張廷輝，湯承浩，王曉銘，胡秀虹▲，鐘艷子，張海蘭

(1黔東南州食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，貴州 凱里 556011；2凱里學(xué)院大健康學(xué)院，貴州 凱里 556011)

韭菜根是百合科蔥屬多年生宿根性植物——寬葉韭(AlliumhookeriThwaites)的肉質(zhì)根，主要產(chǎn)于云貴川和西藏[1-2]。腌韭菜根是貴州黔東南的一款本土特色食品，因其豐富的營(yíng)養(yǎng)成分、獨(dú)特的風(fēng)味及保健功效，深受當(dāng)?shù)厣贁?shù)人們的喜愛(ài)。不過(guò)，韭菜根原料水分含量高又營(yíng)養(yǎng)豐富，極易造成袋裝產(chǎn)品在貯存過(guò)程中的腐敗。研究表明，腌制蔬菜的變質(zhì)在一定程度上與其腐敗微生物的數(shù)量密切相關(guān)[3]。課題組研究發(fā)現(xiàn)致使腌韭菜根腐敗變質(zhì)的主要微生物是細(xì)菌[4-5]。

目前，測(cè)定細(xì)菌菌液濃度的方法主要有比濁法[6-7]、平板計(jì)數(shù)法[8]和顯微鏡計(jì)數(shù)法等。顯微鏡計(jì)數(shù)法雖然快速，但不能做出宏觀、全面的反應(yīng)；平板計(jì)數(shù)法重復(fù)性、平行性好但速度慢、工作量大；比濁法測(cè)定的一般為細(xì)菌總數(shù)(活菌數(shù)+死菌數(shù))，具有簡(jiǎn)單、快速等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)無(wú)色素產(chǎn)生、菌液顏色較淺的細(xì)菌而言，是一個(gè)不錯(cuò)的選擇[9]。嚴(yán)佩峰、曹國(guó)珍等[10-11]研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的某一菌液濃度范圍內(nèi)，細(xì)菌菌液的吸光度與菌液濃度呈正相關(guān)性。近年來(lái)，也有研究進(jìn)一步證實(shí)，可采用比濁法結(jié)合平板計(jì)數(shù)法得到菌液活菌數(shù)與OD600值的線性關(guān)系，進(jìn)而通過(guò)吸光度測(cè)定能夠快速獲得菌液活菌數(shù)[12-14]。本文以腌韭菜根中分離獲得的五種腐敗菌為研究對(duì)象，采用比濁法與平板計(jì)數(shù)法探究菌液活菌數(shù)與OD值之間的相關(guān)性，以期在腐敗菌的后期腐敗特性、生長(zhǎng)特性及防控等研究中為菌液活菌數(shù)的測(cè)定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與試劑

試驗(yàn)用的細(xì)菌菌種見(jiàn)表1。常用試劑見(jiàn)表2。

表1 供試菌種Tab.1 Test strains

表2 試驗(yàn)用試劑Tab.2 Reagents for the test

1.1.2 儀器與設(shè)備

FA2004型電子天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司；SW-CJ-2D型雙人凈化工作臺(tái)，上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司；ZWY-CZ11D型恒溫?fù)u床培養(yǎng)振蕩器，上海智誠(chéng)分析儀器有限公司；BGZ-246型電熱鼓風(fēng)干燥箱、SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LDZX-50kbs型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；BIO-BRI型酶標(biāo)儀，成都百樂(lè)科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液的制備

在無(wú)菌操作下，將4 ℃保藏的菌種，取2環(huán)接種到100 mL肉湯培養(yǎng)基中180 r/min、30 ℃恒溫培養(yǎng)15～18 h。用移液管依次取菌液5 mL、4 mL、3 mL、2 mL、1 mL分別置于編號(hào)為A、B、C、D、E的五個(gè)試管中，并用生理鹽水稀釋至10 mL，得到同株菌五個(gè)不同濃度梯度的菌懸液。

1.2.2 菌液活菌計(jì)數(shù)

參照GB 4789.2—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》標(biāo)準(zhǔn)中的菌落計(jì)數(shù)方法，測(cè)定腌韭菜根中各腐敗細(xì)菌菌液的活菌數(shù)[15]，以cfu/g表示。具體操作如下：將五個(gè)編號(hào)的離心管分別進(jìn)行1∶10倍梯度稀釋，分別吸取10-5、10-6、10-7稀釋度菌液1 mL涂布于無(wú)菌平皿內(nèi)，待干燥后倒置于(36±1)℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落總數(shù)測(cè)定。以滅菌生理鹽水作空白對(duì)照，平行實(shí)驗(yàn)三次。

1.2.3 菌液OD值測(cè)定

使用移液槍移取編號(hào) A、B、C、D、E五個(gè)離心管中的各菌懸液200 μL置于專用96孔板中，用酶標(biāo)儀在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值。因菌懸液存在一定的濁度，使得它對(duì)光有一定的吸收，故可在特定波長(zhǎng)下測(cè)量菌懸液的吸光度來(lái)體現(xiàn)細(xì)菌菌液的濃度[16]。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以菌液活菌數(shù)(cfu/mL)作為縱坐標(biāo)，菌液的OD600值作為橫坐標(biāo)，繪制各腐敗細(xì)菌的菌液活菌數(shù)與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel 2010進(jìn)行處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 B2菌液OD值與活菌數(shù)的相關(guān)性

B2不同稀釋菌液的OD600值、平板菌落數(shù)及菌落總數(shù)(活菌數(shù))結(jié)果如表3所示。由表3可知，B2各稀釋菌液的OD600均值在0.1003～0.3936，活菌數(shù)為6.1×107～13.8×107cfu/mL。

表3 B2各稀釋菌液的OD600值與活菌數(shù)Tab.3 OD600 value and number of live bacteria of eachdiluted B2 bacterial solution

以B2菌懸液的OD600值為橫坐標(biāo)，活菌數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制OD600值與活菌數(shù)的線性關(guān)系圖，如圖1。由圖1可知，B2菌懸液的OD600值與其活菌數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性方程為y=25.81x+3.25，R2=0.9842。

圖1 B2菌液活菌數(shù)與OD600相關(guān)性標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve of correlation between number of livebacteria and OD600 value of B2 bacterial solution

2.2 B5菌液吸光度與活菌數(shù)的相關(guān)性

B5不同稀釋菌液的OD600值、平板菌落數(shù)及菌落總數(shù)(活菌數(shù))結(jié)果如表4所示：B5各稀釋菌液的OD600均值在0.0734～0.3551，活菌數(shù)為3.4×107～8.5×107cfu/mL。

表4 B5各稀釋菌液的OD600值與活菌數(shù)Tab.4 OD600 value and number of live bacteria of eachdiluted B5 bacterial solution

B5菌液OD600值與活菌數(shù)的相關(guān)性標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。由圖2可知，線性方程為y=16.63x+2.64，R2=0.9357，表明B5菌懸液的OD600值與其活菌數(shù)線性關(guān)系良好。

圖2 B5菌液活菌數(shù)與吸光度相關(guān)性標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 Standard curve of correlation between number of livebacteria and OD600 value of B5 bacterial solution

2.3 B7菌液吸光度與活菌數(shù)的相關(guān)性

B7不同稀釋菌液的OD600值、平板菌落數(shù)及菌落總數(shù)(活菌數(shù))結(jié)果如表5所示：B7各稀釋菌液的OD600均值在0.0886～0.3911，活菌數(shù)為0.8×108～5.9×108cfu/mL。

表5 B7各稀釋菌液的OD600值與活菌數(shù)Tab.5 OD600 value and number of live bacteria of eachdiluted B7 bacterial solution

B7菌液OD600值與活菌數(shù)的相關(guān)性標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3。由圖3可知，線性方程為y=16.16x-0.0035，R2=0.9268，表明B7菌懸液的OD600值與其活菌數(shù)線性關(guān)系良好。

圖3 B7菌活菌數(shù)與吸光度相關(guān)性標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.3 Standard curve of correlation between number of livebacteria and OD600 value of B7 bacterial solution

2.4 B8菌液吸光度與活菌數(shù)的相關(guān)性

B8不同稀釋菌液的OD600值、平板菌落數(shù)及菌落總數(shù)(活菌數(shù))結(jié)果如表6所示： B8各稀釋菌液的OD600均值在0.1067～0.6489，活菌數(shù)為1.1×106～4.9×106cfu/mL。

表6 B8各稀釋菌液的OD600值與活菌數(shù)Tab.6 OD600 value and number of live bacteria of eachdiluted B8 bacterial solution

以菌懸液的OD600值為X軸，活菌數(shù)為Y軸，繪制B8菌液OD600值與活菌數(shù)的相關(guān)性標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖4。從圖4不難發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=7.25x+0.30，R2=0.9926，表明B8菌液OD600值與活菌數(shù)的線性關(guān)系良好。

圖4 B8菌液活菌數(shù)與吸光度相關(guān)性標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.4 Standard curve of correlation between number of livebacteria and OD600 value of B8 bacterial solution

2.5 B11菌液吸光度與活菌數(shù)的相關(guān)性

B11不同稀釋菌液的OD600值、平板菌落數(shù)及菌落總數(shù)(活菌數(shù))結(jié)果如表7所示： B11各稀釋菌液的OD600均值在0.0673～0.3551，活菌數(shù)為3.1×107～15.1×107cfu/mL。

表7 B11各稀釋菌液的OD600值與活菌數(shù)Tab.6 OD600 value and number of live bacteria of eachdiluted B11 bacterial solution

B11菌液OD600值與活菌數(shù)的相關(guān)性標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5。由圖5可知，線性方程為：y=40.31x+0.83，R2=0.9890，表明B11菌懸液的OD600值與其活菌數(shù)線性關(guān)系良好。

圖5 B11菌液活菌數(shù)與吸光度相關(guān)性標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.5 Standard curve of correlation between number of livebacteria and OD600 value of B11 bacterial solution

3 結(jié)論與討論

相同條件下培養(yǎng)供試菌(土揚(yáng)芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、萵苣不動(dòng)桿菌、解淀粉芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌)特定時(shí)間，并依次按0.5、0.4、0.3、0.2、0.1的梯度對(duì)各供試菌菌懸液進(jìn)行稀釋，得到其OD600值的范圍分別為：0.1003～0.3936、0.0734～0.3551、0.0886～0.3911、0.1067～0.6489和0.0673～0.3551；活菌總數(shù)范圍為：6.1×107～13.8×107cfu/mL、3.4×107～8.5×107cfu/mL、0.8×108～5.9×108cfu/mL、1.1×106～4.9×106cfu/mL和3.1×107～15.1×107cfu/mL。對(duì)比不難發(fā)現(xiàn)，不同的菌種由于生長(zhǎng)速度不同，其菌液濃度(吸光度及活菌總數(shù))有很大的區(qū)別。

林靜等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)，菌液的吸光度與其活菌數(shù)成良好的線性關(guān)系，根據(jù)其線性方程測(cè)得吸光度就可得出相應(yīng)菌液的活菌數(shù)，且計(jì)算所獲得的活菌數(shù)的準(zhǔn)確度越高，線性方程相關(guān)性系數(shù)(R2)需越接近1。本文進(jìn)一步研究腌韭菜根中的5種供試菌菌液的OD600值與活菌數(shù)的相關(guān)性，得到其線性方程及相關(guān)性系數(shù)為：土揚(yáng)芽孢桿菌：y=25.81x+3.25，R2=0.9842；巨大芽孢桿菌y=16.63x+2.64，R2=0.9357；萵苣不動(dòng)桿菌y=16.16x-0.0035，R2=0.9268；解淀粉芽孢桿菌：y=7.25x+0.30，R2=0.9926；蠟樣芽孢桿菌y=40.31x+0.83，R2=0.9890。該研究對(duì)腌韭菜根中的腐敗菌的深入研究以及菌液濃度的快速測(cè)定具有十分重要的意義。