徐婷婷滕廣亮李英瑕吳 強(qiáng)單秀娟,2張慶利,2① 金顯仕,2

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室青島市海水養(yǎng)殖流行病學(xué)與生物安保重點實驗室 山東 青島 266071；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 山東 青島 266071)

中國近海漁業(yè)資源種類豐富，魚類和蝦類資源在漁業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中占據(jù)著重要地位(唐啟升, 2006;吳強(qiáng)等, 2012)。自20世紀(jì)80年代以來，受過度捕撈、氣候變化、環(huán)境污染等多重壓力的影響，黃東海生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生明顯的變化，傳統(tǒng)經(jīng)濟(jì)魚類資源出現(xiàn)一定程度的衰退，包括蝦類在內(nèi)的甲殼類資源所占比例明顯升高(Jin et al, 2013; Tang et al, 2016; Wu et al, 2018)。近期的相關(guān)研究表明，受人類海洋活動日趨頻繁和全球氣候變化加劇的影響，漁業(yè)資源種群演變更加復(fù)雜(Ramos et al, 2018; Baltar et al, 2019; Ward et al, 2019;Walworth et al, 2020)。除捕撈因素外，近海甲殼類動物的生物量還受水深、底層溫度、鹽度、經(jīng)緯度、底質(zhì)類型和離岸距離等因子的影響(Gribble et al, 2007;黃慶洋等, 2009; 逄志偉等, 2015; 趙靜等, 2017;張孝民等, 2018)。蝦類作為海洋生態(tài)系統(tǒng)中重要的次級生產(chǎn)者，是構(gòu)建食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)、解析能量流動和物質(zhì)循環(huán)過程中必不可缺的關(guān)鍵環(huán)節(jié)(陳小慶等,2010;梁金玲,2015)。因此，探討海洋中蝦類生物量變化及其影響因素對近海生物種群動態(tài)和海洋生態(tài)學(xué)研究有重要意義。

20世紀(jì)80年代以來，對蝦養(yǎng)殖業(yè)在世界多國蓬勃興起，為經(jīng)濟(jì)發(fā)展和優(yōu)質(zhì)動物蛋白供應(yīng)做出了突出貢獻(xiàn)(余云軍,2006)。然而，與全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展相伴的是多種病毒性疫病不斷出現(xiàn)，并對養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成沖擊(李建軍等,1998)。其中，對蝦白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)是已報道的對蝦病毒性疫病中危害嚴(yán)重且流行區(qū)域最廣的一類病原(Lightner,1996;何建國等,1999;雷質(zhì)文等,2002、2003;閆冬春, 2004;李鈁, 2009)。池塘養(yǎng)殖對蝦感染W(wǎng)SSV后2～7d內(nèi)的累計死亡率可達(dá)100%(雷質(zhì)文等,2003)。除了感染養(yǎng)殖對蝦外，近年來陸續(xù)有WSSV感染近海甲殼類動物的報道。如Chapman等(2004)通過PCR、組織病理學(xué)和組織原位雜交實驗證實捕獲自南大西洋灣的凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)樣品中存在 WSSV感染。Mijangos-Alquisires等(2006)從墨西哥加利福尼亞灣采集的近海蝦類樣品中檢測到WSSV較低陽性率(0.8%)的感染。Orosco等(2017)通過PCR檢測表明，采集自菲律賓近岸水域的蝦類中有WSSV陽性檢出。Gholamhosseini等(2020)通過PCR、組織病理學(xué)實驗和透射電子顯微鏡技術(shù)確定了伊朗近海印度明對蝦(Penaeusindicus)中存在WSSV。鑒于WSSV對甲殼類的廣泛致病性，近海甲殼類樣品中存在WSSV流行不免引發(fā)其可能危害野生蝦類種群動態(tài)的擔(dān)憂。

基于此，本研究于2016—2018年每年8月對WSSV在黃海和東海北部蝦類中的流行情況進(jìn)行系統(tǒng)調(diào)查，通過構(gòu)建梯度隨機(jī)森林模型(gradient random forest model,GFM)和廣義加性混合模型(generalized additive mixed models, GAMM)，評估WSSV流行情況及相關(guān)環(huán)境因子與調(diào)查海域蝦類生物量的相關(guān)性，以期為揭示水產(chǎn)養(yǎng)殖疫病病原對海洋甲殼類資源的影響提供新的視角。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2016、2017和 2018年 8月(休漁期)，搭乘中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所“北斗號”漁業(yè)調(diào)查船赴黃海和東海北部海域進(jìn)行3個航次的調(diào)查，并利用底拖網(wǎng)采集蝦類樣品。根據(jù)臨近站位間的距離和實時海況，在預(yù)設(shè)的120個站點中選擇站點進(jìn)行取樣(圖1)。根據(jù)底拖網(wǎng)所獲蝦的種類和生物量，每個采樣站點隨機(jī)取樣4～6尾。取樣時，將樣本個體的頭胸甲剖開涂抹于FTA?卡片上，自然晾干后保存于–20℃冰箱，以備后續(xù)檢測。調(diào)查網(wǎng)具參數(shù)見單秀娟等(2011)，拖速為3.0～3.5 nmile/h，拖網(wǎng)時間0.5～1 h。記錄各站點捕獲蝦的種類和數(shù)量，將不同種蝦分別標(biāo)準(zhǔn)化為每小時的數(shù)量(個/h)作為其種群生物量(陳云龍等, 2013)。

圖1 2016—2018年黃海和東海北部設(shè)置的采樣站點Fig.1Sampling sites in the Yellow Sea and the northern East China Sea from 2016 to 2018

1.2 蝦類樣品中WSSV 的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP)檢測

按照馬芳等(2016)報道的方法，使用WSSV現(xiàn)場快速高靈敏檢測試劑盒對涂抹于 FTA?卡片上的樣品進(jìn)行LAMP檢測。為避免檢測過程中出現(xiàn)假陽性和假陰性，采用 2套不同引物制作的WSSV現(xiàn)場快速高靈敏檢測試劑盒對同一樣品進(jìn)行重復(fù)檢測和復(fù)核。

1.3 海洋環(huán)境數(shù)據(jù)

各航次站點的底層溫度、底層鹽度、深度數(shù)據(jù)通過SBE25plus自容式CTD (SeaBird公司，美國)進(jìn)行現(xiàn)場采集。底質(zhì)類型(BST)參考石學(xué)法(2014)報道的方法進(jìn)行分類，并考慮到各底質(zhì)類型的站點數(shù)量，所有調(diào)查站點被概括為 4種類型：砂質(zhì)(包括砂、砂質(zhì)粉砂和中砂)、粉砂質(zhì)砂、粉砂(包括粉砂和粉砂質(zhì)黏土)和黏土質(zhì)砂(包括黏土質(zhì)粉砂和黏土質(zhì)砂)。

1.4 模型的構(gòu)建

1.4.1 模型的假設(shè) 以 WSSV 陽性蝦類總生物量作為模型的響應(yīng)因子；考慮到蝦類總生物量數(shù)據(jù)呈正偏態(tài)分布(官文江,2015)，以蝦類總生物量的對數(shù)(ln_Abu)作為響應(yīng)變量。選取 WSSV陽性檢出率(P_rate)作為模型的解釋變量，并假設(shè) WSSV陽性蝦類被WSSV感染的概率一致，即蝦類總陽性樣品數(shù)量=陽性檢出率×蝦類總生物量，并將陽性樣品量進(jìn)行對數(shù)處理，得到的陽性樣品量的對數(shù)(ln_posi)作為模型的解釋變量。

1.4.2 模型影響因子的選取 除了P_rate和ln_posi以外，根據(jù)已發(fā)表的環(huán)境因子對蝦類生物量影響的研究報道(Gribble et al, 2007;黃慶洋等, 2009;逄志偉等, 2015;趙靜等, 2017)，選取水深、底層溫度、鹽度、經(jīng)緯度、底質(zhì)類型和離岸距離等相關(guān)因子作為模型的解釋變量。

1.4.3 蝦類生物量影響因子的初步評價 采用梯度隨機(jī)森林模型篩選因子，并初步評價各環(huán)境因子對蝦類資源密度分布的影響。GFM 是一種機(jī)器學(xué)習(xí)方法，建立在隨機(jī)森林的基礎(chǔ)上，通過整合各響應(yīng)變量上的單個隨機(jī)森林分析來捕獲潛在相關(guān)預(yù)測因子和多個響應(yīng)變量之間的復(fù)雜關(guān)系(Ellis et al, 2012)。從本質(zhì)上講，隨機(jī)森林是一種回歸樹，它將響應(yīng)變量按每個預(yù)測因子p的特定分割值劃分為2組，以最大化同質(zhì)性。與其他措施一起，梯度森林提供了每個響應(yīng)變量f的擬合優(yōu)度以及加權(quán)的重要性。對梯度森林進(jìn)行1000次運(yùn)行，獲得的變異度，并使用總體性能最高的模型(即擬合優(yōu)度R2最大)進(jìn)行進(jìn)一步分析。

1.4.4 利用GAMM模型評價環(huán)境因子對蝦類分布的影響 考慮到解釋能力和預(yù)測能力的潛在差異，采用廣義加性混合模型對可能影響蝦類生物量的時空分布因子、環(huán)境因子和WSSV陽性檢出率等進(jìn)行分析(Derville et al, 2018)。在建模之前，首先對數(shù)據(jù)進(jìn)行初步分析、檢驗以選擇合適的模型，主要進(jìn)行異常值的剔除以及檢查解釋變量之間的共線性。采用方差膨脹因子(VIF)度量多重共線性的程度，并對選取的初始因子進(jìn)行多重共線性檢驗，篩選可納入模型的因子(Shono, 2008)。VIF越高，多重共線性的影響越嚴(yán)重，以VIF>5作為判斷是否存在多重共線性的標(biāo)準(zhǔn)。解釋變量中底質(zhì)類型(BST)作為隨機(jī)效應(yīng)。模型的連接函數(shù)為“identity”(Kabacoff, 2015)。利用F檢驗評估解釋變量的顯著性。將不同環(huán)境因子進(jìn)行組合，生成多個候選GAMM模型。

采用赤池信息準(zhǔn)則(Akaike information criterion，AIC)和方差解釋率(devianceexplained)來比較候選模型的性能(周慧敏等, 2014)。在分析中將不顯著變量(P≥0.1)從初始模型中逐一剔除，最終得到最優(yōu)模型。主要步驟：1)剔除解釋偏差最小的不顯著變量；2)擬合簡化的 GAMM到數(shù)據(jù)；3)重復(fù)步驟 1和步驟 2，直到AIC值最小化(deLeeuw,1992;Burnham et al,2003)。數(shù)據(jù)分析和模型構(gòu)建的過程中分別使用 R軟件中的“car”，“gradient Forest”和“mgcv”進(jìn)行(R Core Team, 2017)。

2 結(jié)果

2.1 WSSV 在黃海與東海北部蝦類中的流行情況

在2016、2017和2018年8月對黃海和東海北部的調(diào)查中，從73個采樣點共采集517份蝦類樣品(圖 2，表 1)。LAMP檢測結(jié)果顯示，2016、2017和2018年所涉及的25、31和46個采樣站點中，WSSV陽性采樣站點的比例分別達(dá)48.40%、38.75%和21.74% (圖2、圖3)，且3個年度樣品中WSSV陽性檢出率分別為16.86%、9.60%和4.80%(圖3)；上述3個年度所采集樣品包括 26種蝦類，其中，脊腹褐蝦(Crangon affinis)、葛氏長臂蝦(Palaemon gravieri)，哈氏仿對蝦(Parapenaeopsis harbwickii)、日本囊對蝦(Penaeus japonicus)、戴氏赤蝦(Metapenaeopsis dale)、中國毛蝦(Aceteschinensis)和海蜇蝦(Latreutes anoplonyx)等11種蝦類樣品中均有WSSV陽性檢出，除樣品量較少(少于10尾)的滑脊等腕蝦(Heterocarpoides laevicarina)、細(xì)螯蝦(Leptochela gracilis stimpson)和刀額仿對蝦(P.acultrirostris)外，中華安樂蝦(Eualus siensis)、海蜇蝦、葛氏長臂蝦和脊腹褐蝦中WSSV陽性檢出率皆在10%以上(表1)。

表1 2016—2018年在黃海和東海北部采集的不同蝦類樣品數(shù)量及樣品中WSSV的陽性檢出率Tab.1Number and WSSV positive rates in different shrimps collected from Yellow Sea and the northern East China Sea (2016—2018)

圖2 2016—2018年黃海和東海北部蝦類中WSSV的流行范圍和流行率Fig.2The prevalence scopes and prevalence rates of WSSV in the shrimps of the Yellow Sea and the northern East China Sea (2016—2018)

圖3 2016—2018年黃海和東海北部WSSV陽性采樣站點檢出率和陽性樣品檢出率Fig.3WSSV positive rate in the sampling sites and the collected samples of the Yellow Sea and the northern East China Sea (2016—2018)

2.2 GFM模型的結(jié)果分析

利用GFM模型對蝦類生物量相關(guān)影響因子的初步評價結(jié)果顯示，ln_posi(陽性樣品數(shù)的對數(shù))重要性最高，其次是溫度(Temp)、離岸距離(Distance)、緯度(Lat)、經(jīng)度(Long)、陽性率(P_rate)、鹽度(Sal)和底質(zhì)類型(BST)(圖 4)。

圖4 不同解釋變量在GFM模型中的重要性分析Fig.4Importance analysis of different predictor variables from the gradient forest

2.3 GAMM模型的結(jié)果分析

通過 VIF對初始影響因子進(jìn)行多重共線性檢驗，發(fā)現(xiàn)初始影響因子之間存在共線性現(xiàn)象。將P_number和深度2個因子排除后，各因子的VIF值均小于5。因此，選取 ln_posi、Temp、Distance、Lat、Long、P_rate、Sal、BST_No作為構(gòu)建GAMM 模型的備選影響因子(表2)。根據(jù)AIC最小原則，通過逐步剔除非重要因子，得到最優(yōu)模型為Model 6：ln_Abu～P_rate+ln_posi+Long。P_rate和ln_posi是Model 6中的極顯著相關(guān)因子(P<0.001)。ln_Abu隨著P_rate的升高而降低，而ln_posi也會隨著ln_Abu的升高而升高(圖5)。

圖5 最優(yōu)模型中顯著因子與蝦類生物量對數(shù)(ln_Abu)的關(guān)系Fig.5The relationship between significant variables and abundance of shrimps for the final generalized additive mixed models

表2 備選GAMM模型的擬合效果Tab.2Fitting effect of candidate GAMMs

3 討論

WSSV可引起養(yǎng)殖對蝦白斑綜合征，該病毒在1992年首次發(fā)現(xiàn)于我國臺灣(Chouet al, 1995)，此后迅速蔓延到日本、韓國、東南亞各國以及南北美洲、歐洲等地，給全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失(Nakanoet al,1994; Inouyeet al,1994; Momoyamaet al,1994; Takahashiet al,1994; Wanget al,1995;Lightner,1999)。研究發(fā)現(xiàn)，在墨西哥、菲律賓和伊朗等國近岸海域捕獲的野生蝦類中存在WSSV感染(Chapmanet al, 2004; Mijangos-Alquisireset al, 2006;Oroscoet al, 2017; Gholamhosseiniet al, 2020)，但WSSV是否也在遠(yuǎn)離陸地海域的蝦類中流行尚未見報道。本研究對黃海和東海北部海域蝦類中WSSV流行情況的調(diào)查結(jié)果顯示，WSSV在我國上述海域的流行范圍比較廣、流行率也較高；特別是2016年，WSSV陽性采樣站點和陽性樣品的比率分別高達(dá)48.395%和16.86%，其中，樣品陽性率高于同年我國養(yǎng)殖對蝦中WSSV的陽性檢出率(12.9%)(農(nóng)業(yè)部漁業(yè)漁政管理局等,2017)。在采集到的26種蝦類中，除已證實可被WSSV感染的日本囊對蝦和中國毛蝦(雷質(zhì)文等,2003)外，還有9種蝦類樣品中有WSSV陽性檢出，這提示W(wǎng)SSV經(jīng)由上述蝦類傳播擴(kuò)散的風(fēng)險不容忽視。2016、2017和2018年黃海和東海北部WSSV的陽性樣品檢出率和陽性站點檢出率均呈不斷下降的趨勢，推測可能與漁業(yè)主管部門和對蝦養(yǎng)殖從業(yè)者加大了苗種檢疫力度，海洋環(huán)境監(jiān)測部門加強(qiáng)了養(yǎng)殖廢水排放監(jiān)管，進(jìn)而降低了WSSV由近岸養(yǎng)殖池塘向近海傳播有關(guān)。

本研究引入梯度隨機(jī)森林模型(GFM)和廣義加性混合模型(GAMM)評估了WSSV對調(diào)查海域蝦類生物量的潛在影響。對GFM模型中各解釋變量的分析顯示，ln_posi (WSSV陽性樣品數(shù)的對數(shù))對響應(yīng)變量蝦類生物量的對數(shù)(ln_Abu)的重要性最高。根據(jù)AIC最小原則篩選出的GAMM 最優(yōu)模型顯示，ln_posi和 P_rate是蝦類生物量的極顯著影響因子，并且蝦類生物量隨WSSV陽性率的增高而下降。上述 GFM和 GAMM模型的分析結(jié)果均表明，WSSV流行對黃海和東海蝦類生物量存在潛在影響，野生蝦類感染W(wǎng)SSV后，可能會導(dǎo)致其生物量減少。黃東海是我國重要的漁業(yè)水域，甲殼類資源豐富，許多蝦類除了是重要的捕撈對象外，更是諸多頭足類、魚類和哺乳類等動物的主要捕食對象(韋晟等,1992;程濟(jì)生等, 1997)。如WSSV陽性檢出率較高的脊腹褐蝦，為黃東海的優(yōu)勢種類，是眾多底層和近底層魚類的主要餌料生物(唐啟升,2006)，其資源變動將會進(jìn)一步影響主要經(jīng)濟(jì)魚類的生物量和近海生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定。

限于目前尚無WSSV對野生蝦類致病性的相關(guān)數(shù)據(jù)，本研究為便于模型分析，假設(shè)WSSV對呈現(xiàn)WSSV陽性蝦類的感染和危害風(fēng)險相同，這一假設(shè)可能與實際情況存在偏差：有些蝦類對WSSV較為敏感，染病個體會出現(xiàn)病理變化甚至?xí)劳?，而有些陽性檢出的種類或僅是WSSV的載體，并不一定會發(fā)病或死亡，僅在WSSV的水平傳播中起重要作用(Rajendran et al,1999)。因此，將來可通過進(jìn)一步研究WSSV對近海蝦類致病性及其在群體中的傳播方式，為模型分析提供更多參數(shù)，以便提出更加合理的假設(shè)，進(jìn)而提高模型的評估準(zhǔn)確性和預(yù)測能力。

本研究的流行病學(xué)調(diào)查表明，黃海和東海北部蝦類優(yōu)勢種——脊腹褐蝦、葛氏長臂蝦和日本囊對蝦等基本都攜帶了WSSV或被WSSV感染。為探討病毒傳播對近海蝦類生物量的影響，本研究把WSSV LAMP檢測呈陽性的蝦類總生物量作為模型響應(yīng)因子，這有別于傳統(tǒng)的物種分布模型。傳統(tǒng)的物種分布模型一般評估海域溫度、鹽度和深度等環(huán)境因子對單一種群時空分布的影響，個別環(huán)境因子對種群分布的影響往往較大。而本研究模型的被解釋變量是蝦類生物量，包含蝦的種類較多，其環(huán)境適應(yīng)性更廣，對單一蝦類存在影響的環(huán)境因子對蝦類生物量的解釋率不會被高估，這在客觀上更有利于分析WSSV傳播流行對蝦類生物量的影響。

從總體上看，觀測數(shù)據(jù)積累和基礎(chǔ)研究成果可為模型模擬或預(yù)測提供更多或更適合的因子與參數(shù)，并有利于提高響應(yīng)變量對解釋變量的響應(yīng)能力和預(yù)測能力。此外，構(gòu)建模型時關(guān)注諸如殘差異質(zhì)性、空間自相關(guān)、因子間交互作用等因素可有助于提高模型的預(yù)測能力。本研究僅是運(yùn)用統(tǒng)計模型探索水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病毒影響近海野生群體資源動態(tài)的初步嘗試，待完成更長時間、更大空間尺度上的調(diào)查數(shù)據(jù)積累，獲得養(yǎng)殖蝦類病毒對野生蝦類致病特性等信息，并進(jìn)一步優(yōu)化模型因子后，將會更準(zhǔn)確地解釋和預(yù)測養(yǎng)殖動物病原傳播對近海生物種群、生態(tài)系統(tǒng)影響的規(guī)律和趨勢。

致謝：中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所“北斗號”漁業(yè)科考船上科研人員與工作人員在本研究的調(diào)查和樣品采集過程中給予了大力幫助，謹(jǐn)致謝忱！