，劉鵬亮， 朱婷娜，趙永娜，李利華，張冬先，洪仕君

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500；2.楚雄醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，云南 楚雄 675005； 3.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500)

甲基苯丙胺(methamphetamine，MA)是一種安非他明類中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮劑，MA濫用者在我國240.4萬名在冊吸毒人員中占比56.1%[1]，是濫用人數(shù)最多的毒品類型。MA具有極強(qiáng)的依賴性，會引起認(rèn)知障礙、焦慮、抑郁以及暴力行為等精神系統(tǒng)障礙癥狀，甚至中毒導(dǎo)致因腦出血、缺血缺氧而昏迷或死亡。迄今為止MA的依賴機(jī)制尚未明確。微RNA(micro RNA，miRNA)是腦內(nèi)廣泛存在的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，調(diào)節(jié)神經(jīng)元凋亡和突觸相關(guān)基因表達(dá)。既往研究表明，miRNA-132在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的異常表達(dá)可能與MA誘發(fā)的神經(jīng)毒性作用密切相關(guān)。在miRNA-132基因上游調(diào)控序列中存在轉(zhuǎn)錄激活因子環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)結(jié)合位點(diǎn)，而與中樞神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的甲基化CpG結(jié)合蛋白2(methyl CpG binding protein 2，Mecp2)則為miRNA-132的直接作用靶點(diǎn)之一。但miRNA-132、Mecp2在MA所致神經(jīng)毒性損害和依賴中的作用尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本文試圖探討MA是否可通過CREB調(diào)控miRNA-132影響miRNA-132及Mecp2的表達(dá)，從而參與MA的依賴機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器甲基苯丙胺由云南省公安廳公安部禁毒技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室合法提供，化學(xué)法提純后用生理鹽水配制成10 g·L-1的MA溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)。Mecp2一抗(兔抗，1 ∶1 000，Cell Signaling公司，D4F3，#3456)，p-Mecp2一抗(兔抗，1 ∶1 000，Novus公司，pSer421，#NBP2-29524)，CREB一抗(兔抗，1 ∶1 000，Cell Signaling公司，D76D11，#9197)，p-CREB一抗(兔抗，1 ∶1 000，Cell Signaling公司，Ser133，#9198)，β-actin(鼠抗，1 ∶5 000，Proteintech 公司，66375-1-Ig，#2D4H5)。HRP標(biāo)記山羊抗鼠的二抗(1 ∶5 000，Abbkine公司，A21010)，HRP標(biāo)記山羊抗兔的二抗(1 ∶5 000，Abbkine公司，A21020)，mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(BestarTMqPCR RT Kit，DBI Bioscience，DBI-2220)，qPCR檢測mRNA試劑盒(BestarR SybrGreen qPCR Mastermix，DBI Bioscience，DBI-2043)，miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(All-in-oneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit，GeneCopoeia，QP014)，qPCR檢測miRNA試劑盒(All-in-oneTMmiRNA qPCR Kit，GeneCopoeia，QP011)。

主要儀器：條件性位置偏愛檢測設(shè)備(上海欣軟信息有限公司，型號XR-XT401)；電泳儀、膜轉(zhuǎn)印裝置(Bio-Rad公司)；PCR儀(Bio-Rad公司，型號T100TMThermal Cycler)，熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司，型號C1000 TouchTMThermal Cycler)。

1.2 動物模型雄性SD大鼠60只，5～6周齡，體質(zhì)量(180～220) g，購于昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部[許可證號：SCXK(滇)2011-0004]，隨機(jī)分成6組，分別為MA依賴1周、2周、4周組及對照的生理鹽水組。腹腔注射MA(10 mg·kg-1·d-1)與生理鹽水(10 mg·kg-1·d-1)10 d后，用 條件性位置偏愛(conditioned place preference，CPP)及刻板行為(stereotyped behavior，SB)評分確認(rèn)大鼠產(chǎn)生MA依賴，再分別給藥1、2、4周建立不同依賴時(shí)程MA依賴模型，再用CPP實(shí)驗(yàn)和SB評分檢測行為學(xué)改變。末次給藥24 h后，用10 g·L-1水合氯醛麻醉，灌注取腦，分離額葉皮質(zhì)、海馬組織，置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.3 Western blot檢測蛋白質(zhì)表達(dá)腦組織解凍后稱取約200 mg，用含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解，BCA法檢測蛋白濃度，加入上樣緩沖液(5X)后混勻、變性。以50 ng上樣，SDS-PAGE電泳分離，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)至0.45 μm PVDF膜上；膜用5%脫脂奶粉(或5% BSA)于搖床上室溫封閉1 h，分別加入相應(yīng)Mecp2一抗，p-Mecp2一抗，CREB一抗和p-CREB一抗(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，再加入相應(yīng)種屬二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h；ECL化學(xué)發(fā)光顯色，Bio-Rad凝膠成像儀顯影成像。ImageJ圖像軟件分析Western blot條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白相對于內(nèi)參β-actin的相對含量，磷酸化目的蛋白相對于總蛋白的相對含量。

1.4 RT-qPCR檢測miRNA及mRNA

1.4.1RT-qPCR引物信息 經(jīng)NCBI網(wǎng)站查詢目的基因序列信息后，用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成(Tab 1)。

Tab 1 Primer sequences for qPCR

1.4.2實(shí)驗(yàn)步驟 腦組織解凍后稱取約100 mg，用TRIzol法提取總RNA，以2 μg 總RNA進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。①用mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，再用qPCR試劑盒檢測Mecp2 mRNA，以GAPDH為內(nèi)參基因。②用miRNA試劑盒合成第一鏈cDNA，再用qPCR試劑盒檢測miRNA-132，以U6為內(nèi)參基因。2-△△ct法比較各組mRNA和miRNA的表達(dá)差異。

2 結(jié)果

2.1 動物模型建立MA依賴1、2、4周組大鼠在伴藥箱的停留時(shí)間明顯增加，均產(chǎn)生明顯CPP效應(yīng)。大鼠出現(xiàn)明顯的興奮性及刻板行為，刻板行為評分隨著依賴時(shí)間延長而減少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見課題組前期發(fā)表的數(shù)據(jù)[2]。

2.2 RT-qPCR檢測miRNA-132、Mecp2 mRNA表達(dá)miRNA-132在甲基苯丙胺依賴1、2周組(P<0.01)和4周組(P<0.05)額葉皮質(zhì)中表達(dá)明顯升高；在海馬中表達(dá)呈降低趨勢，其中在MA依賴2、4周組明顯降低(P<0.01)(Fig 1A)。Mecp2 mRNA在MA依賴1、2、4周組額葉皮質(zhì)(P<0.05或P<0.01)和海馬(P<0.01)中表達(dá)均升高(Fig 1B)。

2.3 額葉皮質(zhì)中Mecp2、p-Mecp2、CREB、p-CREB表達(dá)Mecp2在MA依賴1、2、4周組(P<0.01)額葉皮質(zhì)中表達(dá)明顯降低(Fig 2A，B)，且磷酸化水平呈升高趨勢，在MA依賴1、2周組(P<0.01)中磷酸化水平明顯升高(Fig 2A,C)。CREB在1、2、4周組額葉皮質(zhì)中表達(dá)無明顯變化(Fig 2A,D)，但磷酸化水平呈降低趨勢，在1、4周組中磷酸化水平明顯降低(P<0.01)(Fig 2A,E)。

Fig 1 Expression of miRNA-132 and Mecp2 mRNA in frontal cortex and hippocampus of MA-induced

Fig 2 Expression of Mecp2, p-Mecp2/Mecp2, CREB and p-CREB/ CREB in frontal cortex of MA-induced

2.4 海馬中Mecp2、p-Mecp2、CREB、p-CREB表達(dá)Mecp2在MA依賴1周組(P<0.05)海馬中表達(dá)明顯升高，之后呈降低趨勢，在MA依賴4周組(P<0.05)中表達(dá)明顯降低(Fig 3A,B)。Mecp2的磷酸化水平在MA依賴1周組(P<0.01)表達(dá)明顯降低，之后呈升高趨勢，在MA依賴2周組(P<0.01)中明顯升高(Fig 3A,C)。CREB及其磷酸化在MA依賴1、2、4周組海馬中均無明顯表達(dá)變化(Fig 3 A,D-E)。

3 討論

本研究以腹腔注射MA建立1、2、4周不同時(shí)程的MA依賴大鼠模型，MA在各實(shí)驗(yàn)組均導(dǎo)致大鼠表現(xiàn)出明顯的CPP效應(yīng)。CPP實(shí)驗(yàn)利用條件性刺激影響動物位置偏好，以產(chǎn)生藥物依賴動物的行為學(xué)特點(diǎn)評價(jià)藥物的依賴性，是評價(jià)動物出現(xiàn)藥物依賴的經(jīng)典動物模型。

Fig 3 Expressions of Mecp2, p-Mecp2/Mecp2, CREB and p-CREB/CREB in hippocampus of MA dependent n=3)

額葉皮質(zhì)、海馬是調(diào)節(jié)行為活動、認(rèn)知功能、學(xué)習(xí)和記憶的重要腦區(qū)，miRNA-132在MA依賴1、2、4周組額葉皮質(zhì)中表達(dá)明顯升高，在海馬中則表達(dá)降低，雖然兩個(gè)腦區(qū)miRNA -132的表達(dá)趨勢不一致，但均存在明顯的異常表達(dá)。此前，有研究在體外培養(yǎng)miRNA-212/132敲除幼鼠皮質(zhì)神經(jīng)元，神經(jīng)元有出現(xiàn)樹突短縮、分叉等改變[3]，靶向敲除miRNA-212/132基因會對海馬中mRNA的轉(zhuǎn)錄譜產(chǎn)生廣泛影響，并出現(xiàn)空間記憶、識別記憶和認(rèn)知功能障礙[4]，miRNA-132表達(dá)減少會增加神經(jīng)退行性疾病的患病率。但Chen等[5]在神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-132后，也發(fā)現(xiàn)miRNA-132通過影響細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡來抑制神經(jīng)元的分化，且促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞分化。維持miRNA-132穩(wěn)定在中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)具有重要作用，miR-132輕度表達(dá)增加可增強(qiáng)認(rèn)知功能，但超生理水平的miR-132則會損害學(xué)習(xí)功能[6]。上述研究結(jié)果說明miRNA-132參與了調(diào)節(jié)MA依賴引起的神經(jīng)損害作用。

miRNA為小分子單鏈非編碼RNA，是基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，由RNA聚合酶II編碼生成初級產(chǎn)物pre-miRNA，經(jīng)Dicer酶切后形成約20個(gè)核苷酸的雙鏈miRNA，其中一鏈與靶mRNA的3′非編碼區(qū)互補(bǔ)配對，一方面裝載成RISC沉默復(fù)合體降解mRNA，另一方面與翻譯起始區(qū)結(jié)合抑制mRNA翻譯[7]。在MA依賴者的血漿、外泌體以及組織中均發(fā)現(xiàn)包括miRNA-132在內(nèi)的miRNA的異常表達(dá)。miRNA-132位于人17號和大鼠10號染色體，與miRNA-212合稱為miRNA-212/132家族[8]。MA可增加第二信使環(huán)磷酸腺苷(cAMP)分泌，活化CREB后與miRNA-212/132基因上游CRE位點(diǎn)的結(jié)合，調(diào)節(jié)miRNA-212/132的生成[9]。CREB參與MA依賴機(jī)制已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道，MA通過cAMP / PKA / CREB通路實(shí)現(xiàn)CREB的磷酸化激活，CREB活化后與c-fos、fosb、Syp、BDNF等基因的啟動子結(jié)合而發(fā)揮作用[10]，miRNA-132亦受CREB的調(diào)控。本研究中，CREB的表達(dá)在額葉皮質(zhì)無明顯差異，MA在1周和4周組中抑制了CREB的磷酸化，而海馬中CREB及其磷酸化均無明顯差異。有報(bào)道認(rèn)為MA可抑制伏隔核、海馬中CREB的磷酸化激活，但在不同依賴時(shí)程、不同腦區(qū)組織中CREB蛋白的磷酸化水平存在差異[11]，CREB磷酸化在MA依賴中可能無穩(wěn)定的表達(dá)變化趨勢，CREB磷酸化水平降低也未影響miRNA-132的表達(dá)。MA可能通過其他轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)調(diào)節(jié)miRNA-132表達(dá)，如已報(bào)道的MSK1/2、ERK1/2途徑等[12]，有待深入探索。

Mecp2 mRNA為miRNA-132的作用靶點(diǎn)之一。Mecp2為甲基CpG結(jié)合域家族成員，可招募胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白去乙?；负推渌旧|(zhì)重塑蛋白介導(dǎo)基因沉默[13]，而Chahrous等[14]檢測缺失或過表達(dá)Mecp2小鼠下丘腦內(nèi)基因表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)大部分靶基因被Mecp2激活，其兼具轉(zhuǎn)錄激活因子和抑制因子作用。Mecp2基因缺陷為中樞系統(tǒng)發(fā)育障礙性疾病Ratt綜合征的主要病因，對神經(jīng)元成熟、突觸形成和突觸可塑性具有調(diào)節(jié)作用。在額葉皮質(zhì)，MA依賴各組中Mecp2 mRNA表達(dá)均升高，而Mecp2蛋白表達(dá)降低，與miRNA-132對Mecp2 mRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用的理論相吻合，miRNA-132對Mecp2 mRNA有轉(zhuǎn)錄后抑制作用。但在海馬，MA依賴各組中miRNA-132表達(dá)降低，Mecp2 mRNA表達(dá)升高，Mecp2蛋白在MA依賴1周組時(shí)表達(dá)增加，此后隨MA依賴時(shí)間的延長而降低，在MA依賴4周組中Mecp2的表達(dá)降低尤為明顯，miRNA-132與Mecp2表達(dá)趨勢未呈現(xiàn)負(fù)對應(yīng)關(guān)系。此前，Aten等[15]在晝夜節(jié)律研究中也發(fā)現(xiàn),miRNA-132在海馬表達(dá)變化會影響神經(jīng)元形態(tài)和記憶功能，但Mecp2與miRNA-132表達(dá)趨勢一致，認(rèn)為在蛋白表達(dá)/調(diào)控水平上，中樞內(nèi)的動力學(xué)改變也會影響miRNA的功能效果，mRNA穩(wěn)定性和翻譯速率以及蛋白質(zhì)的半衰期，均影響著miRNA的作用效應(yīng)。Morozova等[16]也提出miRNA的作用模式還取決與靶mRNA的自身特征，因此，存在多個(gè)靶點(diǎn)時(shí)，并非所有靶點(diǎn)表達(dá)均受影響。Im等[17]則提出miRNA-212/132和Mecop2之間的作用穩(wěn)態(tài)可調(diào)節(jié)可卡因的攝取，觀察到連續(xù)注射7 d可卡因后Mecp2在紋狀體和海馬中高表達(dá)，在額葉皮質(zhì)中則表達(dá)降低，海馬中Mecp2的表達(dá)與本研究MA依賴1周組的結(jié)果相似。Deng等[18]的研究也表明，Mecp2參與慢性MA依賴中興奮性和抑制性信號傳遞，慢性MA作用會增加Mecp2磷酸化而調(diào)節(jié)中樞內(nèi)蛋白的轉(zhuǎn)錄活動，與之相似的是，本研究中MA依賴中Mecp2磷酸化水平也有明顯增加。上述結(jié)果均說明，Mecp2在MA依賴所致的毒性損害中有調(diào)節(jié)作用，但額葉皮質(zhì)和海馬兩個(gè)腦區(qū)中Mecp2的作用模式存在差異。

綜上，MA依賴可誘導(dǎo)額葉皮質(zhì)和海馬腦區(qū)中miRNA-132的異常表達(dá)。在額葉皮質(zhì)，miRNA-132可能通過抑制Mecp2 mRNA的翻譯，致Mecp2蛋白表達(dá)降低；但在海馬，miRNA-132 與Mecp2表達(dá)趨勢未呈現(xiàn)負(fù)對應(yīng)關(guān)系。研究結(jié)果提示miRNA-132與Mecp2參與了調(diào)節(jié)MA誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性損害，miRNA-132在額葉皮質(zhì)中的作用可能是通過Mecp2發(fā)揮的，但在海馬中并不依賴于Mecp2發(fā)揮其作用，Mecp2在額葉皮質(zhì)和海馬中的作用模式和機(jī)制存在差異。