高 威 戴 琴 張 攀 宋崇陽(yáng) 朱杉杉 賴曉芳 ,2,3 高 煥 ,2,3 閻斌倫 ,2,3①

(1. 江蘇省海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇海洋大學(xué)江蘇 連云港 222005；2. 江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心 江蘇 連云港 222005；3. 江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái) 江蘇 南京 210014)

泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway, UPP)是廣泛存在于真核生物中的一種高效的蛋白質(zhì)降解途徑，單個(gè)或者多個(gè)泛素分子通過(guò)一系列酶的作用結(jié)合到底物蛋白上，被標(biāo)記的蛋白可被特異性地識(shí)別并被降解(于佳瑞等, 2019)。然而這一過(guò)程并不是不可逆的，去泛素化的存在使得泛素化這一修飾過(guò)程可以保持在一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)，去泛素化酶(deubiquitinating enzymes, DUBs)可將已經(jīng)泛素化的蛋白上的泛素移除，防止底物蛋白的降解(賈雪冰等,2020)。UCH 家族(ubiquitin carboxy termina hydrolases,UCH)的結(jié)構(gòu)在去泛素化酶家族中是最先被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道的，UCH家族屬于半胱氨酸蛋白酶，大多是小分子蛋白，通常作用于一些小分子的蛋白底物，通過(guò)裂解C末端76位的甘氨酸，將泛素單體釋放出來(lái)(陳雨晗等, 2014)。研究表明，UCH家族與生殖調(diào)控有著密切的關(guān)系，Mochida等(2002)研究發(fā)現(xiàn)，UCH的mRNA在羅非魚(Oreochromsmossambcus)的腦和卵巢中表達(dá)，并且通過(guò)免疫組織化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，UCH定位在羅非魚卵巢的卵黃發(fā)生前期的卵母細(xì)胞中，推測(cè)其對(duì)卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)有重要作用。

Han等(2018)研究發(fā)現(xiàn)，UCHL3和UCHL5在擬穴青蟹(Scylla paramamosain)卵巢中的表達(dá)水平顯著高于其他組織，表明其在擬穴青蟹的性腺發(fā)育中起著重要的作用。孫兆貴等(2003)研究發(fā)現(xiàn)，中華大蟾蜍(Bufogargarizans)泛素羧基末端水解酶(tUCH)對(duì)卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中卵泡的破裂起到調(diào)控作用。

脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)具有繁殖周期短、生長(zhǎng)速度快、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是我國(guó)特有的經(jīng)濟(jì)蝦類之一(王盼等, 2021)。王緒峨(1987)初步研究了脊尾白蝦的性腺發(fā)育、生殖蛻皮、交尾、產(chǎn)卵等生理活動(dòng)。栗治國(guó)等(2014)利用石蠟切片和 HE染色技術(shù)對(duì)脊尾白蝦的精巢和卵巢進(jìn)行組織結(jié)構(gòu)觀察，將脊尾白蝦卵巢發(fā)育分為增殖期(Ⅰ)、小生長(zhǎng)期(Ⅱ)、大生長(zhǎng)期(Ⅲ)、成熟期(Ⅳ)和產(chǎn)后恢復(fù)期(Ⅴ) 5個(gè)時(shí)期。除細(xì)胞水平的研究外，對(duì)性腺發(fā)育的研究也深入到了分子水平，許多與脊尾白蝦卵巢發(fā)育相關(guān)的功能基因也被相繼報(bào)道(李志敏等, 2016; 馬驪等, 2018; Liang et al, 2020)。但關(guān)于UCHL5基因在脊尾白蝦卵巢發(fā)育中的功能研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬克隆脊尾白蝦UCHL5全長(zhǎng)cDNA序列，并分析其在不同組織和卵巢發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)情況，構(gòu)建UCHL5原核表達(dá)載體并誘導(dǎo)表達(dá)，為在分子水平上闡明脊尾白蝦的卵巢發(fā)育機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用脊尾白蝦是由實(shí)驗(yàn)室自繁而來(lái)的同一個(gè)家系中的個(gè)體。選取身體健康、大小一致[體長(zhǎng)為(5.90±0.30) cm，體重為(1.65±0.12) g]的脊尾白蝦，取眼柄、鰓、心臟、肝胰腺、卵巢、胃、腸、腹索神經(jīng)和肌肉9個(gè)組織(每個(gè)組織樣品均由 3只蝦混合而成)，加入Trizol后于-80℃保存。參照栗治國(guó)等(2014)對(duì)脊尾白蝦卵巢分期的方法，根據(jù)卵巢的形狀、顏色，取不同卵巢發(fā)育時(shí)期的脊尾白蝦卵巢組織，以相同的方法保存。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

1.2.1 總 RNA 的提取 采用 UNIQ-10柱式 Trizol總RNA提取試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]分別提取上述組織RNA，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，Gene Quantity Pro測(cè)定 RNA的純度及濃度，合格的RNA樣品于-80℃?zhèn)溆帽４妗?/p>

1.2.2 cDNA 第一鏈的合成 使用 SMARTer RACE 5′/3′試劑盒(TaKaRa)，以脊尾白蝦9個(gè)組織混合RNA為模板分別合成 5′和 3′ RACE-ready cDNA，用于基因片段的克隆。使用 Primer ScriptTMRT Master Mix試劑盒(TaKaRa)將脊尾白蝦9個(gè)組織和不同時(shí)期的卵巢RNA分別反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于不同組織及卵巢不同時(shí)期基因表達(dá)情況的檢測(cè)。

1.3 引物合成

實(shí)驗(yàn)所用引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，序列見(jiàn)表1。

1.4 脊尾白蝦UCHL5基因的克隆

1.4.1 脊尾白蝦UCHL5基因cDNA核心片段的克隆

根據(jù)脊尾白蝦轉(zhuǎn)錄組序列，設(shè)計(jì)UCHL5基因核心序列引物(表1)，PCR擴(kuò)增得到UCHL5基因核心片段，回收純化產(chǎn)物經(jīng)克隆轉(zhuǎn)化送至生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序。

1.4.2 脊尾白蝦 UCHL5 基因 cDNA 5′和 3′的快速擴(kuò)增 根據(jù)獲得的核心片段設(shè)計(jì)特異性引物UCHL5-GSP-194、UCHL5-GSP-593用于5′端的快速擴(kuò)增，UCHL5-GSP-569、UCHL5-GSP-809用于 3′端的快速擴(kuò)增(表 1)。按 SMARTer RACE 5′/3′試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行PCR反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化和克隆測(cè)序后，使用DNAMAN 8對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，得到完整的cDNA序列。

表1 引物序列Tab.1 Primers sequence

1.5 脊尾白蝦UCHL5基因的生物信息學(xué)分析

使用 NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)對(duì) UCHL5基因的cDNA序列及氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)；利用ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析 UCHL5基因的開(kāi)放閱讀框及其編碼的氨基酸序列；利用DNA star進(jìn)行理論等電點(diǎn)和分子量的計(jì)算；利用GeneDoc進(jìn)行氨基酸序列的多重比對(duì)；利用MEGA 6.0進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。

1.6 脊尾白蝦UCHL5基因表達(dá)特征分析

根據(jù)獲得的UCHL5基因cDNA序列設(shè)計(jì)熒光定量引物，以脊尾白蝦18S rRNA為內(nèi)參基因(表1)進(jìn)行組織表達(dá)特征分析(孫金秋等, 2020)。根據(jù)SYBR Premix ExTaq試劑盒(TaKaRa)說(shuō)明書，設(shè)置反應(yīng)體系和程序，使用Step One Plus儀進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，2-ΔΔCt法分析定量結(jié)果(易健明等, 2015)。

1.7 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)UCHL5的cDNA序列設(shè)計(jì)原核表達(dá)引物UCHL5-F3和 UCHL5-R3 (表 1)，在引物的 5′端分別添加EcoRⅠ和XhoⅠ的酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收后連接到pEASY-T3載體上進(jìn)行克隆轉(zhuǎn)化，挑選陽(yáng)性克隆送至公司測(cè)序。挑取測(cè)序正確的菌液抽取質(zhì)粒，然后用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切導(dǎo)入目的片段的pEASY-T3質(zhì)粒和pET32a質(zhì)粒，膠回收目的片段和載體，T4連接酶4℃過(guò)夜連接。轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和PCR鑒定，同時(shí)送至公司測(cè)序。

1.8 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞中，挑選單克隆獲得重組菌液，將重組菌液接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)3 h左右，菌液光密度(OD600 nm)達(dá)到0.4～0.6時(shí)，加入IPTG至最終濃度為1 mmol/L，30℃繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)。以pET32a空載體為陰性對(duì)照，分別于表達(dá)2、4、6和8 h時(shí)取2 mL菌液保存，離心沉淀，裂解后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，通過(guò)Western blot檢測(cè)His標(biāo)簽，驗(yàn)證重組蛋白的正確性。

1.9 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)最終各定量結(jié)果采用SPSS 18.0和Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)和最小顯著差異法(LSD)比較不同數(shù)據(jù)組間的差異，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 UCHL5基因cDNA全長(zhǎng)序列分析

如圖1所示，UCHL5基因全長(zhǎng)cDNA序列為1440 bp，其中，5′UTR 為 164 bp，3′UTR 為 286 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?90 bp，編碼329個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量為37.57 kDa，理論等電點(diǎn)為5.51，N8-Y213為泛素羧基末端水解酶家族1的保守序列。

圖1 脊尾白蝦UCHL5基因cDNA序列及氨基酸序列Fig.1 cDNA sequence and amino acid sequence of UCHL5

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

利用GeneDoc軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，結(jié)果如圖2所示，脊尾白蝦UCHL5氨基酸序列與其他物種的此氨基酸序列具有較高的同源性，其中與凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)的同源性最高，為83%。使用MEGA 6.0，采用鄰位相接法，將脊尾白蝦UCHL5與其他物種的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖3所示，進(jìn)化樹(shù)分為兩大分支，脊尾白蝦UCHL5先與凡納濱對(duì)蝦聚為一小支，再與擬穴青蟹和三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)等無(wú)脊椎動(dòng)物聚為一分支；小家鼠(Mus musculus)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、牛(Bos taurus)、原雞(Gallus gallus)、斑點(diǎn)叉尾(Ictalurus punctatus)、斑馬魚(Daniorerio)、非洲爪蟾 (Xenopus laevis)等脊椎動(dòng)物聚為一支。

圖2 脊尾白蝦UCHL5氨基酸序列的多重比對(duì)結(jié)果Fig.2 Alignment of the amino acid sequences of different UCHL5 proteins

圖3 基于UCHL5氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 NJ phylogenetic tree based on amino acid sequences of the UCHL5

2.3 UCHL5基因在脊尾白蝦不同組織的表達(dá)

以18S rRNA作為內(nèi)參基因，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)UCHL5基因在脊尾白蝦不同組織中的表達(dá)水平，結(jié)果如圖4所示，UCHL5在脊尾白蝦9個(gè)組織中都有表達(dá)，在鰓中表達(dá)最高，卵巢次之，顯著高于其他組織(P＜0.05)。

圖4 UCHL5基因在不同組織中的表達(dá)特征Fig.4 UCHL5 gene expression in different tissues

2.4 UCHL5基因在卵巢不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)

如圖5所示，在脊尾白蝦卵巢的不同發(fā)育階段，UCHL5基因的相對(duì)表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢(shì)，Ⅳ期達(dá)到最高值，Ⅴ期下降到最低水平，具有顯著性差異(P＜0.05)。

圖5 UCHL5基因在卵巢不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)Fig.5 Expression pattern of UCHL5 in different ovary developing stages

2.5 UCHL5基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建及原核表達(dá)分析

成功構(gòu)建了脊尾白蝦UCHL5原核表達(dá)重組質(zhì)粒(pET32a-UCHL5)，通過(guò)菌液PCR、測(cè)序等方法驗(yàn)證了重組質(zhì)粒的正確性。同時(shí)進(jìn)行UCHL5基因的原核表達(dá)，在1 mmol/L IPTG、30℃條件下，得到了一條位于52 kDa的蛋白條帶，符合預(yù)期的蛋白大小(圖6)。利用Western blot進(jìn)行驗(yàn)證，重組蛋白可以檢測(cè)出His標(biāo)簽，并且和預(yù)期大小相一致(圖7)。

圖6 UCHL5在大腸桿菌中的表達(dá)Fig.6 Expression of UCHL5 in Escherichia coli

圖7 重組蛋白 Western blot檢測(cè)Fig.7 Western blot detection of recombinant protein

3 討論

研究報(bào)道，UCH家族在卵母細(xì)胞的成熟中起著重要的作用，UCHL1和UCHL3的mRNA在小鼠和恒河猴(Macacamulatta)的GⅤ和 MⅡ期的卵母細(xì)胞中高度表達(dá)(Mtango et al, 2012)，在豬卵母細(xì)胞的GⅤ和MⅡ期也檢測(cè)到UCHL1的高表達(dá)(Ellederova et al,2004)，UCHL3和UCHL5在擬穴青蟹卵巢中的表達(dá)量也顯著高于其他組織(Han et al, 2018)。本研究獲得了脊尾白蝦UCHL5的全長(zhǎng)cDNA序列，與凡納濱對(duì)蝦、三疣梭子蟹和擬穴青蟹的UCHL5具有較高的同源性。熒光定量結(jié)果顯示，UCHL5在脊尾白蝦鰓和卵巢中表達(dá)水平較高，且顯著高于其他組織。鰓是脊尾白蝦的主要免疫器官之一，UCHL5可能通過(guò)對(duì)免疫相關(guān)蛋白的去泛素化以防止免疫相關(guān)蛋白被降解，從而在免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用。M a z u m d a r等(2 0 1 0)研究指出，Rpn13/UCHL5的復(fù)合體參與調(diào)節(jié)與免疫相關(guān)的一氧化氮合酶和NF-κB的降解，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。細(xì)胞分裂需要一系列細(xì)胞周期蛋白的調(diào)控，細(xì)胞周期蛋白大多都依靠UPP途徑降解，如細(xì)胞周期蛋白、細(xì)胞周期依賴激酶抑制蛋白等(周蕊等,2003)。脊尾白蝦卵巢的細(xì)胞分裂水平比其他組織要高，所以UCHL5在卵巢中有較高的表達(dá)，這與韓坤煌(2010)的研究結(jié)果相一致?？耸显r泛素結(jié)合酶E2基因表達(dá)量從卵巢發(fā)育初期到成熟期逐漸上升，產(chǎn)卵后表達(dá)量下降(石寶通等, 2018)；斑節(jié)對(duì)蝦泛素結(jié)合酶UBE2H基因表達(dá)量在卵巢不同發(fā)育時(shí)期呈先上升后下降的趨勢(shì)，在卵巢Ⅱ期表達(dá)量最高(唐蕾等,2016)；擬穴青蟹泛素Ub基因在卵巢發(fā)育Ⅴ期表達(dá)量最高，Ⅱ期表達(dá)量最低(戴燕彬等, 2012)。以上研究表明，泛素及其相關(guān)基因?qū)β殉驳陌l(fā)育起著重要的調(diào)控作用。本研究中，在脊尾白蝦卵巢不同發(fā)育時(shí)期，UCHL5表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢(shì)，在Ⅴ期急劇下降到最低水平。梁俊平(2013)研究發(fā)現(xiàn)，脊尾白蝦卵黃蛋白原(vitellogenin)基因在卵巢發(fā)育不同時(shí)期也呈先上升后下降的趨勢(shì)，說(shuō)明UCHL5對(duì)脊尾白蝦卵黃蛋白原的合成起著重要的作用。

為進(jìn)一步研究脊尾白蝦UCHL5的生物學(xué)活性和蛋白表達(dá)情況，本研究構(gòu)建了pET32a-UCHL5的重組表達(dá)質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達(dá)出大小約為52 kDa的融合蛋白。通過(guò)Western blot檢測(cè)His標(biāo)簽，得到了符合預(yù)測(cè)大小的蛋白條帶，由此可推斷，誘導(dǎo)出的蛋白為目的蛋白，為接下來(lái)的抗體制備、免疫印跡、卵巢組織免疫組化提供實(shí)驗(yàn)材料，以便進(jìn)一步研究UCHL5蛋白在脊尾白蝦卵巢發(fā)育過(guò)程中的功能與作用。