夏 志 ，趙 艷 ，丁孝民 ，尚畫雨 ，蘇全生 ，王前進(jìn) *

人類機(jī)體從40歲開始衰老，隨著年齡增長(zhǎng)逐漸加?。╕amada，2018）。衰老與骨骼肌萎縮、衰弱和功能障礙等表型密切相關(guān)，衰老性肌萎縮（age-related sarcopenia）可累及高達(dá)33.6%的老齡人群（Dalle et al.，2017）。骨骼肌衰老的病原學(xué)因素較為復(fù)雜。隨著衰老進(jìn)程的發(fā)展，許多常見的生理過(guò)程如凋亡、氧化應(yīng)激、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、炎癥、激素失調(diào)及線粒體功能障礙等逐漸與骨骼肌的退行性變化發(fā)生潛在關(guān)聯(lián)（Yoo et al.，2018）。研究表明，機(jī)體衰老的轉(zhuǎn)錄組標(biāo)記可用于評(píng)估衰老性肌萎縮與癌性惡病質(zhì)的臨床干預(yù)效果（Ebhardt et al.，2017）。這一方法已被用于探討熱量限制對(duì)小鼠骨骼肌的有益促進(jìn)（Lee et al.，1999）。

目前，臨床對(duì)衰老性肌萎縮的治療仍無(wú)公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)與指引。如ACSM與AMA倡導(dǎo)的“Exercise is medicine”理念所言，運(yùn)動(dòng)帶來(lái)的健康收益極為顯著?，F(xiàn)實(shí)中，運(yùn)動(dòng)亦常作為二級(jí)預(yù)防手段用于多種慢病干預(yù)（Stoutenberg et al.，2018）。有研究甚至將運(yùn)動(dòng)稱作“Polypill”，視為對(duì)抗與機(jī)體衰老相關(guān)的9個(gè)細(xì)胞與分子標(biāo)志（基因組不穩(wěn)定性、端粒消減、表觀遺傳性改變、蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡、營(yíng)養(yǎng)素感應(yīng)失調(diào)、線粒體功能紊亂、細(xì)胞衰老、干細(xì)胞耗竭及細(xì)胞間信息交換的改變）的關(guān)鍵手段（Rebelo-Marques et al.，2018），抗阻運(yùn)動(dòng)被認(rèn)為在防治衰老性骨骼肌萎縮的發(fā)生與發(fā)展方面具有重要作用。自Rosenberg于1989年定義衰老性肌萎縮至今，學(xué)界就抗阻運(yùn)動(dòng)對(duì)肌肉質(zhì)量、力量與功能等衰老骨骼肌表型的影響開展了大量有益探討，抗阻訓(xùn)練對(duì)衰老骨骼肌的健康收益業(yè)已得到公認(rèn)。數(shù)據(jù)顯示，抗阻訓(xùn)練可使衰老骨骼肌體積增長(zhǎng)高達(dá)21%，肌力增幅可達(dá)90%（Borde et al.，2015）。但是除骨骼肌表型之外，抗阻運(yùn)動(dòng)究竟能否改變健康老年人基因表達(dá)譜的衰老性變化，迄今仍未定論。有研究提示，運(yùn)動(dòng)可使衰老心肌組織轉(zhuǎn)錄組譜呈現(xiàn)年輕化特征（Bronikowski et al.，2003），逆轉(zhuǎn)肌球蛋白重鏈mRNA豐度的一些退行性改變（Raue et al.，2012）。此類研究多集中探索抗阻運(yùn)動(dòng)對(duì)單一靶蛋白或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，究竟是何種關(guān)鍵基因通過(guò)何種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在抗阻運(yùn)動(dòng)改善衰老骨骼肌表型過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，亦不清楚?？梢?，在探討衰老骨骼肌表型變化的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步豐富包括全基因組轉(zhuǎn)錄組在內(nèi)的數(shù)據(jù)，厘清基因表達(dá)譜響應(yīng)抗阻運(yùn)動(dòng)刺激發(fā)生的適應(yīng)性變化，有助于更加系統(tǒng)地闡明抗阻運(yùn)動(dòng)改善骨骼肌衰老的分子機(jī)制，為骨骼肌衰老的臨床防治提供更多研發(fā)靶點(diǎn)。需要指出的是，采用基因芯片進(jìn)行的獨(dú)立研究往往存在甄別閾值低、樣本量受限和主觀偏倚明顯等問題，導(dǎo)致篩選出的差異基因數(shù)量龐大，假陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)與錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率相應(yīng)升高，亟待采用更科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯糠妒綄?duì)前人的既有數(shù)據(jù)進(jìn)行整合與深入挖掘，從而使研究結(jié)果與結(jié)論更穩(wěn)健。

鑒于此，本研究擬采用生物信息學(xué)研究范式，對(duì)前人研究中的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)挖掘。首先，比較衰老機(jī)體與青年的骨骼肌基因表達(dá)譜差異，對(duì)初始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制。其次，分析衰老骨骼肌響應(yīng)長(zhǎng)期抗阻訓(xùn)練干預(yù)發(fā)生的適應(yīng)性基因表達(dá)譜變化。最后，通過(guò)生物信息學(xué)分析工具篩選出發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵基因（hub genes）與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，以明確長(zhǎng)期抗阻訓(xùn)練對(duì)衰老骨骼肌基因表達(dá)譜和生物代謝過(guò)程的影響及重要作用靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 微陣列基因表達(dá)數(shù)據(jù)

DNA微陣列是一種能夠分析基因組和基因表達(dá)特征圖譜的新型工具。目前，已開發(fā)出多種商業(yè)化DNA微陣列和DNA芯片用于基因組研究。DNA微陣列分析包括寡核苷酸芯片、cDNA芯片和基因組芯片等，其分為兩種模式：一種是將目的基因固定于支持物上，適于分析大量、不同的目的基因；另一種是將大量探針固定于支持物上，適于對(duì)相同目的基因進(jìn)行不同探針序列的分析（Mar‐zancola et al.，2016）。

本研究采用關(guān)鍵詞“skeletal muscle”“aging”和“resis‐tance exercise”在GEO數(shù)據(jù)集數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行組合檢索，限定人類種屬，檢出微陣列數(shù)據(jù)集25套。篩除與本研究需求不符及樣本量過(guò)?。╪＜7）和/或缺失值過(guò)多的低質(zhì)量數(shù)據(jù)集后，納入3套數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，分別為GSE 25941（GDS 5216）（Raue et al.，2012）、GSE 38718（Liu et al.，2013）和 GSE 8479（Melov et al.，2007）。GSE 25941 和GSE 38718數(shù)據(jù)集均基于GPL 570平臺(tái)構(gòu)建（表1）。GSE 25941數(shù)據(jù)集含36名被試，其中青年對(duì)照被試15名［（25±3）歲］：男性7名，女性8名；老年被試21名［（78±6）歲］：男性10名，女性11名。GSE 38718數(shù)據(jù)集含22名被試，其中青年對(duì)照被試14名（19～28）歲：男、女各7名；老年被試8名（65～76歲）；男、女各4名。GSE 8479數(shù)據(jù)集基于GPL 2700平臺(tái)構(gòu)建（Sentrix HumanRef-8 Expression BeadChip），含14名老年被試（65～79歲），其中男性6名，女性8名，接受為期26周的抗阻訓(xùn)練：每周訓(xùn)練2次（周一與周四，或周二與周五），訓(xùn)練內(nèi)容包括腿舉、臥推、坐姿腿屈伸、俯臥腿屈伸、肩上推舉、坐姿高位下拉、提踵、卷腹和坐姿背伸展等，每個(gè)動(dòng)作完成3組，每組10次重復(fù)。訓(xùn)練采用遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)方式，初始負(fù)荷為50%1RM，每2周重新測(cè)定1RM值，訓(xùn)練期結(jié)束時(shí)負(fù)荷增至80%1RM。

表1 本研究采用的GEO微陣列數(shù)據(jù)集信息Table 1 Details for GEO Microarray Datasets

1.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理

下載平臺(tái)注釋文件和預(yù)處理過(guò)的基因表達(dá)矩陣文件（series matrix），分離出各樣本的基因表達(dá)（Matrix_Ta‐ble_Begin～Matrix_Table_End）并保存為txt文件。將平臺(tái)注釋文件作為背景文件，轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)使各數(shù)據(jù)集探針名ID為對(duì)應(yīng)基因的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)名（gene symbol），應(yīng)用R包對(duì)下載文件進(jìn)行背景校正、中位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化和Log2轉(zhuǎn)換。由于GSE 8479數(shù)據(jù)集只選擇滿足本研究設(shè)計(jì)需求的老年被試，因此預(yù)處理時(shí)下載原始數(shù)據(jù)后剔除冗余數(shù)據(jù)，采用RMAExpress軟件對(duì)芯片原始數(shù)據(jù)進(jìn)行背景校正與中位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化，形成基因表達(dá)矩陣文件再進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3 差異表達(dá)基因篩選

本研究進(jìn)行兩重比較：靜息衰老與靜息青年被試骨骼肌基因表達(dá)譜；衰老被試接受抗阻訓(xùn)練干預(yù)前后。

基因差異表達(dá)采用R語(yǔ)言Bioconductor系列包中的Limma包進(jìn)行分析。在R中輸入操作命令代碼后通過(guò)Limma包對(duì)數(shù)據(jù)集中的靜息青年對(duì)照和靜息衰老被試，以及靜息衰老被試與訓(xùn)練干預(yù)衰老被試的差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）進(jìn)行分析，滿足|LogFC|＞1.5和P＜0.05條件的基因被視為DEGs（FC為Fold Change）。對(duì)各數(shù)據(jù)集篩選出的DEGs進(jìn)行層次聚類，采用歐式距離計(jì)算法度量樣本相似性。

1.4 微陣列數(shù)據(jù)整合分析

鑒于獨(dú)立研究存在的潛在偏倚與不足，本研究采用重疊分析法（overlapping analysis）對(duì)兩重比較獲得的全部DEGs進(jìn)行整合分析并繪制韋恩圖，篩選出在3套微陣列數(shù)據(jù)集中均差異顯著的基因用于后續(xù)分析。

1.5 差異表達(dá)基因的GO功能注釋和KEGG通路富集分析

采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析工具和KOBAS在線分析數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)候選基因進(jìn)行富集分析（Sherman et al.，2007），顯著性水平置于0.05。DEGs的KEGG通路分析采用KO‐BAS與Revigo數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行聯(lián)合處理，當(dāng)P值與校正P值均小于0.05時(shí)視為顯著性富集通路，富集通路后采用Cyto‐scape軟件進(jìn)行可視化。

1.6 差異基因編碼蛋白的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作分析

采用STRING網(wǎng)絡(luò)分析數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定蛋白質(zhì)之間的互作關(guān)系（protein-protein interaction，PPI）?；プ鹘Y(jié)果來(lái)源于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、數(shù)據(jù)庫(kù)、文本挖掘和生物信息學(xué)預(yù)測(cè)等（Von Mering et al.，2003）。將STRING分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape進(jìn)行可視化，每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)蛋白，節(jié)點(diǎn)間的連線反映蛋白之間的交互，用于鑒定DEGs編碼蛋白間的互作與通路。采用3種數(shù)據(jù)挖掘方法共同鑒定關(guān)鍵基因：首先，在STRING分析結(jié)果中通過(guò)節(jié)點(diǎn)計(jì)數(shù)進(jìn)行篩選，將計(jì)數(shù)10以上的節(jié)點(diǎn)納入篩選范圍；其次，采用Cytoscape的MCODE App對(duì)構(gòu)建的整個(gè)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊挖掘，篩選得分最高的模塊及相應(yīng)蛋白；最后，采用CytoHubba App對(duì)STRING分析結(jié)果按照節(jié)點(diǎn)度（degree）進(jìn)行排序，篩選出前10位節(jié)點(diǎn)。將3種分析與挖掘的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，結(jié)合PPI交互網(wǎng)絡(luò)確定功能最集中的蛋白并采用BinGo App進(jìn)行二次富集分析。此聯(lián)合鑒定方法可有效規(guī)避單一篩選存在的潛在偏倚與假陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)。

2 研究結(jié)果

2.1 微陣列數(shù)據(jù)信息與差異表達(dá)基因篩選

對(duì)本研究3套數(shù)據(jù)集中的骨骼肌基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)經(jīng)中位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化處理后，采用R語(yǔ)言的Limma包對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)進(jìn)行基因篩選，在GSE 25941數(shù)據(jù)集中篩選出1 291個(gè)DEGs（圖1A），在GSE 38718數(shù)據(jù)集篩選出581個(gè)DEGs（圖1B），在GSE 8479數(shù)據(jù)集篩選出60個(gè)DEGs（圖1C）。

圖1 GSE 25941（A）、GSE 38718（B）和GSE 8479（C）數(shù)據(jù)集差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)火山圖Figure 1. Differential Expression of Data between Two Sets of Samples in GSE25941（A），GSE38718（B）and GSE8479（C）Datasets

2.2 差異表達(dá)基因整合分析結(jié)果

本研究采用重疊分析法對(duì)3套微陣列數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析（圖2），篩選出共同表達(dá)的差異基因共計(jì)60個(gè)（表2）。差異基因重疊分析較RobustRankAggreg算法（RRA）更為嚴(yán)謹(jǐn)，可更好地篩除邊緣顯著基因或僅在單個(gè)、兩個(gè)微陣列數(shù)據(jù)集中表達(dá)顯著的差異基因。

表2 整合微陣列數(shù)據(jù)篩選的差異表達(dá)基因Table 2 Screening DEGs by Integrated Microarray

圖2 數(shù)據(jù)集差異表達(dá)基因重疊分析韋恩圖Figure2. Venn Diagram for DEGs Based on Overlapping Analysis

2.3 差異表達(dá)基因的GO富集分析結(jié)果

GO功能富集分析包括3個(gè)功能組，分別為生物過(guò)程（biological process）、分子功能（molecular function）和細(xì)胞組成（cellular component）。就衰老骨骼肌響應(yīng)抗阻運(yùn)動(dòng)干預(yù)的DEGs的GO富集分析顯著性條目（圖3）而言，在細(xì)胞組成功能組中，抗阻運(yùn)動(dòng)對(duì)衰老骨骼肌影響的DEGs富集于細(xì)胞骨架蛋白、Poly（A）RNA、脂肪酸、蛋白質(zhì)結(jié)合以及運(yùn)動(dòng)、抗氧化、轉(zhuǎn)運(yùn)體與酶催化活性；在細(xì)胞組成功能組中，DEGs富集于內(nèi)膜系統(tǒng)、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器及細(xì)胞外區(qū)域；在分子功能中，DEGs主要富集于單細(xì)胞-多細(xì)胞有機(jī)物過(guò)程（如肌肉系統(tǒng)過(guò)程與肌肉收縮）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞器組織、響應(yīng)應(yīng)激與刺激、調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡、氮端蛋白質(zhì)氨基酸乙?；⒓?xì)胞過(guò)程及代謝等功能。

圖3 差異表達(dá)基因GO功能富集分析的顯著性條目Figure 3. Significant Terms of GO Enrichment Analysis

2.4 差異表達(dá)基因的KEGG通路分析結(jié)果

采用KOBAS在線分析和Revigo數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選出的DEGs進(jìn)行KEGG通路分析（表3）發(fā)現(xiàn)，在P值與校正P值顯著性水平均置于0.05時(shí)，共有10個(gè)DEGs顯著富集于MAPK、胰島素、PI3K-Akt與actin細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)信號(hào)通路。導(dǎo)入Cytoscape計(jì)算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮攸c(diǎn)并確定每個(gè)節(jié)點(diǎn)，基因與通路節(jié)點(diǎn)間的交互如圖4。

圖4 差異表達(dá)基因的顯著通路富集Figure 4. Significant Pathway Enrichment of DEGs

表3 差異表達(dá)基因的KEGG通路分析Table 3 KEGG Pathway Analysis of DEGs

2.5 PPI拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

DEGs的PPI拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)分析（圖5）顯示，共計(jì)60個(gè)節(jié)點(diǎn)（node）與176條邊（edge），平均節(jié)點(diǎn)度（degree）為5.87，平均聚類系數(shù)為0.453，PPI富集P值為0.017 5。圈體內(nèi)所示蛋白與其他蛋白存在≥5的相互作用關(guān)系，為拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的中心節(jié)點(diǎn)，刪除這些節(jié)點(diǎn)蛋白后，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低。MCODE模塊挖掘（圖6A）與CytoHubba基于degree排序篩選出的關(guān)鍵基因（圖6B），結(jié)合STRING數(shù)據(jù)庫(kù)節(jié)點(diǎn)計(jì)數(shù)結(jié)果（表4），鑒定出交互最顯著的基因共計(jì)15個(gè)：MXRA5、JAK1、CCNG1、FOS、MYH1、RHOQ、ZAK、ASB11、CCNI、KIF5B、DUSP1、MYL5、ASB15、PRKAA2與SLMAP。

表4 STRING節(jié)點(diǎn)計(jì)數(shù)篩選關(guān)鍵基因結(jié)果Table 4 The Results of Gene Screening by Nodes Counting from STRING Database

圖5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交互網(wǎng)絡(luò)圖Figure 5. Protein-Protein Interaction Network

圖6 MCODE模塊挖掘（A）與degree排序（B）篩選基因結(jié)果Figure 6. The Results of Gene Screening by MCODE Mining（A）and Degree Ranking（B）

2.6 關(guān)鍵基因的GO功能與KEGG通路富集分析

應(yīng)用BinGO進(jìn)行功能富集分析（表5），展示顯著性前5位結(jié)果，發(fā)現(xiàn)生物過(guò)程主要富集到骨骼肌對(duì)內(nèi)源與外源性刺激的響應(yīng)及骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；分子功能富集到運(yùn)動(dòng)（神經(jīng)元）活性，及核糖核苷酸、Rho GTPase結(jié)合閾、嘌呤核糖核苷酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合；細(xì)胞組成富集到II型肌球蛋白復(fù)合物、肌肉肌球蛋白復(fù)合物、細(xì)胞骨架、細(xì)胞骨架組分與蛋白質(zhì)復(fù)合物。就KEGG通路而言，主要富集到MAPK、胰島素與PI3K-Akt信號(hào)通路。ZAK、DUSP1、FOS、JAK1、RHOQ 和 PRKAA2可能是抗阻訓(xùn)練改善衰老骨骼肌表型的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

表5 關(guān)鍵基因GO功能與KEGG通路富集分析結(jié)果Table 5 The Results of GO and KEGG Enrichment Analysis for Hub Genes

3 分析與討論

衰老性肌萎縮是骨骼肌衰老退行性病變的關(guān)鍵表型，主要表現(xiàn)為骨骼肌質(zhì)量的丟失以及功能衰退。衰老性肌萎縮患者的骨骼肌質(zhì)量以每年1%的速率衰減，隨著年齡增長(zhǎng)而逐漸加速（Yamada，2018）。其發(fā)生與發(fā)展可顯著增加老年人跌倒、殘疾甚至死亡的風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重影響身心健康與生活質(zhì)量，成為影響健康老齡化的重大社會(huì)問題。因此，厘清衰老性肌萎縮發(fā)生與發(fā)展的分子機(jī)理具有重要意義。

文獻(xiàn)梳理表明（夏志等，2016），衰老性骨骼肌萎縮與多種病原學(xué)因素相關(guān)，可能包括：1）營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)失衡：機(jī)體組織對(duì)營(yíng)養(yǎng)素的反應(yīng)下降和/或營(yíng)養(yǎng)不良，造成蛋白質(zhì)代謝紊亂；2）缺乏體力活動(dòng)和/或運(yùn)動(dòng)：現(xiàn)代社會(huì)靜坐少動(dòng)的生活方式使得老年人群易于進(jìn)入“缺乏體力活動(dòng)—體質(zhì)健康下降—難以運(yùn)動(dòng)”這一循環(huán)；3）自由基攻擊：線粒體DNA缺失突變所致的氧化損傷；4）內(nèi)分泌功能改變：激素、生長(zhǎng)因子的分泌與釋放發(fā)生變化，如雌激素、生長(zhǎng)激素、睪酮、脫氫表雄酮減少和/或機(jī)體組織對(duì)胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子刺激的響應(yīng)性改變；5）慢性炎癥：IL-1、TNF-α和IL-6等促炎性細(xì)胞因子的分解代謝效應(yīng)；6）神經(jīng)-肌肉完整性損害：不可逆的纖維損傷或永久性失去神經(jīng)支配使神經(jīng)-肌肉之間失去正常聯(lián)系；7）衛(wèi)星細(xì)胞募集水平改變：衰老過(guò)程中，Ⅱ型肌纖維衛(wèi)星細(xì)胞的數(shù)量和募集能力大幅下降；8）細(xì)胞凋亡：肌細(xì)胞的凋亡及其誘導(dǎo)的線粒體DNA突變。盡管基于表型指標(biāo)的研究提供了多種可能性機(jī)制線索，但是骨骼肌衰老的機(jī)制迄今仍未澄清。

基因組的不穩(wěn)定性（genomic instability）是機(jī)體衰老的首要生物標(biāo)志，因此，有機(jī)生命體在生命周期中的基因損傷累積被視為衰老的共同特性（Lopez-Otin et al.，2013）。前人采用微陣列手段就衰老骨骼肌的基因表達(dá)譜變化進(jìn)行了探討，但其響應(yīng)長(zhǎng)期抗阻訓(xùn)練干預(yù)的適應(yīng)性變化迄今鮮見相關(guān)報(bào)道（Jozsi et al.，2000；Su et al.，2015）。就本研究分析的數(shù)據(jù)集而言，雖然研究者已公開報(bào)道研究結(jié)果，但其對(duì)微陣列數(shù)據(jù)的分析尚有不足，如GSE 25941（GDS 5216）（Raue et al.，2012）與 GSE 38718（Liu et al.，2013）并未對(duì)衰老骨骼肌與青年被試骨骼肌的基因表達(dá)譜差異進(jìn)行細(xì)致比較，未能明確兩者之間存在顯著表達(dá)差異的具體基因，從而未能進(jìn)行相應(yīng)的功能富集與通路分析；GSE 8479（Melov et al.，2007）重點(diǎn)關(guān)注力量等骨骼肌表型響應(yīng)運(yùn)動(dòng)干預(yù)發(fā)生的適應(yīng)變化，對(duì)于運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的衰老骨骼肌基因譜變化未作深入分析，亦未能明確抗阻運(yùn)動(dòng)究竟通過(guò)何種基因與通路介導(dǎo)改善骨骼肌衰老。本研究中，通過(guò)重疊分析法整合3套微陣列數(shù)據(jù)集的結(jié)果，結(jié)合LogFC閾值篩除邊緣顯著基因與僅在單個(gè)或兩個(gè)微陣列數(shù)據(jù)集中表達(dá)顯著的差異基因，最終篩選出衰老骨骼肌接受26周抗阻訓(xùn)練干預(yù)后的DEGs共計(jì)60個(gè)，通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)分析鑒定出15個(gè)基因的編碼蛋白交互最顯著。其中，ZAK、DUSP1、FOS、JAK1、RHOQ和 PRKAA2主要富集于MAPK、胰島素和PI3K-Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。與既有研究相比，它不僅深入分析挖掘了研究中的微陣列數(shù)據(jù)，而且進(jìn)一步鑒定了可能介導(dǎo)抗阻運(yùn)動(dòng)改善骨骼肌衰老的關(guān)鍵基因與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

ZAK、DUSP1與FOS富集于MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其編碼蛋白均為MAPK信號(hào)途徑的重要調(diào)節(jié)因子。其中，ZAK基因是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子MAPK3家族成員，編碼一種N端含激酶催化結(jié)構(gòu)域的蛋白。該蛋白具有促凋亡活性，在骨骼肌細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中有重要貢獻(xiàn)。DUSP1編碼一種具有酪氨酸/蘇氨酸雙重特異性的磷酸酶，該蛋白可去磷酸化MAP激酶MAPK1/ERK2，在骨骼肌細(xì)胞響應(yīng)環(huán)境刺激以及對(duì)增殖的負(fù)向調(diào)控中均發(fā)揮重要作用。FOS基因家族編碼亮氨酸拉鏈蛋白，使其與JUN家族的蛋白質(zhì)形成二聚體轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物AP-1，行使調(diào)節(jié)骨骼肌細(xì)胞增殖、分化和轉(zhuǎn)化的功能。MAPK是一類重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，主要由ERK1/2、ERK3/4、ERK5、p38和JNK/SAPK 5個(gè)亞類組成。其信號(hào)通路在所有真核生物中均存在，在骨骼肌細(xì)胞基因表達(dá)、分化、再生和響應(yīng)環(huán)境刺激等方面發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。這與GO功能富集分析中細(xì)胞過(guò)程及細(xì)胞功能富集到的結(jié)果（表5）一致。ERK1/2和p38 MAPK是最重要的兩條通路，均可響應(yīng)運(yùn)動(dòng)刺激發(fā)生表達(dá)變化。ERK1/2可通過(guò)活化核轉(zhuǎn)錄因子影響基因轉(zhuǎn)錄，與骨骼肌響應(yīng)運(yùn)動(dòng)刺激的適應(yīng)性變化密切相關(guān)。運(yùn)動(dòng)可使ERK1/2活性迅速上調(diào)并誘導(dǎo)MAPK活化，參與預(yù)防骨骼肌萎縮（Kramer et al.，2007）。William‐son等（2003）觀察到：與年輕被試［（21.8±0.9）歲］相比，衰老被試［（79.1±3.3）歲］股外側(cè)肌內(nèi)MAPK信號(hào)通路蛋白表達(dá)總量并無(wú)差異，ERK1/2與p38 MAPK磷酸化表達(dá)水平升高。但進(jìn)行急性抗阻運(yùn)動(dòng)后，年輕被試骨骼肌ERK1/2與p38 MAPK磷酸化水平進(jìn)一步上調(diào)，衰老被試則呈相反變化趨勢(shì)。Parkington等（2004）采用電刺激進(jìn)行的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦得出相同結(jié)論。p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑作為骨骼肌內(nèi)多種細(xì)胞信息傳遞的中介通路，可參與骨骼肌細(xì)胞增殖、發(fā)育、響應(yīng)環(huán)境刺激等多種胞內(nèi)生理過(guò)程，影響干細(xì)胞的自主丟失與更新。研究表明，衰老小鼠骨骼肌內(nèi)的衛(wèi)星細(xì)胞穩(wěn)態(tài)過(guò)程因p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的失調(diào)而受到影響（Bernet et al.，2014）。p38 MAPK的增齡性變化與抗阻運(yùn)動(dòng)干預(yù)后變化與ERK1/2一致（Williamson et al.，2003）。Mylabathula等（2006）的大鼠實(shí)驗(yàn)也觀察到衰老導(dǎo)致的相同變化趨勢(shì)。衰老骨骼肌處于被稱為“stress-like conditions”的狀態(tài)，這可能是ERK1/2與p38 MAPK較年輕被試呈現(xiàn)出高磷酸化表達(dá)水平的重要原因（韓雨梅等，2009）。響應(yīng)抗阻運(yùn)動(dòng)刺激后的表達(dá)下調(diào)可能標(biāo)志著衰老骨骼肌響應(yīng)營(yíng)養(yǎng)、藥物、運(yùn)動(dòng)等合成代謝刺激的能力下降，是形成合成抵抗（anabolic resis‐tance）的因素之一（Potsch et al.，2014）。

JAK1、RHOQ分別與PRKAA2共同富集于胰島素或PI3K-Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。其中，JAK1編碼一種膜蛋白，該蛋白是一類蛋白酪氨酸激酶的成員，可催化ATP上的γ-磷酸轉(zhuǎn)移到蛋白酪氨酸殘基，在骨骼肌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化中具有重要作用。RHOQ編碼Rho GTPases家族成員，與GTP水解密切相關(guān)。PRKAA2編碼AMPK的催化亞基，上調(diào)其功能表達(dá)水平，可磷酸化下游眾多與骨骼肌代謝相關(guān)的限速酶。胰島素是主要的餐后（postprandial）合成代謝激素，胰島素抵抗可能發(fā)生衰老性肌萎縮。就胰島素與衰老性肌萎縮的關(guān)聯(lián)而言，Morais等（2018）得出兩個(gè)結(jié)論：其一，老年人合成代謝反應(yīng)的削弱是由于胰島素不能產(chǎn)生與年輕人相似的蛋白質(zhì)合成刺激水平；其二，蛋白質(zhì)反應(yīng)的敏感性降低與糖有關(guān)。通過(guò)多重回歸分析發(fā)現(xiàn)，衰老過(guò)程中常見的絕對(duì)去脂體質(zhì)量降低和體脂含量增加與胰島素在刺激蛋白質(zhì)合成時(shí)的合成代謝作用變化密切相關(guān)。因此，通過(guò)運(yùn)動(dòng)改善胰島素敏感性被視為改善老年人骨骼肌健康水平的重要途徑（Villareal et al.，2011）。盡管衰老骨骼肌響應(yīng)急性抗阻運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的基因表達(dá)譜變化顯著低于青年（Rivas et al.，2014），但長(zhǎng)期抗阻訓(xùn)練仍然可以對(duì)衰老機(jī)體胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生積極影響。究其機(jī)理，可能主要基于兩方面：一方面，抗阻訓(xùn)練可經(jīng)IGF-1/PI3K/Akt信號(hào)通路刺激衰老骨骼肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成。Ribeiro等（2017）對(duì)衰老大鼠進(jìn)行為期12周爬梯抗阻訓(xùn)練，觀察到IGF-1介導(dǎo)的骨骼肌合成代謝上調(diào)，認(rèn)為其對(duì)調(diào)控骨骼肌衰老（形態(tài)學(xué)與代謝適應(yīng)）關(guān)鍵因子的基因表達(dá)具有重要影響。另一方面，抗阻訓(xùn)練可影響GLUT-4轉(zhuǎn)位至骨骼肌細(xì)胞膜，改善胰島素敏感性。胰島素抵抗與骨骼肌衰老及蛋白質(zhì)合成代謝削弱存在聯(lián)系，因此，其對(duì)衰老骨骼肌的蛋白質(zhì)代謝平衡亦有貢獻(xiàn)。PI3K-Akt信號(hào)通路在改善調(diào)節(jié)衰老骨骼肌結(jié)構(gòu)功能狀態(tài)方面的作用已達(dá)成廣泛共識(shí)（Mayhew et al.，2009），加之其與胰島素信號(hào)通路交互，因此在維持衰老骨骼肌健康水平方面亦有重要影響。本研究中，PRKAA2同時(shí)富集于胰島素與PI3K-Akt信號(hào)途徑，也為兩條通路的互作提供佐證。由于PRKAA2編碼AMPKα2，進(jìn)一步提示抗阻運(yùn)動(dòng)對(duì)衰老骨骼肌的AMPK信號(hào)通路可能亦有影響。Fortes等（2017）指出，抗阻運(yùn)動(dòng)促進(jìn)骨骼肌肥大的機(jī)制同時(shí)涉及PI3K-Akt途徑的活化，以及對(duì)AMPK功能表達(dá)的抑制。

MAPK、胰島素、PI3K-Akt以及AMPK信號(hào)通路在衰老骨骼肌響應(yīng)抗阻訓(xùn)練干預(yù)時(shí)究竟如何互作，目前尚未澄清。但有研究表明，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1（mTORC1，含mTOR、Raptor和mLST8）可能是其共同作用途徑之一。mTORC1是骨骼肌響應(yīng)合成代謝刺激、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成與適應(yīng)性肥大的關(guān)鍵信號(hào)分子，mTOR-p70S6K-4EBP1通路對(duì)抗阻運(yùn)動(dòng)的響應(yīng)性更是直接影響其抗衰老性肌萎縮效應(yīng)（Ogasawara et al.，2017）。因此，組織特異性mTORC1激動(dòng)劑的研發(fā)在骨骼肌萎縮干預(yù)領(lǐng)域始終是備受關(guān)注的熱點(diǎn)問題（Saxton et al.，2017）。衰老骨骼肌mTORC1底物磷酸化水平下調(diào)（Wilkinson et al.，2018），抗阻運(yùn)動(dòng)可能通過(guò) MAPK、PI3K-Akt、胰島素（IGF-1）及AMPK介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)這一趨勢(shì)。但是，ZAK、DUSP1、FOS、JAK1、RHOQ和PRKAA2作為涉及其中的關(guān)鍵基因，其編碼蛋白如何參與這一調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，能否作為臨床改善衰老性骨骼肌萎縮的潛在靶點(diǎn)，有待大量基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)予以證實(shí)。

4 結(jié)論

衰老可致骨骼肌基因表達(dá)譜發(fā)生顯著變化，抗阻訓(xùn)練亦可通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)變化而改變骨骼肌表型。本研究通過(guò)生物信息學(xué)研究方法，深入挖掘、分析了既有微陣列數(shù)據(jù)，鑒定出相關(guān)DEGs共計(jì)60個(gè)。其中，MXRA5、JAK1、CCNG1、FOS、MYH1、RHOQ、ZAK、ASB11、CCNI、KIF5B、DUSP1、MYL5、ASB15、PRKAA2與 SLMAP可能是介導(dǎo)衰老骨骼肌響應(yīng)長(zhǎng)期抗阻訓(xùn)練的關(guān)鍵基因；ZAK、DUSP1、FOS、JAK1、RHOQ和PRKAA2可能通過(guò)MAPK、胰島素、PI3K-Akt及AMPK信號(hào)級(jí)聯(lián)介導(dǎo)響應(yīng)抗阻訓(xùn)練刺激，調(diào)節(jié)mTORC1功能表達(dá)，改善衰老骨骼肌表型，可能是臨床防治骨骼肌衰老的候選靶點(diǎn)。