張九娜 翟 山 楊 陽 郭永澤 李校天

食管鱗狀細(xì)胞癌(簡稱鱗癌)是我國常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，由于早期食管鱗癌缺乏典型的臨床癥狀，發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已進(jìn)展至中晚期，失去最佳手術(shù)時(shí)機(jī)，只能采取手術(shù)結(jié)合放射和(或)化學(xué)治療的綜合治療方案，癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是食管鱗癌治療的最大障礙[1-2]。癌細(xì)胞的遷移侵襲能力是其轉(zhuǎn)移最重要的環(huán)節(jié)。癌細(xì)胞遷移侵襲的環(huán)節(jié)包括細(xì)胞黏附減少、細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞外基質(zhì)降解，以及細(xì)胞突觸及偽足形成，其中偽足尤其是片狀偽足的形成是癌細(xì)胞遷移侵襲的關(guān)鍵[3]；皮層肌動(dòng)蛋白(cortactin, CTTN)能夠促進(jìn)片狀偽足的形成并維持其穩(wěn)定[4-5]。研究[6]發(fā)現(xiàn)，CTTN在結(jié)腸癌中通過激活表皮生長因子受體(EGFR)-細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)展，其在結(jié)腸癌中的高表達(dá)與腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。前期研究[7]發(fā)現(xiàn)，CTTN不僅在食管鱗癌中高表達(dá)，而且與腫瘤病理分期和患者不良預(yù)后顯著相關(guān)；因此推測，CTTN可能調(diào)控食管鱗癌的侵襲轉(zhuǎn)移。關(guān)于CTTN在食管鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移中的研究較少，本研究旨在探討CTTN在食管鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 人食管鱗癌細(xì)胞系EC109、TE1購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；兔抗細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM1)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2、血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)、GADPH單克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔抗MMP9、CTTN單克隆抗體、小鼠抗Src單克隆抗體購自美國Abcam公司；熒光標(biāo)記的羊抗兔二抗、羊抗小鼠二抗購自美國LI-COR公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、傳代及凍存 將EC109、TE1細(xì)胞置于含10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，于體積分?jǐn)?shù)為0.05的 CO2孵箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，以常規(guī)胰酶消化、傳代，取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。暫不用的細(xì)胞按常規(guī)流程予以凍存。

1.2.2 慢病毒的構(gòu)建 用于過表達(dá)或敲減CTTN的慢病毒載體由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建。采用LV17慢病毒載體過表達(dá)CTTN，元件為EF-1a-CMV-luci17-T2A-puromycin，插入的載體序列為5’-GGC GAA TTC TGA TGT-3’和5’-GGA AAG CCT CTG C-3’。 采用LV16 (U6/Lucifer-ase17&Puro) 慢病毒載體干擾CTTN的表達(dá)，元件為U6-CMV-/Luc17-T2A-puromycin，插入載體序列為5’-CCA TGG CT-3’和5’-ATG GAG GGA AAT T-3’。兩個(gè)載體的對(duì)照載體插入序列均為5’-TTC TCC GAA CGT GTC ACG T-3’。

1.2.3 慢病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)及穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選 根據(jù)上海吉瑪公司提供的慢病毒使用說明書，用上述載體對(duì)EC109、TE1細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。將EC109、TE1細(xì)胞分別分為4組：過表達(dá)組(即LV-CTTN組)、空白對(duì)照組(即LV-NC組)、敲減組(即LV-sh-CTTN組)和陰性對(duì)照組(即LV-sh-NC組)。經(jīng)嘌呤霉素篩選后的穩(wěn)定細(xì)胞檢測過表達(dá)和抑制效果。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢測CTTN及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白質(zhì) 常規(guī)收集細(xì)胞，裂解提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。采用12%分離膠電泳，聚二偏氟乙烯(PVDF)膜濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜， 5%脫脂奶粉封閉。根據(jù)抗體說明書用TBST緩沖液稀釋一抗： ICAM1(1∶1 000)、MMP2(1∶500)、VEGF-C(1∶1 000)、GAPDH(1∶3 000)、CTTN(1∶50 000)。熒光二抗用TBST緩沖液按1∶20 000稀釋，于室溫避光孵育1 h，最后采用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描。根據(jù)相應(yīng)分組，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)4次。

1.2.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 常規(guī)消化穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的TE1細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，洗滌2次，后將細(xì)胞重懸于含0.1%牛血清白蛋白(BSA)的無血清培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106/mL，取200 μL的細(xì)胞懸液接種于包被好的Transwell小室的上室中， 24孔板下室加入600 μL含15% FBS的培養(yǎng)基，上下室之間避免產(chǎn)生氣泡。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，用棉簽擦凈上室內(nèi)未侵襲的細(xì)胞，PBS緩沖液洗2次，4%多聚甲醛固定 20 min，0.1%結(jié)晶紫染色 15 min，PBS緩沖液洗2次，顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞數(shù)。每組設(shè)置2個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 劃痕試驗(yàn) 將篩選后穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的TE1細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，用200 μL槍頭在培養(yǎng)板上做線性劃痕。PBS緩沖液洗3次，加入無血清培養(yǎng)基，于倒置顯微鏡下拍攝初始劃痕作為起始時(shí)間點(diǎn)(0 h)，培養(yǎng)48 h為終點(diǎn)拍攝劃痕的變化情況，測定遷移后的剩余距離。以[(初始劃痕距離-遷移的剩余距離)/初始劃痕距離]×100%表示劃痕愈合速度。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 免疫共沉淀 制備EC109細(xì)胞裂解液樣本，將其分為4組：Input對(duì)照組、陰性對(duì)照組、IgG組、CTTN組。Input對(duì)照組加入上樣緩沖液煮沸變性后備用;陰性對(duì)照組、IgG組和CTTN組各加入15 μL蛋白 A、蛋白G瓊脂糖珠，低溫?fù)u床孵育預(yù)清除，離心取上清液;IgG組和CTTN組分別加入相應(yīng)的抗體(兔IgG 0.2 μL，兔CTTN 2 μL)，4 ℃搖床過夜；加入30 μL磁珠，低溫?fù)u床孵育4 h；低溫離心棄上清液，用免疫沉淀反應(yīng)(IP)洗脫緩沖液洗滌3次，棄上清液；最后加入20 μL 2×上樣緩沖液煮沸后行蛋白質(zhì)印跡法實(shí)驗(yàn)，用小鼠Src抗體封閉。反之，用Src抗體進(jìn)行沉淀反應(yīng)，也分為Input對(duì)照組、陰性對(duì)照組、IgG組、Src組，IgG組和Src組分別加入小鼠IgG和小鼠Src抗體。沉淀產(chǎn)物行蛋白質(zhì)印跡法實(shí)驗(yàn)，用兔CTTN抗體封閉檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染效果驗(yàn)證 蛋白質(zhì)印跡法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EC109和TE1細(xì)胞的LV-CTTN組CTTN相對(duì)表達(dá)量分別為3.92±0.21、5.12±0.19，均顯著高于各自LV-NC組 (1.62±0.24、1.43±0.22，P值均<0.001)，見圖1A。EC109和TE1細(xì)胞的LV-sh-CTTN組CTTN相對(duì)表達(dá)量分別為0.31±0.11、0.43±0.09，均顯著低于各自LV-sh-NC組(1.59±0.17、1.47±0.15，P值均<0.001),見圖1B。

圖1 慢病毒在食管鱗癌細(xì)胞系中成功過表達(dá)或敲減CTTN

2.2 CTTN調(diào)控侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá) 蛋白質(zhì)印跡法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EC109和TE1細(xì)胞的LV-CTTN組ICAM1、MMP2、MMP9、VEGF-C相對(duì)表達(dá)量均顯著高于各自LV-NC組(P值均<0.01)，見表1、圖2A。EC109和TE1細(xì)胞的LV-sh-CTTN組ICAM1、MMP2、MMP9、VEGF-C相對(duì)表達(dá)量均顯著低于各自LV-sh-NC組(P值均<0.01)，見表2、圖2B、。

表1 EC109和TE1細(xì)胞過表達(dá)CTTN后各侵襲轉(zhuǎn)移指標(biāo)的相對(duì)表達(dá)量比較

表2 EC109和TE1細(xì)胞敲減CTTN后侵襲轉(zhuǎn)移指標(biāo)的相對(duì)表達(dá)量比較

圖2 過表達(dá)或敲減CTTN對(duì)ED109、TE1細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

2.3 CTTN促進(jìn)TE1細(xì)胞侵襲行為 應(yīng)用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)評(píng)估過表達(dá)和敲減CTTN對(duì)TE1細(xì)胞侵襲行為的影響，結(jié)果顯示，LV-CTTN組的穿膜細(xì)胞數(shù)顯著多于LV-NC組 [(541.0±17.8)個(gè)比(230.8±10.9)個(gè)，P<0.001]，見圖3A、3B；而LV-sh-CTTN組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著少于LV-sh-NC組[(102.3±4.0)個(gè)比(223.8±12.1)個(gè)，P<0.001]，見圖3C、3D。

A LV-NC組 B LV-CTTN組 C LV-sh-NC組 D LV-sh-CTTN組

2.4 CTTN促進(jìn)TE1細(xì)胞遷移行為 劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示，TE1細(xì)胞的LV-CTTN組劃痕愈合速度較LV-NC組加快[(72.8±1.9)%比(42.8±1.6)%，P<0.001]，見圖4A；而LV-sh-CTTN組劃痕愈合速度較LV-sh-NC組明顯減慢[(25.7±1.5)%比(43.5±1.9)%，P<0.001]，見圖4B。

圖4 過表達(dá)或敲減CTTN對(duì)TE1細(xì)胞遷移能力的調(diào)控(標(biāo)尺=200 μm)

2.5 CTTN促進(jìn)食管鱗癌遷移侵襲的分子機(jī)制 免疫共沉淀檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用CCTN抗體進(jìn)行沉淀反應(yīng)，沉淀產(chǎn)物以Src抗體封閉，行蛋白質(zhì)印跡法分析見明顯的Src特異性條帶，見圖5A。反之，以Src抗體進(jìn)行沉淀反應(yīng)，沉淀產(chǎn)物以CCTN抗體封閉， 行蛋白質(zhì)印跡法分析見CCTN特異性條帶，見圖5B。提示CCTN與Src之間存在直接相互作用。

圖5 CTTN與Src存在相互作用

3 討 論

侵襲和轉(zhuǎn)移能力是衡量腫瘤細(xì)胞惡性程度的重要生物學(xué)特征，也是腫瘤治療失敗的主要原因。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過程，涉及細(xì)胞間黏附減少、基質(zhì)降解、細(xì)胞骨架重排，以及細(xì)胞突出和偽足的形成等諸多環(huán)節(jié)，是腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)三者之間一系列復(fù)雜調(diào)控的結(jié)果。

CTTN(又稱EMS1)基因位于11q13,最初作為酪氨酸磷酸化蛋白被發(fā)現(xiàn)，在多種癌癥如卵巢癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、下咽癌及頭頸部鱗癌中異常表達(dá),并與患者的不良預(yù)后相關(guān)[3-4,6-9]。CTTN因其自身結(jié)構(gòu)特征在癌癥中主要發(fā)揮促進(jìn)侵襲、轉(zhuǎn)移的作用，但也有研究[10]報(bào)道CTTN能促進(jìn)癌細(xì)胞增殖并抑制其凋亡。侵襲性偽足是癌細(xì)胞侵襲過程中特有的突出結(jié)構(gòu)，其能降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)。大量的研究[5，11]證實(shí)，CTTN作為侵襲性偽足組成成分通過促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲性偽足形成，維持其穩(wěn)定，進(jìn)而調(diào)控侵襲轉(zhuǎn)移。本研究中，蛋白質(zhì)印跡法分析結(jié)果顯示，過表達(dá)CTTN后，降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的MMP2、MMP9和介導(dǎo)細(xì)胞黏附的ICAM1表達(dá)增高；同時(shí)Transwell實(shí)驗(yàn)及劃痕試驗(yàn)也顯示過表達(dá)CTTN后食管鱗癌細(xì)胞侵襲遷移能力增強(qiáng)。而敲減CTTN后不僅ICAM1、MMP2、MMP9表達(dá)降低，而且Transwell小室的細(xì)胞數(shù)明顯減少，劃痕愈合速度也明顯減慢。腫瘤新生血管的形成對(duì)腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，有研究[12]結(jié)果表明，CTTN的高表達(dá)能抑制血小板衍生生長因子受體(PDGFR)、EGFR1生長因子受體等的降解，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤新生血管的生成。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)CTTN后VEGF-C表達(dá)增加，敲減CTTN后VEGF-C表達(dá)減少。綜上說明CTTN通過上調(diào)ICAM1、MMP2、MMP9及VEGF-C促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞遷移及侵襲。

CTTN最常見的修飾是酪氨酸磷酸化和絲氨酸/蘇氨酸的磷酸化。酪氨酸磷酸化常發(fā)生在Y421、Y466和Y488。CTTN作為Src磷酸化的底物，被Src磷酸化后發(fā)生活化，活化的CTTN分子能夠作為支架蛋白維持Arp2/3復(fù)合物的穩(wěn)定，進(jìn)一步促使肌動(dòng)蛋白(actin)在細(xì)胞前緣形成樹突狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)即片狀偽足和侵襲性偽足調(diào)控，從而調(diào)控細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移[13]。CTTN已經(jīng)被證實(shí)在多種癌癥的侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[6,14-15]。有研究[16-17]報(bào)道，Src通過與CTTN相互作用并使其發(fā)生酪氨酸磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移。為了探究CTTN調(diào)控食管鱗癌侵襲、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，本研究通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CTTN與Src的相互作用，結(jié)果提示在食管鱗癌中CTTN通過與Src相互作用促進(jìn)侵襲和轉(zhuǎn)移。