劉麗莉，王浩陽，郝威銘，蘇克楠，盧玉婷

(1.河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2.食品加工與安全國家級教學示范中心，河南 洛陽 471023；3.河南省食品加工與質量安全控制國際聯合實驗室，河南 洛陽 471023)

0 引言

蛋清粉作為鮮蛋的替代品，兼?zhèn)漉r蛋的營養(yǎng)功能，又能解決鮮蛋不易保存、不易運輸的難題，被廣泛應用于食品等多種行業(yè)。干燥方式是影響蛋清粉功能特性的重要因素之一。目前，常見的干燥方式有熱風干燥、噴霧干燥(spray drying，SD)等方法。而噴霧冷凍干燥(spray freeze drying，SFD)在低溫下進行，解決了噴霧干燥溫度過高的缺點，對蛋白質產品破壞較少，且產品具有良好的穩(wěn)定性和復水性[1]。因此，對噴霧冷凍干燥后的蛋白結構變化進行研究，對蛋白互作后的品質控制意義重大。

目前，已有不少學者對蛋粉進行了研究。文獻[2]以雞蛋粉為研究對象，采用真空冷凍與噴霧對其進行干燥，研究了不同干燥條件下其功能特性的變化，研究結果表明:不同干燥條件制備的雞蛋粉顆粒形狀存在明顯不同，且真空冷凍干燥(freeze dried,FD)條件下制備的雞蛋粉品質更優(yōu)。文獻[3]以蛋清粉為研究對象，用不同的干燥溫度對蛋清蛋白進行噴霧干燥，研究結果表明:當溫度為160 ℃時，可以促使蛋白質分子發(fā)生斷裂，發(fā)生一定程度的聚集，表觀黏度下降，可更好地改善其流變特性，從而拓展其在食品等領域的應用。文獻[4]研究了蛋清粉凝膠結構的表征及其與干熱預處理影響凝膠性能的關系，研究結果表明:通過干熱預處理蛋清粉，蛋清粉凝膠的強度、透明度和保水能力提高。文獻[5]研究了不同的干熱時間對蛋清粉水流動性及其凝膠之間的分子間相互作用的影響，隨著干加熱時間的增加，凝膠硬度和持水量顯著增加(P<0.05),并且兩個參數都與凝膠透明度呈正相關。

本團隊已比較分析了不同干燥方法[6]對蛋清的干燥、二級結構和功能性質的影響，以及蛋清蛋白噴霧干燥工藝優(yōu)化[7]。但對于復雜的雞蛋蛋白質而言，不同蛋白之間如何發(fā)生相互作用，以及這些作用對結構功能特性的影響報道較少。因此，本文以噴霧干燥和真空冷凍干燥為對照，系統研究了噴霧冷凍干燥對卵白蛋白(ovalbumin，OVA)和卵黏蛋白(ovomucin，OVM)相互作用的結構和功能特性的影響，可為蛋清粉的精深加工提供參考。

1 材料與設備

1.1 材料與試劑

新鮮雞蛋，河南洛陽大商新瑪特超市；溴化鉀(分析純)，天津市光復經濟化工研究所；卵白蛋白(分析純)，上海生物工程有限公司；卵黏蛋白(分析純)，上海生物工程有限公司；大豆油(市售)，河南洛陽大商新瑪特超市；溴酚藍(分析純)，上海一研生物有限公司；二硫硝基苯(分析純)，Sigma-Aldrich公司；Tris-HCl(分析純)，蘇州亞科科技有限公司。

1.2 儀器與設備

MQC型核磁共振儀，英國Oxford Instruments 公司；VERTEX70型傅里葉紅外光譜儀，德國 Bruker 公司；VERTEX70型熒光光度計，美國Aglient公司；Q10型差示掃描量熱儀，美國TA公司；S-4800型掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)，日本Hitachi公司；8420型臺式離心機，日本 KUBTY公司；692型pH計，美國JENCO 公司；AR214型電子天平，美國Mettler Toledo公司；DHR-1型流變儀，美國TA 公司。

2 試驗方法

2.1 蛋白粉的制備

將卵白蛋白(OVA)和卵黏蛋白(OVM)按照雞蛋中的比例混合，配制質量濃度為0.1 mg/mL的蛋白質溶液，試驗過程中所用到的水均為蒸餾水。將上述配置好的溶液分別進行噴霧干燥、真空冷凍干燥和噴霧冷凍干燥，得到蛋白粉，備用。

2.2 SFD對OVA和OVM互作后結構的影響

低場核磁共振(low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR)測定。參考文獻[8]的方法，對OVA和OVM互作后的蛋白粉進行LF-NMR測定。

傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR)測定。參考文獻[9]的方法，對OVA和OVM互作后的蛋白粉進行FT-IR測定。

熒光光譜(fluorescence spectroscopy，FS)測定。參照文獻[10]的方法對OVA和OVM互作后的蛋白粉進行FS測定。將樣品溶于Tris-HCl(pH7.4)緩沖液，配成0.5 mg/mL的蛋白溶液，掃描繪制光譜圖。

差式掃描量熱(differential scanning calorimetry，DSC)測定。參考文獻[11]中的DSC法，對蛋白的熱變性進行測定。取6～8 mg樣品，以空坩鍋作為對照，10 ℃/min的速率，將氮氣的流速設置為20 mL/min，溫度設置為20～150 ℃，掃描得出曲線。

掃描電鏡測定。根據文獻[12]的試驗方法，對OVA和OVM互作后的蛋白粉進行SEM測定，用來分析干燥后的微觀結構變化。在濺射電壓1.1～1.2 kV下，選擇有代表性的區(qū)域進行觀察拍攝。

2.3 SFD對OVA和OVM互作后功能特性的影響

乳化性的測定。參照文獻[13]的方法，分別測定不同干燥方式制備的蛋白粉的乳化性。

溶解性的測定。采用文獻[14]的方法，將在不同干燥方式下制備的蛋白粉溶于去離子水中，制成質量濃度為1 mg/mL的溶液(pH7)，并在室溫環(huán)境下，通過磁力攪拌30 min,以1 000 r/min的速度離心20 min。取上清液并測定溶解性。

起泡性和泡沫穩(wěn)定性的測定。采用文獻[15]的方法，把制得的樣品溶于蒸餾水，蛋白粉質量分數為12.2%，然后攪拌，時間為1 h，制得樣品溶液。取150 g樣品溶液，加入混合器攪拌器中攪拌，攪拌速率為10，時間為5 min，測量溶液和泡沫的溢出量。

流變特性的測定。將不同干燥方式制得的蛋白粉配制成蛋清液，將蛋清液均勻涂抹于流變儀上(間隙為1 050 μm)進行掃描，研究不同冷風風量對蛋清蛋白溶液表觀黏度(ηa)的影響。在25 ℃下，將動態(tài)頻率掃描參數設置為1%，頻率變化設置為0.1～300 rad/s，測定蛋清儲能模量G′和損耗模量G″隨頻率的變化規(guī)律。

2.4 數據處理

利用Origin 8.5軟件進行數據分析；DPS 7.05軟件進行方差分析(顯著水平P<0.05)；每組試驗平行進行3次。

3 結果與分析

3.1 SFD對OVA和OVM互作后結構的影響

3.1.1 LF-NMR分析

不同干燥方式下OVA和OVM互作蛋白均有3個峰，這3個峰則代表著樣品中水分的不同存在狀態(tài)，當弛豫時間為0.01～5 ms時，表示結合水的信號強度；當弛豫時間為5～20 ms時，表示吸附水的信號強度；當弛豫時間為20～1 000 ms時，表示自由水的信號強度[16]。圖1為不同干燥方式對OVA和OVM互作的橫向弛豫時間瀑布圖。由圖1可知：與SD處理的樣品相比，FD和SFD處理的樣品信號幅值提高，兩者信號強度差距不大，說明干燥方式使蛋白互作過程中水合作用加強，蛋白與水的結合更加緊密。同時，經過SFD處理的樣品自由水減少[17]，表明OVA和OVM相互作用后的蛋白結構在干燥過程中結合水的數量加大，保水性更高。

圖1 不同干燥方式對OVA和OVM互作的 橫向弛豫時間瀑布圖

表1為不同干燥方式對蛋白弛豫時間T2變化的影響。由表1可知：SFD條件下的互作蛋白結合水(T21)和吸附水(T22)峰比例高于SD和FD，這可能是因為低溫條件下能更好地保持蛋白的特性，導致互作后蛋白質的水結合位點能更好地結合水分子，而噴霧干燥條件下蛋白受到高溫的影響，水結合位點的蛋白質變性[18]，導致結合水降低。SFD條件下的互作蛋白自由水(T23)峰比例小于SD條件，這表明水分受熱蒸發(fā)和干燥介質導致水分遷移。這與文獻[19]研究結果相一致。此外，SFD條件下的互作蛋白T2峰面積總和大于SD和FD條件，證明SFD能更好地保持蛋白互作后的保水性。

表1 不同干燥方式對蛋白弛豫時間T2變化的影響

3.1.2 FT-IR分析

圖2 不同干燥方式對OVA和OVM互作的FT-IR譜圖

通過Peakfit Version 4.2分別對圖2中1 600～1 700 cm-1處的不同干燥方式制得的3種蛋白樣品的峰譜圖進行去卷積、二階求導和高斯擬合處理[22]，得到表2。由表2可知：SFD條件下蛋白β-折疊大于SD和FD，而β-轉角卻小于SD和FD，主要原因是SD條件下的OVA和OVM在高溫作用下發(fā)生了熱變性并促進分子間的聚集，β-折疊和β-轉角含量增加，且β-折疊在高溫下易變成β-轉角結構；SD和SFD兩種方式的α-螺旋結構基本相同；SFD無規(guī)卷曲大于SD和FD，說明其結構的隨機性增強。

表2 OVA和OVM不同干燥條件下的二級結構含量(紅外光譜) %

3.1.3 FS分析

蛋白質大分子具有酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)等小分子結構，這些蛋白質可以產生較強的內源性熒光。圖3為不同干燥方式對OVA和OVM互作的熒光光譜圖。從圖3可以看到：OVA和OVM互作后，在SFD條件下，波長336 nm處熒光強度最大為156.80；在SD條件下，波長339.07 nm處熒光強度最大為79.38；在FD條件下，波長336 nm處熒光強度最大為125.79。在波長340nm處熒光峰強度為SFD>FD>SD。SFD條件下蛋白的熒光強度大于FD，SD條件下熒光強度最低，且SD條件下蛋白熒光發(fā)射波長出現了輕微紅移，其二級結構再次發(fā)生改變，可能是干燥的溫度會使蛋白質熒光發(fā)生猝滅，影響OVA和OVM之間的相互作用。

圖3 不同干燥方式對OVA和OVM互作的熒光 光譜圖

3.1.4 DSC分析

表3為不同干燥方式對OVA和OVM互作的熱力學影響。由表3可知：SD、SFD和FD對OVA和OVM互作后熱變形溫度分別為100.31 ℃、48.94 ℃、46.46 ℃，熱焓值分別為161.01 J/g、15.47 J/g、17.95 J/g，SFD蛋白的峰值溫度比SD低51.37 ℃，與FD接近，熱穩(wěn)定性為：SD>SFD≈FD，其聚集程度大小順序為：SD>SFD≈FD，這可能是因為經過不同的干燥方法處理后，兩種蛋白之間的結構斷裂，非共價鍵數目不同[23]，導致其熱穩(wěn)定性發(fā)生變化，干燥溫度使蛋白的氫鍵結構發(fā)生變化，導致其熱焓值發(fā)生變化。

表3 不同干燥方式對OVA和OVM互作的熱力學影響

3.1.5 SEM分析

圖4為不同干燥方式對OVA和OVM互作的SEM圖。由圖4可知：SD蛋白的表面出現許多孔隙，且大小不一，凹凸不平，蛋白分子排列較緊密，成條、成簇，加深了其聚集程度[24]；SFD蛋白呈現外形完整、顆粒大小較為不規(guī)則的球狀圓形外部結構，內部空間呈網絡結構；FD蛋白結構斷面不平整，多層結構，大小不一，聚集成條、成片。這是因為霧化過程中，微小的液滴被瞬間凍結，在噴霧塔飄落的過程中，其中的水分被瞬間凍干形成冰晶，并由于升華的作用被移除，同時也會使樣品產生一些微孔通道，正是因為這些結構，使比表面積增大，大大提高蛋清蛋白的起泡性[25]。

(a) SD

3.2 SFD對OVA和OVM互作后功能特性的影響

3.2.1 乳化性、溶解性、起泡性和泡沫穩(wěn)定性的變化

表4顯示了不同干燥方式對OVA和OVM互作后乳化性、溶解性、起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響。乳化性代表了蛋白乳化的程度，SFD蛋白乳化性要優(yōu)于SD，這可能是因為SD處理下溫度作用引起較高水平的蛋白質展開所致[26]。FD處理下溫度較低，對蛋白結構破壞較大，使其乳化性降低。溶解度反映沖調性能的好壞，SFD蛋白溶解度大于SD，略大于FD，這是在低溫環(huán)境下，SFD蛋白無法聚集或聚集遭到破壞，使得蛋白質與其他物質形成的復合物分散開來，這樣溶液中可溶性蛋白質的含量增加[27]。起泡性反映泡沫的發(fā)泡程度，SFD蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性大于SD，接近FD，這可能是因為SFD使蛋清蛋白變得更加分散，折疊蛋白能更好地打開，可溶性蛋白含量增加，而不溶解的蛋白質能在氣泡周圍形成厚黏性層，使泡沫不易破碎，增大泡沫的穩(wěn)定性[28]。

表4 不同干燥方式對OVA和OVM互作后乳化性、溶解性、起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響

3.2.2 靜態(tài)流變掃描分析

圖5為不同干燥方式對OVA和OVM互作表觀黏度(ηa)的影響。由圖5可知:不同干燥條件下OVA和OVM的表觀黏度均隨著剪切速率的增大而降低，當剪切速率大于110 s-1時，表觀黏度反而有輕微上升幅度。總體上，FD蛋白和SFD蛋白變化趨勢一致，SD蛋白比SFD蛋白和FD蛋白的表觀黏度大，這是因為SD處理后，溫度較高，蛋白質分子發(fā)生熱變性聚集，原來規(guī)則有序的分子結構也變得混亂無序，分子之間的摩擦阻力增大，流動阻力大，所以表觀黏度比其他兩種樣品大[29]。

圖5 不同干燥方式對OVA和OVM互作表觀 黏度的影響

3.2.3 動態(tài)頻率掃描分析

圖6為不同干燥方式下OVA和OVM互作后G′、G″隨頻率變化關系。由圖6可知：隨著角頻率逐漸上升，不同干燥方式下OVA和OVM的儲能模量G′和損耗模量G″也表現出逐步上升的趨勢，且在同頻率下G′值都高于G″值，這說明兩種干燥方式下的蛋白溶液都有凝膠狀的性質，網絡結構良好[30]。3個樣品在0～10 Hz的低頻率內，G′和G″緩慢上升，達到10 Hz后上升的趨勢變快。在頻率增大的過程中，3個樣品的G′和G″的變化基本趨向一致。在高頻區(qū)G′的穩(wěn)定性大小為SFD>FD>SD，可能是因為干燥溫度的變化，使蛋白質變成凝膠網絡結構，產生切流變行為，進一步驗證干燥方式影響蛋白質的凝膠網絡結構[31]。

4 結論

與SD和FD相比，SFD對OVA和OVM互作的蛋白結構和功能特性有很大影響。OVA和OVM互作蛋白自由水減少，結合水增加，保水性增強；二級結構發(fā)生改變，隨機性更強；在波長340 nm處熒光峰強度為SFD>FD>SD；熱穩(wěn)定性為SD>SFD≈FD；在結構上更加規(guī)則，呈顆粒較大的球狀結構，內部空間網絡結構，蛋白聚集程度小。

SFD蛋白的乳化性、溶解性和起泡性與FD蛋白接近，優(yōu)于SD蛋白，且SFD蛋白比SD蛋白的表觀黏度小，SFD蛋白儲能模量最大。考慮到FD成本過高，所以SFD更適合加工生產。通過了解OVA和OVM相互作用，可以為蛋清蛋白在干燥過程中功能特性的變化提供一定的理論基礎，未來將進一步研究蛋清中其他蛋白質的相互作用，從而為實際生產提供相應的理論及技術支撐。