陳朝喜，李宇涵，譚敏，汪露，黃志宏

西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041

0 引言

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集和標(biāo)準(zhǔn)菌株 417份牦牛和藏豬新鮮糞便和胃內(nèi)容物樣本于2017年10月至2018年8月間無(wú)菌采自四川省川西北高原地區(qū)阿壩州和甘孜州部分養(yǎng)殖場(chǎng)或屠宰場(chǎng)（其中牦牛糞便和胃腸道內(nèi)容物樣本263份，藏豬糞便樣本154份）；大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株 ATCC25922由西南民族大學(xué)獸醫(yī)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

1.1.2 培養(yǎng)基、抗菌藥物和分子生物學(xué)試劑 麥康凱瓊脂（MacConkey agar）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB，Trypticase soy broth）、LB肉湯（Luria-Bertani broth）購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限責(zé)任公司；MH肉湯（Mueller-Hinton broth）購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；15e腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；阿米卡星（AMK）、慶大霉素（GEN）、卡那霉素（KAN）、大觀霉素（SPT）、鏈霉素（STR）、妥布霉素（TOB）、氨芐西林（AMP）、氯霉素（CHL）、氟苯尼考（FLR）、環(huán)丙沙星（CIP）、沙拉沙星（SAR）、達(dá)氟沙星（DAN）、恩諾沙星（ENR）、左氧氟沙星 （LVX）、萘啶酸（NAL）、土霉素（OXY）、多西環(huán)素（DOX）、多黏菌素 B（POL）、利福平（RIF）、磺胺甲噁唑 （SMX）、磺胺二甲嘧啶（SM2）、頭孢曲松（CRO）、頭孢唑啉（CZO）和頭孢噻呋（TIO）等抗菌藥物購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司和阿拉丁試劑（上海）有限公司；2×Taq Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；DL2000 DNA marker購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；PCR擴(kuò)增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 牦牛和藏豬源大腸桿菌分離和鑒定 將無(wú)菌采集的新鮮糞便和胃腸道內(nèi)容物樣本置于提前準(zhǔn)備好的LB肉湯中，37℃培養(yǎng)12—18 h，劃線接種于麥康凱瓊脂平板，37℃培養(yǎng)12—16 h，選取粉紅色、表面光滑、大小適中的疑似菌落進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)；對(duì)純化三代的疑似大腸桿菌菌落進(jìn)行革蘭氏染色，并按照15e腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行生化鑒定。

1.2.2 藥物敏感性試驗(yàn) 以大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25922作為質(zhì)控菌株，抗菌藥物配制、藥物敏感性試驗(yàn)操作步驟及其結(jié)果判定均參考CLSI（美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)，Clinical and Laboratory Standards Institute）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行（2013版）。采用微量肉湯稀釋法對(duì)分離鑒定的大腸桿菌進(jìn)行 24種抗菌藥物敏感性試驗(yàn)，以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度作為測(cè)試藥物的最小抑菌濃度（MIC，minimum inhibitory concentration），每種抗菌藥物重復(fù)3次。

1.2.3 生物被膜形成能力試驗(yàn) 參照STEPANOVI?的改良半定量結(jié)晶紫染色法并略作改進(jìn)[17]，對(duì)分離鑒定的大腸桿菌進(jìn)行生物被膜形成能力鑒定。生物被膜形成能力判定標(biāo)準(zhǔn)如下：OD570＞4 ODc為強(qiáng)成膜能力，2 ODc＜OD570≤ 4 ODc為中等成膜能力，ODc＜OD570≤ 2 ODc為弱成膜能力，OD570≤ODc為無(wú)成膜能力。

1.2.4 耐藥基因、整合酶基因和毒力基因檢測(cè) 根據(jù)參考文獻(xiàn)和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)基因序列設(shè)計(jì)耐藥基因、整合酶基因和毒力基因擴(kuò)增引物序列（表1和表2），采用水煮法提取大腸桿菌總DNA。耐藥基因、整合酶基因和毒力基因 PCR擴(kuò)增體系均為 10 μL：2×Taq Master Mix 5 μL，上游引物（F）、下游引物（R）各0.5 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 3 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，以相應(yīng)退火溫度退火30—50 s，72℃延伸30 s至1 min，共35個(gè)循環(huán)，后72℃再延伸10 min，最后4℃保存。各基因擴(kuò)增過(guò)程中對(duì)引物用量和雙蒸水用量進(jìn)行調(diào)整，體系總體積不變，退火時(shí)間和延伸時(shí)間根據(jù)目的基因預(yù)期片段大小稍作調(diào)整。

表1 耐藥基因和整合酶基因擴(kuò)增引物信息Table 1 Information of PCR primers for ARGs and integrase genes amplification

表2 毒力基因擴(kuò)增引物信息Table 2 Information of PCR primers for virluence genes amplification

1.2.5 遺傳譜系分型 參照 CLERMONT等[30]采用多重PCR方法進(jìn)行chuA、yjaA和TspE4.C2擴(kuò)增，以chuA、yjaA和TspE4.C2的不同組合作為大腸桿菌遺傳譜系分型的判定依據(jù)。

3) 如果港口貨運(yùn)收益是投資收益的一部分，則根據(jù)式(2)和式(3)可知：投資主體的收益函數(shù)既是自身投資額的函數(shù)，又是其競(jìng)爭(zhēng)者投資的函數(shù)。各投資者會(huì)對(duì)其競(jìng)爭(zhēng)者的投資做出反應(yīng)，即針對(duì)競(jìng)爭(zhēng)者的每次投資都制定對(duì)應(yīng)的投資優(yōu)化策略。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 藥物敏感性試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用WHONET 5.6處理分析，相關(guān)性分析等利用SPSS 18.0處理分析。

續(xù)表1 Continued table 1

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌分離鑒定

對(duì)417份樣本中分離的疑似大腸桿菌進(jìn)行革蘭氏染色和生化鑒定，共分離鑒定大腸桿菌329株，分離率為78.9%（329/417），其中牦牛源和藏豬源大腸桿菌的分離率分別為 78.33%（206/263）和 79.87%（123/ 154）。

2.2 生物被膜表型分析

329株大腸桿菌生物被膜形成能力表型分析結(jié)果如圖1所示。大多數(shù)菌株表現(xiàn)出弱或無(wú)生物被膜形成能力表型，強(qiáng)、中、弱、無(wú)成膜能力大腸桿菌分別占0.61%（2/329）、4.56%（15/329）、54.7%（180/329）和 40.12%（132/329），牦牛和藏豬源大腸桿菌各 1株為強(qiáng)生物被膜表型。206株牦牛源大腸桿菌中，強(qiáng)、中、弱、無(wú)成膜能力菌株分別占0.49%（1/206）、5.34%（11/206）、56.31%（116/206）和37.86%（78/206）；123株藏豬源大腸桿菌中，強(qiáng)、中、弱、無(wú)成膜能力菌株分別占0.81%（1/123）、3.25%（4/123）、52.03%（64/123）和43.9%（54/123）。

2.3 耐藥基因、整合酶基因和毒力基因檢測(cè)與分析

329株大腸桿菌對(duì)卡那霉素、阿米卡星、壯觀霉素以外的抗菌藥物均表現(xiàn)出不同程度地耐藥性，其中磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噁唑 、鏈霉素、氯霉素、土霉素、利福平和氨芐西林等耐藥較為嚴(yán)重，其耐藥率分別為100.0%、100.0%、100.0%、97.0%、57.1%、56.5%和35.9%（表3）；牦牛和藏豬源大腸桿菌對(duì)24種抗菌藥物的耐藥趨勢(shì)基本一致，藏豬源大腸桿菌耐藥水平略高于牦牛源大腸桿菌的原因可能與菌株數(shù)量有關(guān)。

表3 329株大腸桿菌對(duì)24種抗菌藥物的藥物敏感性試驗(yàn)Table 3 Antibacterial sensitivity testing of 329 E.coli to 24 antibacterial agents

耐藥譜型分析結(jié)果表明，329株大腸桿菌共存在117種不同的耐藥譜型，且耐藥譜型分布較為分散，58.97%（194/329）的菌株表現(xiàn)為多重耐藥，最多對(duì)18種抗菌藥物耐藥（表4）。其中，耐7種以上抗菌藥物的菌株占80.55%（265/329），優(yōu)勢(shì)耐藥譜型為 CHL/DOX/OXY/RIF/SMX/SM2/STR，占 3.34%（11/329）；耐8種以上抗菌藥物的菌株中，牦牛和藏豬源大腸桿菌分別占各自來(lái)源的 36.89%（76/206）和60.98%（75/123），優(yōu)勢(shì)耐藥譜型為AMP/CHL/GEN/OXY/RIF/ SMX/SM2/STR，占2.13%（7/329）。

表4 329株大腸桿菌耐藥譜型匯總Table 4 Summary of antibacterial susceptibility profiles of 329 E.coli

除 cat1、cat2、blaCMY-2、blaSHV、tetC、tetG、tetX外，329株大腸桿菌均檢測(cè)到其它21個(gè)耐藥基因，其中以aac(6′)-Ib最為流行，其次為sul1和floR，其檢出率分別為 35.26%（116/329）、33.13%（109/329)和 34.65%（114/329）。耐藥表型與耐藥基因型相關(guān)性分析表明，牦牛源大腸桿菌對(duì)酰胺醇類和氨基糖苷類耐藥表型與攜帶的耐藥基因型均相關(guān)（P＜0.05），對(duì)β-內(nèi)酰胺類耐藥表型與blaTEM和blaDHA顯著相關(guān)（P＜0.01）；藏豬源大腸桿菌對(duì)四環(huán)素類、酰胺醇類和氨基糖苷類耐藥表型與攜帶的耐藥基因型均相關(guān)（P＜0.05），對(duì)喹諾酮類耐藥表型與 qnrA相關(guān)（P＜0.05）。

整合酶基因檢測(cè)結(jié)果表明，31.61%（104/329）的大腸桿菌攜帶至少一種整合酶基因，int1Ⅰ和 int2Ⅰ的檢出率分別為30.09%（99/329）和4.56%（15/329），其中10株大腸桿菌（牦牛源2株，藏豬源8株）同時(shí)檢測(cè)到int1Ⅰ和int2Ⅰ（圖2）。牦牛源大腸桿菌int1Ⅰ和intⅠ2的檢出率均低于藏豬源大腸桿菌，牦牛源大腸桿菌int1Ⅰ和int2Ⅰ的檢出率分別為18.93%（39/206）和3.4%（7/206），藏豬源大腸桿菌int1Ⅰ和int2Ⅰ的檢出率分別為48.78%（60/123）和6.5%（8/123）。

整合酶基因陽(yáng)性菌株的耐藥基因攜帶情況如表 5所示。同時(shí)攜帶整合酶基因菌株的四環(huán)素類耐藥基因tetA檢出率高于未攜帶整合酶基因的大腸桿菌；sul1、aadA2、aph(3’)-Ⅶ、aac(3’)-Ⅳ和 tetD 等 5 個(gè)耐藥基因與整合酶基因具有相關(guān)性（P＜0.05），與 rmtB、aac(6’)-Ib、tetB、tetM、cmlB、blaDHA7個(gè)耐藥基因顯著相關(guān)（P＜0.01），12個(gè)耐藥基因?qū)儆诨前奉?、氨基糖苷類、四環(huán)素類和β-內(nèi)酰胺類。

表5 整合酶基因陽(yáng)性菌株的耐藥基因攜帶情況信息表Table 5 ARGs carriage information of integrase genes positive E.coli strains

續(xù)表4 Continued table 4

續(xù)表4 Continued table 4

毒力基因檢測(cè)結(jié)果表明，除 stx1、stx2、ehxA、bcsB、hlyA和hlyE外，其余9個(gè)毒力基因均有陽(yáng)性檢出（圖3），其中以fimC陽(yáng)性率最高，bcsA陽(yáng)性率最低。agn43、bcsA、fyuA、irp2、sitA、fimC、LT、ompT、eaeA 的陽(yáng)性率分別為53.5%（176/329）、4.26%（14/329）、6.08%（20/329）、7.29%（24/329）、45.59%（150/329）、75.68%（249/329）、12.16%（40/329）、35.26%（116/329）、32.52%（107/329）。牦牛源大腸桿菌agn43、bcsA、fyuA、irp2、sitA、fimC、LT、ompT、eaeA 的陽(yáng)性率分別為 66.99%（138/206）、2.91%（6/206）、7.28%（15/206)、7.28%（15/206）、41.26%（85/206）、85.44%（176/206）、8.25%（17/206）、43.2%（89/206）和30.58%（63/206）；藏豬源大腸桿菌 agn43、bcsA、fyuA、irp2、sitA、fimC、LT、ompT、eaeA 的陽(yáng)性率分別為 30.89%（38/123）、6.5%（8/123）、4.07%（5/123）、7.32%（9/123）、52.85%（65/123）、59.35%（73/123）、18.7%（23/123）、21.95 %（27/123）和35.77%（44/123）。

329株大腸桿菌中，共有38種不同毒力譜型（表6，agn43與bcsA不具有直接致病性，毒力譜型和遺傳譜系分型分析時(shí)不計(jì)算在內(nèi)），285株大腸桿菌至少攜帶其余7個(gè)毒力基因中的1個(gè)，其中最多攜帶6個(gè)毒力基因；攜帶 3個(gè)以上毒力基因的牦牛和藏豬源大腸桿菌占各自來(lái)源的 30.1%（62/206）和 50.0%（62/123），優(yōu)勢(shì)毒力譜型為 fimC/ompT/sitA和eaeA/fimC/ompT/sitA，分別占8.25%（17/206）和8.94%（11/123）。

表6 329株大腸桿菌毒力基因譜型Table 6 Virulence genotypes of 329 E.coli

2.4 耐藥基因和毒力基因與遺傳譜系分型相關(guān)性分析

遺傳譜系分型結(jié)果如圖4和表7所示：329株大腸桿菌遺傳譜系以A型為主，共163株，占49.54%（163/329），其余依次為B1型、B2型和D型，分別占 39.21%（129/329）、6.08%（20/329）和 5.18%（17/329）。其中，牦牛源大腸桿菌遺傳譜系以 B1型為主，共103株，占50.0%（103/206），其余依次為A型、B2型和D型，分別占35.92% （74/206）、8.25%（17/206）和5.82%（12/206）。藏豬源大腸桿菌以A型為主，共89株，占72.36% （89/123），其余依次為 B1型、D型和 B2型，分別占 21.14%（26/123）、4.07%（5/123）和2.44%（3/123）。

表7 329株大腸桿菌的遺傳譜系分型分析Table 7 Phylogenetic analyses of 329 E.coli

329株大腸桿菌的耐藥基因和毒力基因與遺傳譜系分型相關(guān)性熱圖分析結(jié)果顯示：A型和B1型分布的耐藥基因種類較B2型和D型豐富；A型中sul3、qnrS、tetM耐藥基因分布最廣，而qnrA和tetD分布較少；B1型中sul1和aac(6′)-Ib分布最廣，不存在tetM和 qnrA（圖5-a）。毒力基因主要分布于 A型和 B1型，且B1型略高于A型，其中，fimC、sitA和ompT基因主要分布于A型和B1型，eaeA、fyuA和irp2的主要分布于B1型，LT基因主要分布于A型，僅1株分布于D型（圖5-b）。

3 討論

3.1 牦牛和藏豬源大腸桿菌耐藥現(xiàn)狀及其用藥情況分析

大腸桿菌血清型復(fù)雜和毒力多樣的特點(diǎn)加上青藏高原地區(qū)牦牛和藏豬多采取自由放養(yǎng)方式等原因，由此引發(fā)的大腸桿菌病在影響動(dòng)物健康的同時(shí)對(duì)牧民的生活和健康造成一定的影響。隨著抗菌藥物在牦牛和藏豬細(xì)菌性疾病治療中的不斷應(yīng)用和推廣，大腸桿菌在川西北高原已呈現(xiàn)一定的耐藥性。藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌株均表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，藏豬源大腸桿菌的耐藥率高于牦牛源，其中對(duì)氟苯尼考的耐藥率達(dá)到 30.9%，遠(yuǎn)高于牦牛源的 9.7%，對(duì)四環(huán)素類抗生素（土霉素和多西環(huán)素）的耐藥率均比牦牛源大腸桿菌高出1倍左右。本研究與李佛生[1]等報(bào)道的犢牦牛源大腸桿菌耐藥率相近，但與彭青等[35]報(bào)道的結(jié)果相差較大，分析其原因可能與藥敏試驗(yàn)方法和采樣地點(diǎn)等因素存在一定的關(guān)系。與課題組前期研究相比[3]，牦牛源大腸桿菌的耐藥水平和整合子攜帶率較低，與2017—2018年樣本采集地點(diǎn)較為分散和樣本數(shù)量有關(guān)。值得注意的是，耐藥譜型分析表明，58.97%（194/329）的菌株表現(xiàn)為多重耐藥，最多對(duì)18種抗菌藥物耐藥，警示牦牛和藏豬源大腸桿菌耐藥情況已較為嚴(yán)重，建議相關(guān)部門應(yīng)及時(shí)關(guān)注牦牛和藏豬大腸桿菌的耐藥現(xiàn)狀及其動(dòng)態(tài)變化，采用藥物敏感性試驗(yàn)篩選較為敏感的抗菌藥物進(jìn)行治療，盡量避免養(yǎng)殖人員使用耐藥率高的抗菌藥物，同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制抗菌藥物用量和使用頻率以避免耐藥性的產(chǎn)生和廣泛傳播。在后續(xù)的研究中，必須從切斷耐藥性傳播途徑角度多方位探究川西北高原大腸桿菌耐藥性產(chǎn)生的原因，從而闡明其耐藥機(jī)制并指導(dǎo)抗菌藥物的合理使用。

3.2 牦牛和藏豬源大腸桿菌耐藥基因、毒力基因、整合酶基因和生物被膜形成能力

抗生素耐藥性被認(rèn)為是全球性威脅之一，以大腸桿菌為代表的革蘭氏陰性菌多重耐藥菌株引起的持續(xù)性感染更加突顯，在廣泛持續(xù)的抗生素壓力下，菌株也可以形成生物被膜逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的清除和外源性抗菌藥物的殺滅，延長(zhǎng)病程和增加醫(yī)療成本的同時(shí)造成疾病的遷延不愈。此外，在質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、整合子-基因盒等可移動(dòng)元件的介導(dǎo)下，耐藥基因和毒力基因的廣泛傳播也給細(xì)菌性感染的治療帶來(lái)一定的困難[14]。

盡管分離菌株大多表現(xiàn)出弱或無(wú)生物被膜形成能力，但是對(duì)選用的24種抗菌藥物呈現(xiàn)不同程度的耐藥性并呈現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象，其中磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噁唑和鏈霉素完全耐藥。耐藥表型和耐藥基因型之間存在一定的相關(guān)性，其中檢測(cè)到的21個(gè)耐藥基因中，以aac(6′)-Ib最為流行（35.2%），其次為sul1和floR，檢出率均在30.0%以上，與SOUFI[36]等報(bào)道的耐藥基因攜帶情況基本一致。此外，本研究中氯霉素的耐藥率也表現(xiàn)出較高的耐藥水平，考慮到氯霉素為食品動(dòng)物禁用抗生素，其較高的耐藥率是否與人與動(dòng)物之間的直接接觸或耐藥性基因的水平傳播有關(guān)需要在后續(xù)研究中進(jìn)一步探究和闡明。

除stx1、stx2、ehxA、bcsB、hlyA和hlyE外，分離菌株中至少檢測(cè)到agn43、sitA、ompT、eaeA，bcsA、fimC、LT、fyuA和irp2中的1個(gè)，fyuA和irp2的檢出率均低于張艷芳等[37]的報(bào)道。

10株同時(shí)攜帶int1Ⅰ和int2Ⅰ大腸桿菌的耐藥基因表型、生物被膜表型和毒力基因型分析結(jié)果表明：5株對(duì) 11種以上的抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥性；70.0%（7/10）的菌株表現(xiàn)出弱生物被膜形成能力，其余3株為無(wú)生物被膜形成能力；10株大腸桿菌均攜帶eaeA，為后續(xù)深入研究以eaeA為代表的毒力基因在大腸桿菌生物被膜形成、耐藥譜型和毒力譜型及整合子-基因盒系統(tǒng)之間的相關(guān)性及其相關(guān)性如何等提供一定的研究思路和數(shù)據(jù)支持，從而闡明毒力基因在大腸桿菌性腹瀉致病過(guò)程及耐藥機(jī)制中發(fā)揮的作用。

3.3 耐藥基因和毒力基因與遺傳譜系分型相關(guān)性

遺傳譜系分型技術(shù)將大腸桿菌分為 A、B1、B2和D等4個(gè)不同的型，其中A型和B1型多為腸道共生菌，而B(niǎo)2和D型多為腸外致病性菌群，該分型技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是有助于了解大腸桿菌相關(guān)生物學(xué)特征和疾病之間的相關(guān)性[30,38]。

本研究中，牦牛源大腸桿菌遺傳譜系以 B1型為主，占50.0%（103/206），其余依次為A型、B2型和D型，分別占35.92%（74/206）、8.25%（17/206）和 5.82%（12/206），與王剛等[39]報(bào)道的結(jié)果基本一致；而藏豬源大腸桿菌遺傳譜系以 A型為主，占72.36%（89/123），其余依次為B1型、D型和B2型，分別占 21.14%（26/123）、4.07%（5/123）和 2.44%（3/123），與周陸紅等[40]對(duì)豬源大腸桿菌遺傳譜系分型結(jié)果基本一致。

329株大腸桿菌耐藥基因和毒力基因與遺傳譜系分型相關(guān)性分析結(jié)果表明，A型和B1型分布的耐藥基因種類較B2型和D型多；A型中，sul3、qnrS、tetM耐藥基因分布最廣，B1型中sul1和aac(6′)-Ib分布最廣，不存在tetM和qnrA；毒力基因主要分布于A型和B1型，fimC、sitA和ompT主要分布于A型和B1型，eaeA、fyuA和irp2的主要分布于B1型，LT基因主要分布于A型，僅1株分布于D型。

本研究結(jié)果表明，盡管分離菌株大多為腸道共生菌群，與采樣動(dòng)物的健康狀況有一定關(guān)系。然而，分離菌株攜帶大量的耐藥基因和毒力基因的檢測(cè)結(jié)果提示，健康動(dòng)物可能作為耐藥基因和毒力基因的儲(chǔ)存庫(kù)，因此，后續(xù)研究應(yīng)結(jié)合細(xì)菌基因組重復(fù)序列PCR技術(shù)（enterobacterial repetitive intergenic consensus-PCR，ERIC-PCR）、多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST）和脈沖電場(chǎng)凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）等多種分型技術(shù)，從分子研究水平比較健康和患病動(dòng)物耐藥基因和毒力基因差異并探究耐藥性和致病性之間的相關(guān)性。

4 結(jié)論

對(duì)無(wú)菌采自阿壩州和甘孜州部分養(yǎng)殖場(chǎng)或屠宰場(chǎng)牦牛、藏豬糞便和胃腸道內(nèi)容物樣本進(jìn)行大腸桿菌分離和鑒定，同時(shí)對(duì)分離菌株（329株）進(jìn)行生物被膜形成能力、藥物敏感性試驗(yàn)、耐藥基因、整合酶基因和毒力基因檢測(cè)及遺傳譜系分型相關(guān)性分析。329株大腸桿菌對(duì)24種抗菌藥物呈現(xiàn)不同程度的耐藥性并出現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象，耐藥表型和耐藥基因之間存在一定的相關(guān)性；285株至少攜帶除agn43和bcsA外7個(gè)毒力基因中的1個(gè)，最多攜帶6個(gè)毒力基因。31.61%（104/329）的菌株攜帶至少一種整合酶基因，int1Ⅰ和 int2Ⅰ的檢出率分別為30.09%和4.56%，其中10株大腸桿菌（牦牛源2株，藏豬源8株），同時(shí)檢測(cè)到int1Ⅰ和int2Ⅰ。耐藥基因和毒力基因與遺傳譜系相關(guān)性分析結(jié)果表明，A型和B1型分布的耐藥基因種類較B2型和D型豐富，毒力基因主要分布于A型和B1型。基于此，后續(xù)研究將從以下兩方面入手：結(jié)合多種分型技術(shù)，以同時(shí)攜帶int1Ⅰ和 int2Ⅰ的10株大腸桿菌為對(duì)象，分析eaeA毒力基因與生物被膜表型、耐藥譜型和毒力譜型及整合子-基因盒系統(tǒng)之間是否存在相關(guān)性及其相關(guān)性如何等？其次，基于牦牛和藏豬源大腸桿菌采樣信息資料，對(duì)產(chǎn)ESBL/AmpC多重耐藥菌株進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型和多因素邏輯回歸分析，從而對(duì) β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥性流行情況、風(fēng)險(xiǎn)因子和ST分型進(jìn)行深入探究探討，從分子機(jī)制探討其對(duì) β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的分子機(jī)制。