盛玄玄，張建華*，黃河，王秀葉

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)2(安徽中糧生化燃料酒精有限公司，安徽 蚌埠，233000) 3(濟(jì)南大學(xué) 生物學(xué)院，山東 濟(jì)南，250022)

燃料乙醇是備受世界各國(guó)關(guān)注的清潔能源之一。以陳化糧為原料發(fā)酵法生產(chǎn)燃料乙醇時(shí)，蒸餾廢液經(jīng)固液分離、蒸發(fā)濃縮、干燥等工序聯(lián)產(chǎn)酒糟蛋白飼料(distillers dried grains with solubles，DDGS)，有效解決了高濃度蒸餾廢液的污染難題。但DDGS生產(chǎn)過(guò)程中仍然會(huì)產(chǎn)生大量低化學(xué)需氧量(chemical oxyen demand，COD)濃度的蒸發(fā)冷凝水，直接排放會(huì)污染環(huán)境。目前，國(guó)內(nèi)多數(shù)燃料乙醇生產(chǎn)企業(yè)采用好氧生化的處理方法，將蒸發(fā)冷凝水COD降解至0.5 g/L以下后進(jìn)入城市污水管網(wǎng)，或進(jìn)一步深度處理后達(dá)標(biāo)排放。生化處理雖然解決了廢水污染問(wèn)題，但衍生了生化剩余污泥的二次污染問(wèn)題[1-2]，同時(shí)新鮮水資源浪費(fèi)嚴(yán)重。

開(kāi)發(fā)蒸發(fā)冷凝水資源化回用技術(shù)，實(shí)現(xiàn)蒸發(fā)冷凝水零排放，不僅能徹底消除蒸發(fā)冷凝水的污染問(wèn)題，同時(shí)可以節(jié)約水資源，降低生產(chǎn)成本。蒸發(fā)凝結(jié)水直接回用拌料是最簡(jiǎn)單的回用方式，但實(shí)驗(yàn)證明蒸發(fā)冷凝水回用會(huì)降低乙醇發(fā)酵速率，有研究認(rèn)為苯乙醇、糠醛是蒸發(fā)冷凝水中的主要抑制物[3-4]。

為了使蒸發(fā)冷凝水可以回用于乙醇發(fā)酵，研究者們嘗試了離子交換、樹(shù)脂吸附、反滲透以及它們兩兩組合的方法來(lái)處理蒸發(fā)冷凝水[5-7], 其中反滲透結(jié)合離子交換的處理方法，可以使蒸發(fā)冷凝水的回用率達(dá)到 87.5%[7]。但是反滲透存在膜污染、設(shè)備購(gòu)置成本高以及需要消耗大量電力等問(wèn)題。生物處理方法被廣泛應(yīng)用到燃料乙醇廢水的處理上[8]，然而蒸發(fā)冷凝水的有機(jī)物濃度低，其COD值僅為1.045 g/L，因此現(xiàn)有的生物處理方法如厭氧消化并不適合處理蒸發(fā)冷凝水。綜上因素，研究者們正在探尋蒸發(fā)冷凝水再利用的新方法。

臭氧(O3)是一種強(qiáng)氧化劑，可以高效降解水體中的有機(jī)物[9-11]，O3也會(huì)在水中自行降解[12]，沒(méi)有二次污染的問(wèn)題，且O3不需要昂貴的設(shè)備，被認(rèn)為是一種經(jīng)濟(jì)高效的有機(jī)物降解手段。ROZAS等[13]進(jìn)行的O3降解有機(jī)微污染物(organic micropollutants, OMPs)實(shí)驗(yàn)中，生長(zhǎng)了24 h的水蚤在水體被氧化1 h后固定率降至20%。這表明O3對(duì)有機(jī)廢水具有很好的解毒作用。

基于已有的研究成果，本文采用O3氧化的方法處理蒸發(fā)冷凝水，并將氧化后的蒸發(fā)冷凝水回用于乙醇發(fā)酵，檢驗(yàn)O3氧化技術(shù)在蒸發(fā)冷凝水資源化全回用中的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種及培養(yǎng)基

酵母菌種為實(shí)驗(yàn)室保藏；液體種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，酵母粉8.5，NH4Cl 1.3，MgSO4·7H2O 0.1，CaCl20.06，115 ℃滅菌15 min。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料

市售大米；蒸發(fā)冷凝水(pH 3.6～3.9，略微渾濁，淡黃色或米白色，有類似酒糟的特殊氣味，COD值為1.045 g/L左右)，蚌埠中糧生化燃料乙醇有限公司；耐高溫α-淀粉酶(酶活力100 000 U/mL，最適作用溫度95 ℃，最適作用pH 5.5)、糖化酶(酶活力100 000 U/mL，最適作用溫度60 ℃，最適作用pH 5)，無(wú)錫杰能科公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

BF-CS-310臭氧發(fā)生器，廣州百豐環(huán)?？萍加邢薰荆籊CMS-QP2010 ULTRA氣質(zhì)聯(lián)用儀，日本島津公司；戴安U-3000液相色譜儀，美國(guó)戴安公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蒸發(fā)冷凝水的氧化處理

取250 mL蒸發(fā)冷凝水于錐形瓶中，以10 g/h通入O3, 反應(yīng)溫度為25 ℃。

1.2.2 蒸發(fā)冷凝水的GC/MS分析

用濃H2SO4將蒸發(fā)冷凝水的pH調(diào)至與氧化后蒸發(fā)冷凝水相同，取樣進(jìn)行GC/MS分析。

1.2.3 苯乙醇、糠醛、有機(jī)酸檢測(cè)

苯乙醇、糠醛[14-15]、有機(jī)酸[16]的檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)。

1.2.4 乙醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

乙醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[17-18]；乙醇含量的測(cè)定采用蒸酒法，酵母數(shù)采用血球計(jì)數(shù)板法計(jì)數(shù)，酵母活性檢測(cè)參照文獻(xiàn)[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒸發(fā)冷凝水全回用對(duì)乙醇發(fā)酵的影響

分別以自來(lái)水和蒸發(fā)冷凝水作為發(fā)酵工藝用水進(jìn)行乙醇發(fā)酵，發(fā)酵30 h并定時(shí)取樣測(cè)定發(fā)酵系統(tǒng)的失重以及乙醇和甘油的產(chǎn)量。結(jié)果如表1所示，發(fā)酵系統(tǒng)的失重源自于乙醇發(fā)酵途徑產(chǎn)生的CO2的散失，單位時(shí)間內(nèi)發(fā)酵系統(tǒng)的失重可以反映酵母的發(fā)酵速率。在發(fā)酵前12～30 h，蒸發(fā)冷凝水的發(fā)酵失重均低于自來(lái)水，表明蒸發(fā)冷凝水對(duì)乙醇發(fā)酵產(chǎn)生了明顯的不利影響，降低了乙醇發(fā)酵的速率。由于乙醇的產(chǎn)生與CO2的產(chǎn)生相關(guān)聯(lián)，因此發(fā)酵失重降低時(shí)乙醇的產(chǎn)量也相應(yīng)的下降。其次，蒸發(fā)冷凝水作為工藝用水時(shí)，發(fā)酵副產(chǎn)物甘油的含量明顯高于自來(lái)水對(duì)照組。釀酒酵母產(chǎn)生甘油的行為通常被認(rèn)為是其面對(duì)環(huán)境脅迫的一種應(yīng)對(duì)機(jī)制[19]，因此進(jìn)一步說(shuō)明了蒸發(fā)冷凝水直接回用會(huì)對(duì)乙醇發(fā)酵產(chǎn)生抑制作用。

表1 蒸發(fā)冷凝水全回用對(duì)乙醇發(fā)酵的影響Table 1 Effect of the total reutilization of condensate on the ethanol fermentation

2.2 O3氧化后蒸發(fā)冷凝水的組分分析

由于蒸發(fā)冷凝水對(duì)乙醇發(fā)酵具有抑制作用，本文嘗試采用O3氧化的方法處理蒸發(fā)冷凝水以期消除其抑制性。氧化結(jié)束后首先采用GC/MS對(duì)蒸發(fā)冷凝水進(jìn)行組分分析,如表2所示。

表2 O3氧化后蒸發(fā)冷凝水的GC/MS組分分析Table 2 Analysis of the condensate treated by O3 oxidation using GC/MS

由表2可以看出，氧化150 min后的蒸發(fā)冷凝水中醇類、呋喃類以及烯烴類化合物種類明顯減少，這表明O3對(duì)蒸發(fā)冷凝水具有良好的氧化效果。氧化后蒸發(fā)冷凝水中總檢出組分降低了18.8%，推斷此現(xiàn)象為有機(jī)組分在O3作用下發(fā)生化學(xué)轉(zhuǎn)化以及更進(jìn)一步的無(wú)機(jī)化造成的。由于蒸發(fā)冷凝水組分復(fù)雜且歸一化法無(wú)法衡量各組分的實(shí)際濃度，因此單純的組分分析無(wú)法評(píng)估蒸發(fā)冷凝水的抑制性變化。所以還需進(jìn)行乙醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)觀察O3氧化后蒸發(fā)冷凝水的抑制性變化。圖1為O3氧化前后蒸發(fā)冷凝水的GC/MS總離子流圖。

a-氧化前;b-氧化后圖1 O3氧化后蒸發(fā)冷凝水GC/MS總離子流色譜圖Fig.1 TIC chromatograms of the condensate treated by O3 oxidation using GC/MS

2.3 O3氧化后的蒸發(fā)冷凝水對(duì)乙醇發(fā)酵的影響

將氧化后的蒸發(fā)冷凝水回用于乙醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，并在處于指數(shù)期的24 h時(shí)測(cè)定發(fā)酵系統(tǒng)的失重、乙醇以及甘油的產(chǎn)量。已有研究認(rèn)為蒸發(fā)冷凝水中苯乙醇、糠醛是抑制乙醇發(fā)酵的物質(zhì)[3-4]，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在O3作用下蒸發(fā)冷凝水中的苯乙醇、糠醛隨氧化時(shí)間延長(zhǎng)不斷被降解，反應(yīng)結(jié)束時(shí)苯乙醇、糠醛的降解率分別達(dá)到99.5%、100% (圖2)。由于蒸發(fā)冷凝水中以苯乙醇、糠醛為代表的有機(jī)物不斷被降解，發(fā)酵系統(tǒng)的發(fā)酵速率以及乙醇產(chǎn)量逐漸得到恢復(fù)，同時(shí)甘油的產(chǎn)量也相應(yīng)降低(表3)。實(shí)驗(yàn)中我們注意到氧化處理150 min的蒸發(fā)冷凝水顯著提高了乙醇發(fā)酵速率并將乙醇產(chǎn)量提高了8.3% (表3)，這表明O3氧化處理不僅能解除蒸發(fā)冷凝水對(duì)乙醇發(fā)酵的抑制，而且對(duì)乙醇發(fā)酵具有促進(jìn)作用。蒸發(fā)冷凝水的COD值并不高,僅有1.045 g/L，氧化結(jié)束后蒸發(fā)冷凝水的COD值僅降低了2.4%。由于O3氧化并不能將有機(jī)物完全無(wú)機(jī)化(表2，圖2)，所以推測(cè)O3氧化后蒸發(fā)冷凝水促進(jìn)乙醇發(fā)酵的現(xiàn)象是O3氧化過(guò)程中產(chǎn)生的小分子物質(zhì)作用的結(jié)果。

Ci-抑制物在i時(shí)刻的質(zhì)量濃度;C0-抑制物初始質(zhì)量濃度圖2 O3氧化過(guò)程中，蒸發(fā)冷凝水中苯乙醇、糠醛的濃度變化以及蒸發(fā)冷凝水COD值的變化Fig.2 Temporal variation of COD value and concentrations of phenylethanol, furfural in the O3 oxidation of condensate

2.4 O3氧化后的蒸發(fā)冷凝水促進(jìn)乙醇發(fā)酵原因的初步探究

羧酸會(huì)在O3氧化有機(jī)物的過(guò)程中累積[12, 20]，通過(guò)對(duì)氧化后蒸發(fā)冷凝水中有機(jī)酸的監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)氧化后蒸發(fā)冷凝水中乙酸、丙酸的含量明顯增加。反應(yīng)結(jié)束后乙酸、丙酸含量分別升高16.3%、22.4%(圖3)。YANG等[17]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙酸質(zhì)量濃度低于1.5 g/L時(shí)，乙酸最高可以增加3%的乙醇產(chǎn)量，ZHANG等[18]發(fā)現(xiàn)在丙酸質(zhì)量濃度低于2.2 g/L時(shí)，丙酸最高可以增加7.6%的乙醇產(chǎn)量，所以推斷乙酸、丙酸是氧化后蒸發(fā)冷凝水中促進(jìn)乙醇發(fā)酵的物質(zhì)。PAMPULHA等[21]研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的羧酸可以提高酵母的底物消耗速率，并降低菌體的得率系數(shù)，所以隨著O3氧化的進(jìn)行，由于乙酸、丙酸的積累發(fā)酵系統(tǒng)的酵母數(shù)出現(xiàn)了降低的現(xiàn)象(表4)，但是氧化后的蒸發(fā)冷凝水對(duì)乙醇發(fā)酵卻起到了促進(jìn)的作用(表3)，也說(shuō)明酵母的數(shù)量與乙醇發(fā)酵的好壞并沒(méi)有直接的關(guān)系。

圖3 O3氧化過(guò)程中蒸發(fā)冷凝水中有機(jī)酸的生成Fig.3 Profile of organic acids concentrations in the condensate during O3 oxidation

表3 O3氧化蒸發(fā)冷凝水回用乙醇發(fā)酵結(jié)果分析Table 3 Parameters of ethanol fermentation using condensate treated by O3 oxidation

為了進(jìn)一步探究氧化后蒸發(fā)冷凝水促進(jìn)乙醇發(fā)酵的機(jī)理，實(shí)驗(yàn)中對(duì)酵母活性進(jìn)行了鑒定。我們知道高活性酵母細(xì)胞處于旺盛生長(zhǎng)狀態(tài)，而低活性酵母細(xì)胞則處于衰老、休眠的狀態(tài)。在乙醇發(fā)酵過(guò)程中酵母主要是在指數(shù)生長(zhǎng)期快速轉(zhuǎn)化還原糖并產(chǎn)生乙醇，這一階段高活性酵母細(xì)胞比例最高，因此為了進(jìn)一步觀察O3氧化后的蒸發(fā)冷凝水對(duì)酵母細(xì)胞的影響，實(shí)驗(yàn)采用美藍(lán)染色法來(lái)統(tǒng)計(jì)高活性酵母細(xì)胞的比例，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出O3氧化150 min的蒸發(fā)冷凝水可以將指數(shù)生長(zhǎng)期的高活性酵母細(xì)胞比例提高至95%，高于對(duì)照組的90%(表4)。

表4 O3氧化后蒸發(fā)冷凝水對(duì)酵母數(shù)以及酵母活性的影響Table 4 Effect of the condensate treated by O3 oxidation on yeast number and yeast activity

所以經(jīng)過(guò)O3氧化的蒸發(fā)冷凝水中累積的乙酸、丙酸是O3氧化后的蒸發(fā)冷凝水促進(jìn)乙醇發(fā)酵的誘因，即乙酸、丙酸的存在增強(qiáng)了乙醇發(fā)酵過(guò)程中酵母的活性，提高了還原糖的轉(zhuǎn)化效率進(jìn)而對(duì)乙醇發(fā)酵產(chǎn)生了促進(jìn)作用。

值得注意的是當(dāng)對(duì)照組酵母細(xì)胞進(jìn)入到衰退期后，蒸發(fā)冷凝水組高活性酵母細(xì)胞的比例出現(xiàn)了升高的現(xiàn)象(表4)，結(jié)合表1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出結(jié)論，蒸發(fā)冷凝水對(duì)乙醇發(fā)酵的抑制作用主要表現(xiàn)為降低了酵母細(xì)胞的活性進(jìn)而延長(zhǎng)了乙醇發(fā)酵周期，當(dāng)然這種低效的生產(chǎn)方式是不能被工廠所采用的。

3 結(jié)論與討論

蒸發(fā)冷凝水直接回用會(huì)抑制乙醇發(fā)酵導(dǎo)致發(fā)酵速率降低，O3可以高效降解蒸發(fā)冷凝水中的抑制物苯乙醇、糠醛，進(jìn)而減輕蒸發(fā)冷凝水對(duì)乙醇發(fā)酵的抑制性。蒸發(fā)冷凝水經(jīng)O3氧化后產(chǎn)生的乙酸、丙酸等有機(jī)酸可以提高高活性酵母細(xì)胞的比例，同時(shí)降低細(xì)胞密度，高活性的酵母細(xì)胞提高了乙醇的發(fā)酵速率進(jìn)而提高了乙醇的產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)證明采用O3氧化的方法可以實(shí)現(xiàn)蒸發(fā)冷凝水的全部回用。